Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

Das übergeordnete Ziel des Experiments ist es, den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance aus astrozytären Membranen nach der Freisetzung aus exzitatorischen Synapsen abzuschätzen. Der erste Schritt in diesem Prozess besteht darin, das Auftreten des synaptisch aktivierten Glutamattransports von Astrozyten in akuten Hirnschnitten in Abwesenheit und Anwesenheit einer subsättiellen Konzentration des Breitband-Glutamattransporter-Antagonisten TBOA zu erfassen. Der zweite Schritt besteht darin, die Aufzeichnungen zu analysieren, um die synaptisch aktivierten Glutamat-Transporterströme von allen anderen Komponenten der evozierten Reaktion zu isolieren.

Als nächstes wird der Zeitverlauf des Filters geschätzt, indem die in Gegenwart von TBOA aufgezeichneten Transporterströme analysiert werden, indem der Filter aus dem unter kontrollierten Bedingungen aufgezeichneten Transportereignis einbezogen wird. Es wird der zeitliche Verlauf der Glutamat-Clearance aus astrozytären Membranen ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass Astrozyten im Hippocampus der Maus nur wenige Millisekunden benötigen, um synaptisch freigesetztes Glutamat aus der extrazellulären Raumbasis zu entfernen.

Dieser Ansatz bietet ein sensitives Instrument, um Veränderungen der astrozytären Aufnahmekapazität in verschiedenen Gehirnregionen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erkennen. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber anderen Methoden, die beispielsweise auf der Displacement-Analyse von schnell dissoziierenden Glutamatrezeptor-Antagonisten auf fluoreszierenden Glutamat-Indikatoren oder auf Computersimulationen von Diffusionsreaktionen basieren, besteht darin, dass er eine hohe zeitliche, direkte experimentelle Auslesung der Glutamat-Clearance aus Astrozyten ermöglicht. Diese Methode ermöglicht es uns, die räumliche und zeitliche Dynamik der synaptischen Übertragung im Gehirn zu verstehen.

Es kann uns helfen, pathophysiologische Veränderungen des Glutamats, der Diffusion und der Aufnahme zu interpretieren, die bei bestimmten neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit auftreten können. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie mit einem Skalpell fünf Schnitte an einem sezierten Mäusegehirn machen. Entfernen Sie zunächst die Riechkolben und den frontalen Kortex.

Zweitens, entfernen Sie das Kleinhirn. Entfernen Sie als Nächstes den linken und rechten Schläfenlappen. Trennen Sie dann die beiden Gehirnhälften mit einem sagittalen Schnitt.

Als nächstes kleben Sie die Seitenfläche jedes Gehirnabschnitts auf die kalte Vibram-Grundplatte. Die dorsale Seite des Gehirns sollte der Vibram-Klinge zugewandt sein und die ventrale Seite des Gehirns sollte in Kontakt mit dem Agarblock sein, weg von der Vibrato-Klinge. Befestigen Sie dann die Vibrato-Grundplatte an der Präparierkammer.

Stellen Sie die Scheibendicke auf 250 Mikrometer ein und passen Sie die Breite der Klinge vor dem Schneiden an. Sobald die Klinge durch den Kortex und den Hippocampus gedrungen ist, schneiden Sie mit einem Skalpell den Hippocampus des Kortex aus dem Mittelhirn ab. Legen Sie anschließend eine Scheibe bei 34 Grad Celsius in die Tauchkammer, nachdem Sie die Scheiben 30 Minuten lang bei 34 Grad Celsius gehalten haben.

Lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie für die elektrophysiologischen Aufzeichnungen verwenden. Bei diesem Verfahren wird eine Scheibe in die Aufnahmekammer übertragen. Überprüfen Sie die Scheibe visuell unter der Punktbeleuchtung oder I-R-D-I-C. Astrozyten können an ihrem kleinen Zellkörper und ihrem markanten Zellkern für die synaptische Stimulation identifiziert werden.

Platzieren Sie eine bipolare Elektrode aus Edelstahl etwa 100 Mikrometer von dem Astrozyten entfernt, den Sie patchen möchten. Flicken Sie den Astrozyten und brechen Sie die gesamte Zellkonfiguration durch einen sehr sanften Sog auf. Wechseln Sie dann alle 10 bis 20 Sekunden einzelne und gepaarte Stimuli ab, um die erleichterten Teile des synaptisch aktivierten Transportgeschehens zu isolieren.

Erster Durchschnitt mindestens 20 Sweeps, die mit gepaarten Stimulationen unter kontrollierten Bedingungen und in Gegenwart von 10 mikromolaren Breitspektrum-Glutamattransporter-Antagonisten erhalten wurden. TBOA mittelt dann eine identische Anzahl von Sweeps, die mit einzelnen Stimulationen unter Kontrollbedingungen erhalten werden, und subtrahiert bei 10 mikromolaren TBOA die durchschnittliche Spur, die mit einzelnen Stimulationen erhalten wird, von der durchschnittlichen Spur, die mit gepaarten Stimulationen erhalten wird. Dieser Schritt ermöglicht die Isolierung des geometrischen STO-Systems und des anhaltenden Kaliumstroms, der durch den zweiten Stimulus hervorgerufen wird.

Bei der nächsten Verschiebung subtrahiert die durchschnittliche Kurve, die mit einzelnen Stimulationen durch ein Zeitintervall erhalten wird, das mit dem PUL-Intervall übereinstimmt, das zur Abgabe gepaarter Impulse verwendet wird, die zeitversetzte, durchschnittliche Reaktion, die mit einzelnen Stimulationen erhalten wurde, von der durchschnittlichen Reaktion auf den zweiten Stimulus, der zuvor erhalten wurde. Dieser Schritt isoliert einen erleichterten Teil des Transporterstroms, der durch den zweiten Stimulus hervorgerufen wird. In den meisten Fällen wird durch diesen Schritt der anhaltende Kaliumstrom vollständig entfernt.

Wenn dies der Fall ist, ist die Isolierung des FSTC abgeschlossen und Sie können mit der Dekonvolutionsanalyse fortfahren und den Zeitverlauf der Glutamat-Clearance aus den Astrozyten ermitteln. In einigen Fällen ist jedoch immer noch ein kleiner anhaltender Kaliumstrom vorhanden, und eine weitere Analyse ist erforderlich. Messen Sie die Amplitude des anhaltenden Kaliumstroms, der nach der Durchführung verbleibt.

Bei der zuvor beschriebenen Analyse wurde die Amplitude der monoexponentiellen Funktion auf die Amplitude des verbleibenden anhaltenden Kaliumstroms skaliert, indem die Amplitude des gemessenen anhaltenden Kaliumstroms als in dieser Gleichung festgelegt wurde. Die Anstiegszeitkonstante stellt jedoch den Durchschnittswert des Anstiegs dar, der in separaten Experimenten geschätzt wurde, in denen ein anhaltender Kaliumstrom isoliert wird. Pharmakologisch unter Verwendung einer hohen Sättigungskonzentration von TBOA subtrahieren Sie dann die resultierende monoexponentielle Funktion vom FSTC und dem anhaltenden Kaliumstrom.

Um die Isolierung des FSTC. Um das Flash-aktivierte Transportereignis zu isolieren. Im Durchschnitt werden mindestens 20 Sweeps mit offenem Strahlengang unter Kontrollbedingungen und bei 10 mikromolaren TBOA erhalten, dann wird die gleiche Anzahl von Sweeps gemittelt, die bei geschlossenem Strahlengang unter Kontrollbedingungen erhalten wurden, und bei 10 mikromolaren TBOA subtrahiert man die durchschnittliche Kurve, die mit blockiertem Strahlengang erhalten wurde, von der durchschnittlichen Leiterbahn, die mit offenem Strahlengang erhalten wurde.

Dieser Schritt ermöglicht es, das Stimulusartefakt zu entfernen und die FTCs zu isolieren. In diesem Schritt passt man den Transportstrom entweder FSTC oder FTC an, der unter Kontrollbedingungen und in 10 mikromolaren TBOA aufgezeichnet wurde, und passt sie mit einer multiexponentiellen Funktion an, erzeugt eine augenblicklich ansteigende Funktion, die monoexponentiell gemäß dieser Funktion zerfällt und die Zerfallsphase des Transporterstroms bei 10 mikromolaren TBOA am besten beschreibt. Als nächstes wird die monoexponentielle Funktion aus der Passung des Transporterstroms, der in 10 mikromolaren TBOA aufgezeichnet wurde, abgeleitet, um den Filter abzuleiten. Schalten Sie dann den Filter unter kontrollierten Bedingungen aus der Passung des Transporterstroms aus.

Um eine quantitative Schätzung des Gesamtzeitverlaufs der Glutamat-Clearance zu erhalten, berechnen Sie die OID der Wellenform, während Sie dieses Verfahren versuchen. Es ist wichtig zu bestätigen, dass das Transportereignis unter experimentellen Bedingungen aufgezeichnet wird, bei denen der Filter in einem linearen Regime arbeitet und nur lineare Verzerrungen des Transports einführt. Die Stromwelle von diesen kann durch Überprüfen der Manipulationen erfolgen, die die Größe des Transportstroms ändern.

Ändern Sie nicht den Stempelkurs. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie astrozytäre Aufzeichnungen verwenden können, um Informationen über Glutamat, Diffusion und Aufnahme im Gehirn zu extrahieren.