Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

Das übergeordnete Ziel des Experiments besteht darin, den zeitlichen Verlauf der Glutamataufnahme an astrogliären Membranen nach dessen Freisetzung aus erregenden Synapsen zu bestimmen. Der erste Schritt dieses Vorgangs ist die Aufzeichnung synaptisch ausgelöster Glutamattransportvorgänge aus Astrozyten in akuten Hirnschnitten in Abwesenheit und Gegenwart einer unter-sättigenden Konzentration des Breitband-Glutamattransporter-Antagonisten TBOA. Der zweite Schritt besteht darin, die Aufzeichnungen zu analysieren, um die synaptisch aktivierten Glutamattransporterströme von allen anderen Komponenten der evozierten Antwort zu isolieren.

Anschließend wird der Zeitverlauf der Filterung geschätzt, indem die in Gegenwart von TBOA aufgezeichneten Transportstromstärken durch Entfaltung des Filters aus den unter kontrollierten Bedingungen erfassten Transportvorgängen analysiert werden. So erhält man den Zeitverlauf der Glutamat-Entfernung von den astrogliären Membranen. Die Ergebnisse zeigen, dass Astrozyten im Maushippocampus nur wenige Millisekunden benötigen, um synaptisch freigesetztes Glutamat aus dem extrazellulären Raum zu entfernen.

Dieser Ansatz stellt ein empfindliches Werkzeug zur Detektion von Veränderungen der astrogialen Aufnahmekapazität in verschiedenen Hirnregionen während physiologischer und pathologischer Zustände dar. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber anderen Methoden, die beispielsweise auf der Displacementsanalyse schnell dissoziierender Glutamatrezeptorantagonisten an fluoreszierenden Glutamatindikatoren oder auf Computersimulationen von Diffusionsreaktionen beruhen, liegt darin, dass er eine hohe zeitliche Auflösung bietet und einen direkten experimentellen Nachweis des Glutamat-Abbaus durch Astrozyten ermöglicht. Diese Methode erlaubt es uns, die räumlichen und zeitlichen Dynamiken der synaptischen Transmission im Gehirn zu verstehen.

Es kann uns helfen, pathophysiologische Veränderungen in Glutamat, Diffusion und Aufnahme zu interpretieren, die bei bestimmten neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer auftreten können. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit einem Skalpell fünf Schnitte an einem präparierten Maushirn anbringen. Entfernen Sie zuerst die Riechkolben und die frontale Hirnrinde.

Zweitens entfernen Sie das Kleinhirn. Danach entfernen Sie die linken und rechten Schläfenlappen. Anschließend trennen Sie die beiden Gehirnhälften durch einen mittelsagittalen Schnitt.

Als Nächstes kleben Sie die Seitenfläche jedes Gehirnschnitts auf die kalte Basisplatte des Vibroms. Die dorsale Seite des Gehirns sollte dabei zur Klinge des Vibroms weisen, während die ventrale Seite des Gehirns mit dem Agarblock in Kontakt steht, der sich abseits der Vibromklinge befindet. Danach befestigen Sie die Vibrom-Basisplatte am Präparationskammer.

Stellen Sie die Schnittdicke auf 250 Mikrometer ein und passen Sie die Breite der Klinge vor dem Schneiden an. Sobald die Klinge durch den Cortex und das Hippocampus hindurchgegangen ist, schneiden Sie den Cortex Hippocampus mit einem Skalpell vom Mittelhirn ab. Anschließend bringen Sie einen Schnitt in die Tauchkammer bei 34 Grad Celsius, nachdem Sie die Schnitte 30 Minuten lang bei 34 Grad Celsius gehalten haben.

Lassen Sie sie vor der Verwendung für die Elektrophysiologie-Aufzeichnungen in diesem Verfahren 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, überführen Sie eine Schnittpräparation in die Ableitungskammer. Untersuchen Sie die Schnittpräparation visuell unter Punktbeleuchtung oder I-R-D-I-C. Astrozyten können anhand ihres kleinen Zellkörpers und ihres ausgeprägten Zellkerns zur synaptischen Stimulation identifiziert werden.

Platzieren Sie eine bipolare Edelstahlelektrode etwa 100 Mikrometer entfernt von dem Astrozyten, den Sie abdichten möchten. Dichten Sie den Astrozyten ab und gelangen Sie durch Anlegen eines sehr leichten Saugdrucks in die Ganzzell-Konfiguration. Wechseln Sie dann alle 10 bis 20 Sekunden zwischen einzelnen und gepaarten Reizen, um die facilitierten Anteile der synaptisch aktivierten Transportereignisse zu isolieren.

Erstellen Sie zunächst einen Mittelwert aus mindestens 20 Aufnahmen, die unter kontrollierten Bedingungen und in Gegenwart von 10 Mikromolar des breitspektrigen Glutamat-Transporter-Antagonisten TBOA mit gepaarten Reizungen erhalten wurden. Mitteln Sie anschließend eine identische Anzahl von Aufnahmen, die mit Einzelreizungen unter Kontrollbedingungen und in 10 Mikromolar TBOA aufgezeichnet wurden. Subtrahieren Sie die mittlere Spur, die mit Einzelreizungen erhalten wurde, von der mittleren Spur, die mit gepaarten Reizungen erhalten wurde. Dieser Schritt ermöglicht es, den STO-geometrischen und den anhaltenden Kaliumstrom, der durch den zweiten Reiz hervorgerufen wird, zu isolieren.

Im nächsten Schritt wird die durchschnittliche Spur, die mit Einzelstimulationen bei einem Zeitintervall erhalten wurde, das dem PUL-Intervall entspricht, das zur Applikation gepaarter Pulse verwendet wurde, von der zuvor erhaltenen durchschnittlichen Antwort auf den zweiten Reiz subtrahiert, nachdem die zeitlich verschobene, durchschnittliche Antwort der Einzelstimulationen abgezogen wurde. Dieser Schritt isoliert einen potenzierten Anteil des Transportstroms, der durch den zweiten Reiz hervorgerufen wird. In den meisten Fällen entfernt dieser Schritt den anhaltenden Kaliumstrom vollständig.

Wenn dies der Fall ist, ist die Isolierung des FSTC abgeschlossen, und Sie können mit der Dekonvolutionsanalyse fortfahren und den Zeitverlauf des Glutamat-Abbaus aus Astrozyten ermitteln. In einigen Fällen ist jedoch noch ein kleiner anhaltender Kaliumstrom vorhanden, und es ist eine weitere Analyse erforderlich. Messen Sie die Amplitude des verbleibenden anhaltenden Kaliumstroms nach der Durchführung.

Die zuvor beschriebene Analyse skaliert die Amplitude der monoexponentiellen Funktion an die Amplitude des verbleibenden anhaltenden Kaliumstroms, indem die Amplitude des gemessenen anhaltenden Kaliumstroms in dieser Gleichung als a festgelegt wird. Die Anstiegszeitkonstante stellt jedoch den Mittelwert des Anstiegs dar, der in separaten Experimenten geschätzt wurde, in denen ein anhaltender Kaliumstrom isoliert wurde. Pharmakologisch wird eine hohe, sättigende Konzentration von TBOA verwendet, anschließend wird die resultierende monoexponentielle Funktion von der FSTC und dem anhaltenden Kaliumstrom subtrahiert.

Um die Isolierung des FSTC abzuschließen. Um das durch Licht aktivierbare Transportereignis zu isolieren. Mitteln Sie mindestens 20 Aufzeichnungen, die unter Kontrollbedingungen und in 10 Mikromolar TBOA bei geöffnetem Lichtpfad erhalten wurden, sowie die gleiche Anzahl an Aufzeichnungen, die unter Kontrollbedingungen und in 10 Mikromolar TBOA bei geschlossenem Lichtpfad aufgezeichnet wurden; subtrahieren Sie anschließend die mittlere Spur, die bei blockiertem Lichtpfad erhalten wurde, von der mittleren Spur, die bei offenem Lichtpfad erhalten wurde.

Dieser Schritt ermöglicht es, den Stimulationsartefakt zu entfernen und die FTCs zu isolieren. In diesem Schritt werden der Transportstrom, entweder FSTC oder FTC, unter Kontrollbedingungen sowie in 10 Mikromolar TBOA angepasst und mit einer multiexponentiellen Funktion gefittet. Erstellen Sie eine sofort ansteigende Funktion, die gemäß dieser Funktion monoexponentiell abklingt und die Abklingphase des Transportstroms, der in 10 Mikromolar TBOA aufgezeichnet wurde, am besten beschreibt. Ziehen Sie anschließend die monoexponentielle Funktion vom Fit des in 10 Mikromolar TBOA aufgezeichneten Transportstroms ab, um den Filter zu erhalten. Danach wenden Sie den Filter auf den Fit des Transportstroms unter Kontrollbedingungen an.

Um eine quantitative Abschätzung des gesamten zeitlichen Verlaufs der Glutamatbeseitigung zu erhalten, berechnen Sie die OID der Wellenform, während Sie dieses Verfahren durchführen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Transportereignisse unter experimentellen Bedingungen aufgezeichnet werden, bei denen der Filter im linearen Bereich arbeitet und nur lineare Verzerrungen des Transports verursacht. Die Stromwellenform hieraus kann überprüft werden, indem Manipulationen vorgenommen werden, die die Größe des Transportstroms verändern.

Ändern Sie nicht seinen Stempelkurs. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man astrozytäre Ableitungen nutzt, um Informationen über Glutamat, Diffusion und Aufnahme im Gehirn zu gewinnen.