Name: Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Lernen Sie die Implementierung eines TX-TL-Zellfreien Expressionssystems basierend auf Escherichia coli für die Synthetische Biologie. Diese Methode ermöglicht schnelle Proteinexpression und Schaltkreistests in vitro.

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Wir danken Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere und Enoch Yeung für die Unterstützung Straffung des Protokolls und Clare Chen und Lee Barclay für die Unterstützung in den frühen Phasen des Projekts. Dieses Material wird auf der Arbeit zum Teil von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) unterstützt Gießereien Wohnprogramm, Vertragsnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS wird auch durch ein UCLA / Caltech Medical Scientist unterstützt auf Basis Training Program Kameradschaft und durch eine DoD, Air Force Office of Scientific Research, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. Die in diesem Dokument enthaltenen Ansichten und Rückschlüsse sind die der Autoren und sollte nicht als Darstellung interpretiert werden offiziell Politik, weder ausdrücklich noch stillschweigend, von der Defense Advanced Research Projects Agency oder der US-Regierung.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die endogene Escherichia coli basierten hier beschriebenen TX-TL zellfreien Expressionssystem ist ein einfach-to-run drei U-Reaktion, die weniger als acht Stunden von bis zu Sammeln von Daten erfolgen kann. Der Prozess der Erstellung alle Reagenzien erfordert fünf Tage Zeit insgesamt (mit erheblichen Arbeitsaufwand nur an einem Tag), produziert aber Rohextrakt für 3000 Reaktionen und Pufferherstellung Reagenzien für 10.000 Reaktionen (Abbildung 1). Außerdem Rohextrakt und Pufferherstellung Reagenzien sind bei -80 ° C für mindestens 1 Jahr stabil, so dass für Mehrfachnutzung einer Zubereitung 4 Bei $ 0,11 pro 10 ul-Reaktion ($ 0,26 einschließlich Arbeits). Sind die Kosten 98% niedriger als bei vergleichbaren Kommerzielle Systeme (Abbildung 2). Es gibt einige ungelöste Einschränkungen, jedoch zu dem System. Das Ende Effizienz jedes Zellrohextrakt Vorbereitung kann auf der Basis der Anwenderkenntnisse und den Umgebungsbedingungen variieren, obwohl typische Ertragsabweichung zwischen 5-10% (Abbildung 4b). Als Ergebnis sind Batch-zu-Batch-Variabilität im Endpunkt-Expression und der Expression Dynamik zu erwarten. Diese Schwankungen werden wahrscheinlich bleiben, bis Extrakt wird vollständig charakterisiert oder bis Extrakt Schöpfung ist voll automatisiert. Wenn der zellfreien Expressionssystem wird verwendet, um empfindliche quantitative Experimente durchzuführen, ist es ratsam, alle Experimente mit der gleichen Charge von Zellrohextrakt laufen. Die Ausbeute aus einer Zellrohextrakt Charge, etwa 3000 Reaktionen, sollte für typische experimentelle Kurse sein. Obwohl wir vermuten Variation kann durch die Skalierung und die Automatisierung der Verfahren entfernt werden, würden solche Versuche eine wesentliche Ressource Investitionen. Zusätzlich, obwohl Endpunkt Expressionsspiegel sind relativ einfach zu bestimmen, muss mehr Arbeit zu verstehen Dynamik intrinsische zum zellfreien System durchgeführt werden. Es ist bekannt, dass sowohl Ressourcen-WETTBEWERBn-und Ressourcenbegrenzung kann Ausdruck Dynamik beeinflussen. Zum Beispiel können begrenzte endogenen Sigma-70 in einem Sättigungsregime mit erhöhter DNA-Matrize Herstellung eines Expressionsprofil analog zu der Nukleotid-oder Aminosäureabbau führen. 9,27 jedoch Dynamik müssen nicht vollständig verstanden, das System zu nutzen. Für reine Ertragssteigerungen kann die Optimierung von Maschine-Learning-Ansätze durchgeführt werden. 28. Fragen der Ressourcen Wettbewerb und Einschränkung kann durch mathematische Modelle angesprochen werden mit experimentellen Daten verifiziert. Die hier vorgestellten Protokoll für ein BL21-Stamm Rosetta2 optimiert, aber ist verallgemeinerbar zu anderen E. coli-Stämme. Änderungen in BL21-Rosetta2, wie die Entfernung des Gens lon-Protease und die Zugabe von Genen seltenen tRNAs kodieren, ermöglichen maximale Proteinproduktion. BL21 und BL21 nur trxA Knockout-an - Wir haben das Protokoll mit zwei anderen Stämmen versucht Extraktd gefunden 50% weniger Proteinausbeute. Wir vermuten, dass die Renditen ähnlich, wenn andere Stämme zu verringern. Weitere Änderungen in den Parametern, wie z. B. Schalt 2xYT Wachstumsmedium für LB und andere reiche Brühen, haben zu einer verminderten Proteinausbeute führte. Zellfreie Expression Systeme, die sowohl endogene als auch exogene Transkriptions-Translations-Maschinen und Regulationsmechanismen haben breite Anwendungen in der Protein-und Metabolit-Expression und in der synthetischen Biologie. 3,29 Anstatt auf T7-regulierten Stromkreise beschränkt, kann man sich vorstellen Herstellung von komplexen Biomolekülen in einer vom Benutzer steuerbare Einstellung mit einer Mischung aus nativen E. coli-Promotoren und exogen zugeführtem Transkriptions-und Regulationsmechanismen. Ohne Einschränkungen der Zellteilung und den Stoffwechsel, können Schwankungen in der synthetischen Schaltungen wie der repressilator oder in Stoffwechselwege entwickelt, wie solche Herstellung von Artemisinin reduziert oder besser verstanden. 30,31 Wir have verwendet, diese Vorteile zu genetischen Schalter zu implementieren, sowie Sigma-Faktor-Sequestrierung versteht 9,32 Diese Technologie kann auch das Rückgrat der &quot;minimal&quot; oder &quot;künstliche&quot; Zellen bilden -. kleinen, gut gekennzeichnet und autark verkörperten Einheiten Extrakt. 33,34 Letztendlich erwarten wir sofort Nutzungen dieser endogenen zellfreie Expressionssystem als Prototyping-Umgebung für synthetische Biologie. Den Spitznamen &quot;TX-TL biomolekularen Steckbrett&quot;, das zellfreie Expressionssystem bietet eine Umgebung, in der steuerbaren Kunstkreise letztlich für die in vivo-Expression kann bestimmt Runden Prototyping unterziehen - Testzyklen auf Basisplasmid, linear, oder chemisch synthetisierte DNA, gefolgt durch Analyse und schnelle Änderung. Prototyping Runden kann durch mathematische Vorhersagemodelle entwickelt derzeit unterstützt werden. Durch das Entfernen von Klonen und in vivo-Manipulation für nicht-finale Kreise erwarten wir Ingenieuretechnik Zykluszeiten auf 1-3 Tage statt der aktuellen Wochen-Standard reduziert werden.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Zellfreie Expression Technologie begann in den 1950er Jahren als rein translatorische, voran Jahre später gekoppelten Transkriptions-Translationsmechanismen umfassen unter Verwendung von T7 Bakteriophagen-DNA. 11,12 Seitdem wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen worden, um die Erstellung von rohen Zellextrakt (oder E optimieren . coli S30-Extrakt). 13,14 Diese Optimierungen umfassen Verlängerung zellfreien Proteinsynthese durch ATP-Regeneration oder Belastung Modifikationen und Protokoll reduziert Zeit und Kosten. 15-17 Alternative zellfreie Expressionssysteme existieren, die Verwendung wiederhergestellten Komponenten anstelle von Rohöl Zellextrakt zur Expression. 5 Sowohl Zellrohextrakt und Rekonstitution Methoden für den kommerziellen Einsatz entwickelt worden. Mit dem Aufkommen der synthetischen Biologie, gibt es einen erhöhten Bedarf für eine gut charakterisierte Plattform zu testen und Express entwickelt biologische Module und Schaltungen. 18,19 Diese Plattform mussvielseitig, gut charakterisiert, einfach zu manipulieren und auf Benutzer gelieferten Komponenten konzentriert. Obwohl er ein halbes Jahrhundert früher entwickelt, die zellfreie Systeme auf E. coli eigen teilen diese Anforderungen, da sie eine vereinfachte Darstellung der in-vitro-zelluläre Prozesse, ohne die Komplexität des Wachstums und des Stoffwechsels sind. Zusätzlich werden alle der grundlegenden Kenntnisse aus in vivo-Arbeit an E. coli gilt ohne weiteres auf E. coli zellfreien Systemen. Obwohl zellfreien Expressionssystemen können Anwendungen in der synthetischen Biologie haben, um das Ziel der meisten zellfreie Expressionssysteme datieren ist die Maximierung der Protein-und Metabolit-Ausbeute. Dies wird durch Verwendung von T7-Bakteriophagen Transkription von Sequenzen durch T7-Promotoren gesteuert durchgeführt. 20. Obwohl die Expression ist effizient und robust, diese Systeme dienen einem hoch spezialisierten Zweck. Zellregulation Methoden sind begrenzt, muss Ziel-DNA-Vorlagen seinüberarbeitet, um T7-Promotoren sind, und bestimmte Sequenzen, wie ribosomale Komplexe können nicht transkribiert und zusammengebaut werden. 21,22 Bestehende zellfreie Expressionssysteme sind nicht in der Lage, hohe Ausbeuten zu erhalten, während die Erhaltung endogenen Regulationsmechanismen, eine Vielseitigkeit für synthetische Biologie erforderlich. Wir haben eine endogene E. entwickelt coli zellfreien Expressionssystem, das die Effizienz der Proteinexpression von früheren Systemen nachgewiesen bewahrt aber fügt zusätzliche Vielseitigkeit, indem es die Expression und Regulation der Grundlage von sowohl endogenen als auch exogenen (T7 oder andere) Mechanismen. Das hier beschriebene Protokoll wird ursprünglich auf Kigawa et al. (2004) und Liu et al. (2005), hat aber wesentliche Änderungen. Es nutzt Mg-und K-Glutamat über Mg-und K-Acetat für mehr Effizienz, entfernt 2-Mercaptoethanol und lysiert Zellen mit einer Wulst-Beater. 17,23,24 Bead-Schläge über Homogenisierung gewählt,druckbasierten Verfahren oder Ultraschallbehandlung aufgrund ihrer geringeren Kosten und vergleichbaren Ausbeuten zu Konkurrenzsystemen. wird 23 3-Phosphoglycerinsäure (3-PGA) als Energiequelle verwendet, da festgestellt wurde, verglichen mit Kreatinphosphat überlegenen Ausbeuten und Protein Phosphoenolpyruvat. 4,25 Unser System kann bis zu 0,75 mg / ml Reporterprotein zu produzieren entweder mit einem sigma70 basierte Promotor mit Lambda-Phagen-Betreiber oder einen T7-Promotor angetrieben, ähnlich wie die Erträge aus anderen kommerziellen Systemen. 4,6 Fünf Tage sind erforderlich, um alle notwendigen Reagenzien (Abbildung 1) zu produzieren. Darüber hinaus bietet es eine 98% Kostenersparnis gegenüber vergleichbaren kommerziellen zellfreien Systemen - Materialkosten sind $ 0,11 pro 10 ul-Reaktion, die auf $ 0,26 mit der Arbeit enthalten (Abbildung 2) steigt.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP Biomedizin</td><td>3012-032</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostik</td><td>214010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bead-Beat-Röhrchen (Mikrofläschchen aus Polypropylen)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Perlen, Ø 0,1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli Stamm</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Küvetten, 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DVB-T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Folinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro-Bio-Spin-Chromatographie-Säulen</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 384-Well-Bodenplatten</td><td>Thermo-Scientific</td><td>142761</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Dichtband</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasische Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasische Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysekassetten, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tRNA (aus E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1L Zentrifugenflasche</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A98813</td><td>Dies ist spezifisch für die Avanti J-Serie. Erhalten Sie die gleiche Größe für die verwendete Zentrifuge.</td></tr><tr><td>4L Erlenmeyerkolben</td><td>Kimble Chase</td><td>26500-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP Zentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>Oder 1L-fähiges Zentrifugenäquivalent.</td></tr><tr><td>Forma 480 Orbitalschüttler</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>Oder 6x4L Schüttler in Brustgröße.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>Or 1L-fähig, 5000 x g Rotoräquivalent für Zentrifuge.</td></tr><tr><td>Mini-Schläger-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Ergänzendes Material 1. Rezepte für Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Bereiten Sie 0,51 g Chloramphenicol vor und fügen Sie Ethanol zu 15 ml hinzu. Filter sterilisieren (0,22 &mu; M), aliquot auf 1 ml Röhrchen, lagern bei -20 &de; C für die spätere Verwendung. 
2xYT+P+Cm Agarplatte: Bereiten Sie 1,24 g 2xYT, 1,6 ml zweibasische Kaliumphosphatlösung @ 1 M, 0,88 ml monobasische Kaliumphosphatlösung @ 1 M, 0,6 g Agar und Wasser auf 40 ml vor. Autoklav. Auf 50 Grad abkühlen lassen; C und addieren Sie 40 &mu; l Cm. Aliquot 25 ml in eine Petrischale von 100x15 mm geben und eine Stunde abkühlen lassen 
2xYT+P Medien: 124 g 2xYT, 160 ml zweibasische Kaliumphosphatlösung @ 1 M, 88 ml monobasische Kaliumphosphatlösung @ 1 M und Wasser auf 4 l vorbereiten. Aliquotieren in 2 x 1,88 l und 0,24 l. Autoklav. 
Tris base, 2 M: 60,57 g Tris base zubereiten und auf 250 ml gießen. Sterilisieren, zur späteren Verwendung bei RT lagern. 
DTT, 1 M: 2,31 g DTT und Wasser auf 15 ml auffüllen. Filter sterilisieren (0,22 &mu; M), aliquot auf 1 ml Röhrchen, lagern bei -20 &de; C für die spätere Verwendung. 
S30A Puffer: 10,88 g Mg-Glutamat und 24,39 g K-Glutamat, 50 ml Tris bei 2 M, Essigsäure (bis pH 7,7) und Wasser auf 2 L. Autoklav, lagern bei 4 μV; C, vor Gebrauch 4 ml 1 M DVB-T zugeben. 
S30B Puffer: 10,88 g Mg-Glutamat und 24,39 g K-Glutamat, Tris bei 2 M (bis pH 8,2) und Wasser auf 2 L. Autoklav, lagern bei 4 μg; C, vor Gebrauch 2 ml 1 M DVB-T zugeben. 
HEPES: Bereiten Sie 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (bis pH 8) und Wasser auf 4 ml. 
tRNA: Bereiten Sie 30 mg tRNA und Wasser auf 600 μl. 
CoA: Bereiten Sie 30 mg CoA (MW 767,53) und Wasser auf 600 μm < w/>
NAD: 34,83 mg NAD (MW 663,43), Tris bei 2 m (bis pH 7,5-8) und Wasser auf 300 μl. (27 μm; l Tris bei 2 m erhitzen, um die Lösung auf einen pH-Wert von 7,5-8 zu bringen). 
cAMP: 42,80 mg cAMP (MW 329,22), Tris bei 2 m (bis pH 8) und Wasser auf 200 μl. (73 μm; l Tris bei 2 M, um die Lösung auf pH 8 zu bringen). 
Folinsäure (33,9 mM): Zu 20 mg festem Folinsäure-Calciumsalz (MW 511,5) 1,15 ml Wasser hinzufügen. 
Spermidin: Vorbereiten 23.55 &mu; l Spermidin (MW 145,25) und Wasser auf 150 μl. Nach kurzem Schmelzen bei 37 °C / bei Raumtemperatur zubereiten
3-PGA: 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), Tris in 2 m (bis pH 7,5) und Wasser bis 3,2 ml. (1,73 ml Tris in 2 m Tiefe hinzufügen, um die Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 zu bringen) 
Nukleotid-Mix: 145 mg ATP-Dikaliumsalz-Dihydrat (MW 619,4), 133 mg GTP-Dinatriumsalz (MW 567,14), 79,4 mg CTP-Dinatriumsalz-Dihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP-Trinatriumsalz-Dihydrat (MW 586,12), KOH bei 15 % Verdünnung (auf pH 7,5) und Wasser auf 1,5 ml. (353 μm; l KOH bei 15 % Verdünnung, um die Lösung auf pH 7,5 zu bringen). 
Ergänzendes Material 2. Bradford Assay.</stark>
<Ol>
	<li>Bradford-Agent von 4 &deg entfernen; C und bei Raumtemperatur einstellen.</li>
	<li>Prepare 50 &mu; l BSA-Standard bei 1 mg/ml und bei 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Prepare 40 μm; l 20-fache Verdünnung des Extrakts aus Schritt 1.47.</Li>
	<li>Addieren 800 &mu; l Wasser auf 7 Küvetten. </li>
	<li>Bereiten Sie Standardküvetten für 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu; l 0,1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu; l 0,1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu; l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu; l 1 mg/ml BSA).</li>
	<li>Präparation von Versuchsküvetten für 2 μ; L der Probe und 4 &mu; l der Probe.</li>
	<li>Addieren 200 &mu; l Bradford-Wirkstoff in jede Küvette geben und durch Pipettieren gut mischen. Bei Raumtemperatur mindestens 10 min.</li inkubieren>
	<li>Erzeugen Sie eine Standardkurve bei OD 595 nm mit Küvetten aus Schritt 6.5. Standardkurve ablehnen, wenn r2 < 0,95,</li>
	<li> Bestimmung der Extraktkonzentration bei OD 595nm mit Küvetten aus tep 6.6.</li>
</alt>
Ergänzendes Material 3. Tabelle zur Pufferkalibrierung. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(Vorlage)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> Siehe TXTL_e(Vorlage)_calibration_JoVE.xlsx</a>. 
Ergänzendes Material 4. Führen Sie spreadsheet. ohne Zellen ohne Zellen aus.
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Siehe TXTL _JoVE.xlsx</a>.</td></tr></tbody></table>

protokolle für die implementierung einer escherichia coli basierend tx-tl zellfreie expression system für synthetische biologie

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal zellfreie Expressionssysteme können theoretisch emulieren einen zellulären in vivo-Umgebung in einem in vitro-Plattform gesteuert. 1 Dies ist nützlich für die Expression von Proteinen und genetischen Schaltungen kontrolliert, sowie zum Bereitstellen einer Prototypumgebung für synthetische Biologie. 2,3 Um letzteres Ziel zu erreichen, zellfreie Expressionssysteme, die erhalten endogenen Escherichia coli Transkriptions-Translations-Mechanismen sind in der Lage, in vivo zellulären Dynamik als solche auf Basis von T7-RNA-Polymerase-Transkription genauer widerspiegeln. Wir beschreiben die Vorbereitung und Durchführung eines effizienten endogenen E. coli basiert Transkriptions-Translations-(TX-TL) zellfreien Expressionssystem, das äquivalente Mengen an Protein, wie T7-basierten Systemen zu einer Kostenreduktion bis zu 98% ähnlich wie kommerzielle Systeme produzieren kann. 4,5 Die Herstellung von Puffern und rohem Zellextrakt beschrieben, sowie die Ausführung einesdrei U-TX-TL-Reaktion. Das gesamte Protokoll dauert fünf Tage, um vorzubereiten und liefert genug Material für bis zu 3000 einzelne Reaktionen in einer Zubereitung. Einmal hergestellt, nimmt jeder Reaktion unter 8 Stunden von der Einrichtung der Datensammlung und-analyse. Mechanismen der Regulation und Transkription exogener E. coli, wie lac / Tet-Repressoren und T7-RNA-Polymerase, ergänzt werden. 6 Endogene Eigenschaften, wie mRNA und DNA-Abbauraten können ebenfalls eingestellt werden. 7 Der TX-TL zellfreien Expressionssystem für nachgewiesen groß Maßstab Schaltungsanordnung, die Erkundung der biologischen Phänomene und Expression von Proteinen unter beiden T7-und endogene Promotoren. 6,8 Begleitende mathematische Modelle zur Verfügung stehen. 9,10 Das resultierende System hat einzigartige Anwendungen in der Synthetischen Biologie als Prototyping-Umgebung, oder &quot;TX- TL biomolekularen Steckbrett. &quot;

Wir haben einen Fünftage Protokoll zur Herstellung eines endogenen Escherichia coli basieren TX-TL zellfreien Expressionssystem dargestellt. Eine Probe Timeline für die Erstellung der Reagenzien - Zellrohextrakt und Puffer - ist in Abbildung 1 zu finden. Einmal erzeugt, so können diese bei -80 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. Nach Reagenzien erstellt sind, können Versuchsaufbau und Durchführung in weniger als 8 Stunden durchgeführt werden. Darüber hinaus optimiert die Expression Bedingungen des TX-TL zellfreien Expressionssystem. Andere Benutzer angegebenen Zusätze wie Puffer oder DNA-Lösungen sollten für Toxizität vorher kalibriert werden. Zum Beispiel ergeben sich unterschiedliche Verfahren der Verarbeitung Plasmide in anderen Ausdruck durch Salzgehalt. Wir testeten auch die Wirkung von Tris-Cl Elutionspuffer auf die Reaktionseffizienz (Abbildung 5). Ein Beispiel eines rohen Zellextrakt Kalibrierung Bezugnahme Schritt 4,1 bis 4,9, dargestelltin Fig. 4a. Im allgemeinen zeigen unsere Versuche, dass der rohe Zellextrakt ist am empfindlichsten für Mg-Glutamat auf, gefolgt von K-Glutamat-Niveaus. Um die zellfreie Expressionssystem zu demonstrieren, konstruierten wir getestet und eine negative Rückkopplungsschleife auf der Basis tet Repression. 26 (Abbildung 6). In zellfreien Expressionssystem, die gleiche Schaltung Lauf mit und ohne ATC zeigt eine 7-fach-Endpunkt Ausdruck Wechsel deGFP Reporter nach acht Stunden des Ausdrucks. Obwohl dieses Experiment nicht erfordern globale Induktoren oder Repressoren, wenn nötig können sie unter "Master Mix Vorbereitung." Hinzugefügt werden <img alt="Figur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg"> Fig. 1 ist. Timeline für rohen Zellextrakt, Aminosäure-Lösung und Energielösung Vorbereitung. Ein Fünf-Tages-timelin e für eine typische Ausführung des Protokolls ist oberhalb, da über Nacht Inkubationen und Tagesarbeitsschritte optimiert. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg"> 2. Kosten-und Expressionsanalyse von konkurrierenden rohen Zellextrakten. a) Aufschlüsselung der Kosten der Arbeit und Materialien der TX-TL zellfreien Expressionssystem. Basierend auf Kosten der Reagenzien im Dezember 2012 und der Arbeitskosten von $ 14 pro Stunde. B) Vergleich der TX-TL zellfreie Expressionssystemkosten im Vergleich zu anderen kommerziellen Systemen. Kosten werden pro ul gebrochen, obwohl Reaktionsvolumina pro Set. C) Vergleich der TX-TL zellfreien Expressionssystem Ausbeute im Vergleich zu anderen kommerziellen Systemen variieren. Proteinexpressionsausbeute von Herstellernormen festgelegt./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg"> 3. Be-und Verarbeitung von einer Wulst-schlagRohr. a) Demonstration der richtigen Viskosität von Zell-Bead-Lösung. Zell-Bead-Lösung wird eine Viskosität von vielen Faktoren abhängig, einschließlich Höhe der S30A-Puffer, Menge von Perlen aufgenommen, und die Zeit auf dem Eis verbracht. B) Laden der Wulst-Rohr schlagen vor schnellen Tisch Zentrifugieren. Die Zentrifugation entfernt Blasen während des Ladens angesammelt. C) Blasen nach Tisch Zentrifugation Beschichten. Die Größe der Blasen wird variieren, sie können aufgetaucht oder entfernt werden, mit einer Pipettenspitze d) vollständig gefülltes Kügelchen-Spiel gegen Rohr vor der Deckelung.. Ein Meniskus im Wulst-schlagen t gebildetube, und die Kappe hat genug zu decken und zu kleinen Mengen. füllen E) korrekt geladen Filtergerät. Diese können. F) Vergleich der richtig gegen falsch verarbeitet Perlen schlagen Rohr wiederverwendet werden. Das Rohr auf der linken Seite ist ein gut-Beat Rohr - es verfügt über eine kleine, gut abgegrenzte Oberschicht, und sehr klare Überstand. Das Rohr auf der rechten Seite nicht optimal sein, basierend auf dem größeren, trübe zweiten Schicht und der trübe Überstand. Rohre, die nicht optimal sind, sollten nicht weitere Verarbeitung erfolgt. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg"> 4. Eigenschaften der Rohextrakt Zubereitungen. a) Typische Eichkurven für Zellrohextrakt. Rohextrakt wird für weitere Mg-Glutamat, K-Glutamat und DTT Niveaus kalibriert ist, in dieser Reihenfolge. Dargestellt ist Endpunkt fluorescence nach 8 h, sowie maximale Rate der Proteinproduktion auf der Basis einer 12-minütigen Bewegungsdurchschnitt. Basierend auf diesen Grundstücken, ein akzeptables Angebot an Zusatz Mg-Glutamat ist 4 mM, K-Glutamat ist 60-80 mM, DTT und 0-3 mM. Beachten Sie, dass jedes Rohextrakt muss unabhängig für diese drei Variablen kalibriert werden. B) Änderung von Extraktpräparaten. Endpoint Fluoreszenz von zwei Rohextrakte an verschiedenen Tagen vorbereitet wird gezeigt, Fehlerbalken sind 1 Standardabweichung aus drei unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg"> 5. Auswirkungen der DNA-Lösung auf die Expression Effizienz. a) Vergleich von zwei unterschiedlichen ReinigungsVerfahren zur Verarbeitung von Plasmiden. 1 nM pBEST-OR 2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 ist mit nur einem QIAprep Spin Miniprep Kit (Reinigung Methode 1) oder mit einem QIAquick PCR Purification Kit nachbearbeitet vorbereitet (Reinigung Methode 2). Dargestellt ist Endpunkt Fluoreszenz nach 8 Stunden, sowie maximale Rate der Proteinproduktion auf der Basis einer 12-minütigen gleitenden Durchschnitt. Fehlerbalken sind 1 Standardabweichung aus vier unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. B) Wirkung der Elutionspuffer (Tris-Cl). Verschiedene Konzentrationen von Tris-Cl in einer zellfreien Expressions Reaktion basierend auf der Expression von 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 verglichen. Angegebenen Konzentrationen sind Endkonzentrationen von Tris-Cl in der Reaktion; Elutionspuffer ist 10 mM Tris-Cl. Fehlerbalken sind 1 Standardabweichung aus drei unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . 6. Beispiel TX-TL Lauf einer negativen Rückkopplungsschleife. a) Proben Einrichtung eines zellfreien Ausführung Reaktion. Tests "auf" gegen "Aus"-Zustand der negativen Rückkopplungsschleife, mit positiven und negativen Kontrollen. B) Plasmid Karte von negativen Rückkopplungsschleife. C) Repräsentative Ergebnisse. Daten spiegelt Experiment in a) und b) mit Negativkontrolle aus Signal subtrahiert. Genetische Schaltung in Einsatz gezeigt. Fehlerbalken sind 1 Standardabweichung aus drei unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Konzentration </td><td> Menge </td><td> Sterilisation </td><td> Aufzeichnungen </td></tr><tr><td> Chloramphenicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml in Ethanol </td><td> 1 ml </td><td> Filter zu sterilisieren (0,22 uM) </td><td> In größeren Mengen bei -20 º C zur späteren Verwendung gelagert werden. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + Cm-Agar-Platte </td><td> 31 g / l 2 × YT, 40 mM Kaliumhydrogenphosphat, 22 mM monobasisches Kaliumphosphat, 34 ug / ml Chloramphenicol </td><td> 1 Platte </td><td> Autoklav </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P Media </td><td> 31 g / l 2 × YT, 40 mM Kaliumhydrogenphosphat, 22 mM Kaliumphosphat, monobasisches </td><td> 4 L </td><td> Autoklav </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien für Tag 1 der Zellrohextrakt Protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Konzentration </td><td> Menge </td><td> Sterilisation </td><td> Aufzeichnungen </td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filter zu sterilisieren (0,22 uM) oder Autoklaven </td><td> Kann bei Raumtemperatur gelagert werden. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Filter zu sterilisieren (0,22 uM) </td><td> In größeren Mengen hergestellt und bei -20 ° C für die spätere Verwendung gespeichert werden. </td></tr><tr><td> S30A-Puffer </td><td> 14 mM Mg-Glutamat, 60 mM K-Glutamat, 50 mM Tris, pH 7,7 </td><td> 2 L </td><td> Autoklav </td><td> Um pH 7,7 zu ​​erreichen, titriert mit Essigsäure. In DTT bis 2 mM Endkonzentration kurz vor der Verwendung. Lagern bei 4 ° C </td></tr><tr><td> S30B Puffer </td><td> 14 mM Mg-Glutamat, 60 mM K-Glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoklav </td><td> Auf pH 8,2 zu erreichen, titriert mit 2MTris. Hinzufügen DTT 1 mM Endkonzentration kurz vor der Verwendung. Lagern bei 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien für Tag 2 von Zellrohextrakt Protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Falke </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Leere 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon mit Pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pelletmasse (50 ml Falcon mit Pellets - leer 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> S30A Puffervolumen zu addieren (Pelletmasse * 0,9) (ml) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gesamtmasse von Perlen hinzufügen (Pelletmasse * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. S30A Puffer-und Perlenmassen Rechner, für Tag 3 der Zellrohextrakt Protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Konzentration </td><td> Menge </td><td> Sterilisation </td><td> Aufzeichnungen </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8, </td><td> 4 ml </td><td> Keiner </td><td> Auf pH 8 zu erreichen, titriert mit KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM ATP und GTP, 94 mM CTP und UTP, pH-Wert 7,5 </td><td> 1,5 ml </td><td> Keiner </td><td> Auf pH 7,5 zu erreichen, titriert mit KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 ul </td><td> Keiner </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 ul </td><td> Keiner </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7.5-8 </td><td> 300 ul </td><td> Keiner </td><td> Um pH-Wert von 7,5 bis 8 erreichen, titriert mit Tris bei 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8, </td><td> 200 ul </td><td> Keiner </td><td> Auf pH 8 zu erreichen, titriert mit Tris bei 2 M. </td></tr><tr><td> Folinsäure </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 ul </td><td> Keiner </td><td> Obwohl nur 300 ul benötigt wird, ist Rezept für zusätzliche 1,15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidin </td><td> 1 M </td><td> 150 ul </td><td> Keiner </td><td> Lagerung bei 4 ° C Hitze auf 37 ° C zu schmelzen. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Keiner </td><td> Auf pH 7,5 zu erreichen, titriert mit Tris bei 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Reagenzien für Energy Solution-Protokoll vorzubereiten. STADT Werkstoff 1. Rezepte für Gegenstände. Chloramphenicol, 34 mg / ml: Bereiten 0,51 g Chloramphenicol und fügen Ethanol auf 15 ml. Filter zu sterilisieren (0,22 uM), aliquote 1-ml-Röhrchen bei -20 ° C für die spätere Verwendung. 2xYT + P + Cm-Agar-Platte: Bereiten 1,24 g 2xYT, 1,6 ml Kaliumhydrogenphosphat-Lösung @ 1 M, 0,88 ml Kaliumphosphat einbasischen Lösung @ 1 M, 0,6 g Agar und Wasser auf 40 ml. Autoklav. Abkühlen lassen bis 50 ° C und 40 &amp;mgr; l Cm. Aliquot 25 ml in einen 100 x 15 mm Petrischale, und abkühlen lassen für eine Stunde. 2xYT + P Media: Vorbereiten 124 g 2xYT, 160 ml Kaliumhydrogenphosphat-Lösung @ 1 M, 88 ml Kaliumphosphat einbasischen Lösung @ 1 M, und Wasser auf 4 L. Aliquot heraus in 2 x 1,88 L und 0,24 L Autoklav. Tris-Base, 2 M: Bereiten 60,57 g Tris-Base und Wasser auf 250 ml. Sterilisieren, Lagerung bei RT für die spätere Verwendung. DVB-T, 1 M: Bereiten 2,31 g DTT und Wasser auf 15 ml. Filter zu sterilisieren (0,22 uM), aliquote 1-ml-Röhrchen bei -20 ° C für die spätere Verwendung. S30A Puffer: Bereiten 10,88 g Mg-Glutamat und 24.39 g K-Glutamat, 50 ml Tris bei 2M, Essigsäure (pH-Wert 7,7) und Wasser auf 2 L Autoklav, Lagerung bei 4 ° C, 4 ml 1 M DTT vor der Verwendung. S30B Puffer: Bereiten 10,88 g Mg-Glutamat und 24.39 g K-Glutamat, Tris bei 2 M (pH 8,2) und Wasser auf 2 L Autoklav, Lagerung bei 4 ° C, 2 ml 1 M DTT vor dem Gebrauch. HEPES: Vorbereiten 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (pH 8), und 4 ml Wasser zu. tRNA: Vorbereitung 30 mg tRNA und Wasser zu 600 ul. CoA: Bereiten 30 mg CoA (MW 767,53) und Wasser zu 600 ul. NAD: Fügen 34.83 mg NAD (MW 663,43), Tris bei 2 M (pH 7,5-8) und Wasser auf 300 ul. (Add 27 ul Tris bei 2 M, um die Lösung auf pH 7.5-8 mitbringen). cAMP hinzu: 42.80 mg cAMP (MW 329,22), Tris bei 2 M (pH 8) und Wasser auf 200 ul. (In 73 ul 2 M Tris bei, um die Lösung auf pH 8 zu bringen). Folinsäure (33,9 mm): Zu 20 mg Fest Folinsäure Calciumsalz (MW 511,5), fügen 1,15 ml Wasser. Spermidin: Bereiten 23,55 ul Spermidin (MW 145,25) und Wasser zu 150 ul. Vorbereitung bei Raumtemperatur nach kurzem Schmelzen bei 37 ° C 3-PGA: In 1,03 g 3-PGA (MW 230.02), bei 2 M Tris (pH 7,5) und 3,2 ml Wasser zu. (In 1,73 ml an 2 M Tris, die Lösung auf pH 7,5 zu bringen). Nucleotide Mix: In 145 mg ATP Dikaliumsalzes Dihydrat (MW 619,4), 133 mg GTP Dinatriumsalz (MW 567,14), 79,4 mg CTP Dinatriumsalzdihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP Trinatriumsalzes Dihydrat (MW 586,12) KOH in 15% iger Verdünnung (pH 7,5) und 1,5 ml Wasser zu. (In 353 &amp;mgr; l KOH bei 15% Verdünnung, um den pH auf 7,5 zu bringen). STADT Material 2. Bradford-Assay. <ol><li> Bradford entfernen Mittel von 4 ° C und bei Raumtemperatur einstellen. </li><li> Vorbereitung 50 ul BSA-Standard in 1 mg / ml und 0,1 mg / ml. </li><li> Bereiten Sie 40 ul 20x Verdünnung von Extrakt aus Schritt 1.47. </li><li> In 800 ul Wasser bis 7 Küvetten. </li><li> Vorbereitung Standardküvetten für 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 &amp;mgr; l 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 &amp;mgr; l 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 &amp;mgr; l 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 ul 1 mg / ml BSA). </li><li> Vorbereitung experimentellen Küvetten 2 ul Probe und 4 ul Probe. </li><li> In 200 ul von Bradford Mittel zu jeder Küvette und gut mischen by Pipettieren. Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 10 min. </li><li> Produzieren Standardkurve bei OD 595 nm mit Küvetten aus Schritt 6.5. Ablehnen Standardkurve, wenn r 2 &lt;0,95. </li><li> Bestimmen Extrakt-Konzentration bei OD 595 nm mit Küvetten aus Schritt 6.6. </li></ol> STADT Werkstoff 3. Puffer Kalibrierung Tabelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Siehe TXTL_e (Vorlage) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Zusatzmaterial 4. Zellfreie Ausdruck laufen Tabellenkalkulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Siehe TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein auf E-Coli basierendes zellfreies Expressionssystem zu schaffen, das als Transkriptionstranslation oder TX tl bezeichnet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst drei Anfangskomponenten für TX TL Rohzellextrakt, Aminosäurelösung und Energielösung hergestellt werden. Die Aminosäurelösung und die Energielösung werden später kombiniert, um den TX TL-Puffer herzustellen.Der zweite Schritt besteht darin, den Rohzellextrakt zu kalibrieren, um die optimalen Magnesium-, Kalium- und DTT-Konzentrationen zu bestimmen und TX TL-Reaktionen mit maximalen Expressionsniveaus zu erzeugen. Als nächstes werden die Kalibrierungsergebnisse verwendet, um ein TX TL-System mit drei Röhrchen herzustellen, das aus Pufferrohzellextrakt und DNA besteht. Der letzte Schritt besteht darin, eine TX TL-Reaktion mit den gerade hergestellten Reagenzien durchzuführen.Letztendlich wird TX TL verwendet, um Schaltkreise der synthetischen Biologie sowie traditionelle Anwendungen der zellfreien Expression zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, Schaltkreise im Bereich der synthetischen Biologie zu testen, indem sie in vitro eine gleichwertige Umgebung bietet, die diese in vivo emuliert. Die Implikationen dieser Technik gehen so weit, dass die Geschwindigkeit des synthetischen biologischen Designs erhöht wird, da nicht mehr alle Prototyping-Schritte in vivo durchgeführt werden müssen.Assistiert wird der Eingriff von Claire Hayes, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin in unserer Gruppe. Bitte beachten Sie, dass dieses Video nur ausgewählte Abschnitte des Protokolls durchläuft, die für die Dreharbeiten entscheidend sind. Das vollständige Protokoll finden Sie im Textartikel.Zu Beginn dieses Protokolls wurden Bakterienzellen gezüchtet und pelletiert. Nun werden die Bakterienzellen mit einem Rührbesen lysiert. Bewahren Sie alle 50-Milliliter-Falkenröhrchen mit Zellsuspension auf Eis auf.Für die Zwecke dieses Videos wird das Perlensticken nur für ein Rohr demonstriert. Die Kügelchen müssen intermittierend in drei Aliquoten in das Falcon-Röhrchen gegeben werden, wobei jeweils ein Drittel der Gesamtkügelchen verwendet wird. Geben Sie das erste Aliquot der Kügelchen für 30 Sekunden in den Röhrchenwirbel und legen Sie es auf Eis.Auf die gleiche Weise das zweite Aliquot der Kügelchen hinzufügen, vortexen und auf Eis legen. Nach dem Hinzufügen des letzten Aliquots und dem Vortexen stellen Sie sicher, dass die Kügelchen gleichmäßig verteilt sind, nach dem dritten Vortexing-Schritt sollte eine dicke Paste gebildet werden. Lege das Rohr auf Eis.Bereiten Sie eine Pipettenspitze mit einem Volumen von fünf Millilitern vor, indem Sie das Ende mit einer sterilen Schere abschneiden. Um eine Öffnung von drei bis vier Millimetern zu erzeugen, stellen Sie die Pipette auf zwei Milliliter ein. Legen Sie 20 sterile Perlenperlenröhrchen auf Eis.Verwenden Sie die modifizierte Pipette, um die hohe Viskosität der Kügelzellenlösung zu überprüfen. Es sollte so viskos sein, dass es kaum aus der Pipettenspitze austritt. Entfernen Sie während des Auswurfs die Bead-Cell-Lösung aus dem Falcon-Röhrchen und überführen Sie sie in ein Bead-Bead-Röhrchen.Füllen Sie es zu drei Vierteln und schleudern Sie es extrem kurz in einer Minizentrifuge. Um Luftblasen zu entfernen, ohne die Kügelchen neu zu verteilen, fügen Sie dem Röhrchen zum Schluss Perlenzellenlösung hinzu, um einen konkaven Meniskus zu bilden. Geben Sie als Nächstes einen sehr kleinen Tropfen Bead-Cell-Lösung auf die Innenseite einer Bead-Bead-Tube-Kappe.Achten Sie darauf, keine Lösung in die äußere Lippe der Kappe zu geben. Andernfalls schließt das Perlenperlenrohr nicht ausreichend. Klopfen Sie mit der Kappe auf eine ebene Fläche und vergewissern Sie sich, dass sich keine Luftblasen auf der Unterseite der Kappe befinden.Verschließen Sie das Perlenschlagrohr. Wenn es richtig gemacht wird, sollte die Kappe fest verschlossen sein. Es sollten keine Luftblasen sichtbar sein und von hier an sollte nur noch eine kleine oder gar keine Bead-Cell-Lösung überlaufen, es sind zwei Personen erforderlich, um das Bead-Beading effizient durchzuführen.Übergeben Sie das gefüllte Röhrchen an einen Assistenten für das Bead-Bead-Verfahren, während der erste Demonstrator weitere Bead-Bead-Röhrchen mit der restlichen Bead-Cell-Lösung füllt. Nehmen Sie das gefüllte Perlenperlenrohr und legen Sie es auf Eis. Einmal wurden zwei gefüllte Perlenperlenröhrchen gesammelt, die mindestens eine Minute auf Eis lagen.Beginnen Sie mit dem Perlenperlen, indem Sie ein Rohr 30 Sekunden lang bei 46 U/min abperlen. Lege es kopfüber für 30 Sekunden auf Eis, während du auf die andere Tube schlägst. Wiederholen Sie das Abperlen und Glasieren, so dass jedes gefüllte Perlenperlenrohr insgesamt eine Minute lang geschlagen wird.Wenn alle gefüllten Perlenperlenröhrchen verarbeitet sind, wird aus einem 15 Milliliter Falkenröhrchen eine Filterapparatur konstruiert. Fügen Sie zuerst eine neue Perlenkappe mit dem flachen Teil nach oben zum Boden des Rohrs hinzu. Entfernen Sie dann die Kappe von einem bearbeiteten Bead-Bead-Röhrchen und drücken Sie eine Mikrochromatographie-Säule fest auf das Ende des aufbereiteten Bead-Bead-Röhrchens, bis es vollständig verschlossen ist.Brechen Sie das eluciane Ende der Mikrochromatographiesäule ab und platzieren Sie es elucian. Enden Sie mit dem Ende in einem leeren Perlenperlenrohr. Geben Sie diesen Komplex in das 15 Milliliter Falkenröhrchen.Konstruieren Sie die Filterapparate für alle gefüllten Perlschlagrohre und halten Sie sie auf Eis. Nach Abschluss der Zentrifuge wird das Falcon-Röhrchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 6.000 g geöffnet, um Extrakt und Pellet von den Kügelchen zu trennen. Vergewissern Sie sich nach der Zentrifugation, dass jedes Bead-Bead-Röhrchen einen lebensfähigen Extrakt produziert hat.Richtig geschlagener Extrakt wird nicht trüb und das Pellet hat zwei unterschiedliche Schichten, wie durch das Rohr auf der linken Seite dargestellt. Trübe Röhren, wie im Beispiel rechts gezeigt, müssen entsorgt werden. Der Überstand aus nichtturiden Röhrchen wird in einzelne 1,75-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, wobei so wenig Pellet wie möglich entnommen wird.Auf Eis legen, bis alle Perlenperlenröhrchen verarbeitet sind. Drehen Sie dann die Mikrozentrifugenröhrchen nach unten und sammeln Sie den Überstand. Nach der Konsolidierung von 500 Mikrolitern pelletfreiem Überstand in ein neues Perlenperlenrohr.Inkubieren Sie die Röhrchen mit entfernten Kappen bei 220 U/min und 37 Grad Celsius für 80 Minuten. Dadurch werden die verbleibenden Nukleinsäuren unter Verwendung von endogener Exonuklease verdaut, die während des Bead-Bead-Prozesses freigesetzt wird. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, sollte der Extrakt trüb aussehen.Konsolidieren Sie den Extrakt in 1,75-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bis zu 1,5 Milliliter pro Röhrchenzentrifuge bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Konsolidieren Sie den pelletfreien Überstand mit einer Pipette entweder in ein 1,75-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für kleinere Ausbeuten oder in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen für größere Ausbeuten auf Eis. Verschließen Sie das Röhrchen und mischen Sie es gut, indem Sie es umdrehen.Bewahren Sie 10 Mikroliter Überstand auf Eis auf, um die Proteinkonzentration später zu messen. Bestimmen Sie die Gesamtmenge des produzierten Extrakts und hydratisieren Sie die erforderliche Anzahl von 10 Dialysekassetten mit Molekulargewichtsgrenze, indem Sie zwei Minuten lang in S 30 B-Puffer eintauchen. Laden Sie Kassetten mit bis zu 2,5 Millilitern Extrakt.Jedes Becherglas kann bis zu zwei Kassetten aufnehmen, die drei Stunden lang bei vier Grad Celsius gerührt werden. Für die Verarbeitungsschritte nach der Dialyse finden Sie im schriftlichen Artikel. Eine grundlegende Transkriptionstranslationsreaktion besteht aus drei Teilen: Rohzellextrakt, Puffer und DNA.Obwohl Reaktionen in ihrem Volumen variieren können, verwendet dieses Protokoll eine vorgefertigte Vorlage, um eine 10-Mikroliter-Reaktion durchzuführen. Hier. Die violetten Elemente zeigen die vom Benutzer eingegebenen Werte an, und die blauen Elemente zeigen zusätzliche Reagenzien an, die dem Reaktionsdesign des Experiments in sili unter Verwendung des Mastermix-Vorbereitungsabschnitts und des DNA-Präparationsabschnitts hinzugefügt werden müssen. Im Allgemeinen können Konstanten in den Abschnitt zur Vorbereitung des Mastermixes eingefügt werden, während Variablen in den Abschnitt zur DNA-Vorbereitung eingefügt werden können.Minimieren Sie die Proben pro Experiment, um Probenverdunstung und Verzerrungen der experimentellen Startzeit zu vermeiden. In dieser Tabelle finden Sie ein Beispiel-Setup. Um DNA-Proben für jede Probe vorzubereiten, aliquotieren Sie das angegebene DNA-Wasser und die vom Benutzer bereitgestellten Gegenstände in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Bereiten Sie den Mastermix, bestehend aus Pufferextrakt und allen globalen vom Benutzer bereitgestellten Artikeln, bei Raumtemperatur vor, die auf Eis bleiben und sich vortexen. Geben Sie nach der Zugabe jedes Artikels die entsprechende Menge Mastermix zu jeder DNA-Probe und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur auf. Behandeln Sie dies als Startzeit der Reaktion.Jede Probe wird vortexen und 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur bei 10.000 g zentrifugiert, um Probenreste zu reduzieren und Blasenbildung zu reduzieren. Führen Sie die Reaktion in einer 384-Well-Platte bei 29 Grad Celsius durch. Die Laufzeiten variieren je nach Experiment, dauern aber in der Regel unter acht Stunden.Nach Beendigung des Laufs können die Daten von einem Plattenleser ausgelesen werden. In dieser Arbeit wird ein fünftägiges Protokoll für die Herstellung eines endogenen E-Coli-basierten Transkriptionstranslations- oder TXTL-zellfreien Expressionssystems vorgestellt. Die Expressionsbedingungen dieses Systems wurden durch die Erprobung der Auswirkungen verschiedener Plasmid-Prozessierungsmethoden und des elucianischen Puffers optimiert.Bestimmte Variablen, die in das TXTL-System eingeführt werden, sollten zuvor auf Toxizität kalibriert werden, z. B. wird beim Vergleich von Plasmid-Verarbeitungsmethoden bei der ersten Aufreinigungsmethode nur ein Kaya Prep Spin Mini Prep Kit verwendet, während bei der zweiten Reinigungsmethode das Plasmid unter Verwendung desselben Mini-Prep-Kits hergestellt und dann mit einem Kajak nachbearbeitet wird. Schnelles PCR-Aufreinigungskit. Dieses Diagramm zeigt die Endpunktfluoreszenz nach acht Stunden sowie die maximale Rate der Proteinproduktion basierend auf einem gleitenden 12-minütigen gleitenden durchschnittlichen Fehlerbalken sind eine Standardabweichung von vier unabhängigen Durchläufen an verschiedenen Tagen.Der beobachtete Unterschied in der Expression ist auf den Unterschied im Salzgehalt zurückzuführen. Andere Elemente zeigen jedoch möglicherweise keine Auswirkungen auf TXTL, wie z. B. der elucianische Puffer. Verschiedene Konzentrationen von TS-Chlorid wurden in einer zellfreien Expressionsreaktion verglichen, die auf der Expression eines anomolaren Plasmids basierte.Bei den angegebenen Konzentrationen handelt es sich um Endkonzentrationen von Trischlorid. In der Reaktion wird ein elucianischer Puffer von 10 Millimolar verwendet, Trischlorid-Fehlerbalken sind eine Standardabweichung von drei unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. Diese Abbildung zeigt typische Kalibrierungsdiagramme für Rohzellextrakte, kalibriert für zusätzliche Magnesiumglutamat-, Kaliumglutamat- und DTT-Werte.Die Endpunktfluoreszenz nach acht Stunden sowie die maximale Rate der Proteinproduktion basierend auf einem gleitenden 12-Minuten-Durchschnitt sind dargestellt. Beachten Sie, dass jeder Rohzellextrakt unabhängig von diesen drei Variablen kalibriert werden muss. Im Allgemeinen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der Rohzellextrakt am empfindlichsten auf den Magnesiumglutamatspiegel reagiert, gefolgt vom Kaliumglutamatspiegel.Basierend auf diesen Diagrammen beträgt ein akzeptabler Bereich für zusätzliches Magnesiumglutamat vier Millimolare, Kaliumglutamat 60 bis 80 Millimolar und DTT null bis drei Millimolare Belüftung auf der unteren Seite. Die Endeffizienz jedes Rohzellextraktpräparats kann je nach den Fähigkeiten des Benutzers und den Umgebungsbedingungen variieren. Obwohl die typische Ausbeutevariation zwischen fünf und 10 % liegt, wird hier die Endpunktfluoreszenz von zwei Rohextrakten gezeigt, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten hergestellt wurden.Fehlerbalken sind eine Standardabweichung von drei unabhängigen Durchläufen an verschiedenen Tagen. Um das zellfreie Expressionssystem zu demonstrieren, wurde eine negative Rückkopplungsschleife basierend auf Tet-Repression konstruiert und getestet, wobei derselbe Schaltkreis mit und ohne TC eine siebenfache Endpunktexpression zeigte. Wechsel des D-E-G-F-P-Reporters nach acht Stunden Expressionsfehlerbalken sind eine Standardabweichung von drei unabhängigen Durchläufen an verschiedenen Tagen.Der genetische Schaltkreis ist im Einschub dargestellt. Diese letzte Abbildung zeigt die Kosten und die Expressionsanalyse konkurrierender Rohzellextrakte. Das Tortendiagramm in a schlüsselt die Arbeits- und Materialkosten des zellfreien Expressionssystems TX TL auf, basierend auf den Kosten für Reagenzien im Dezember 2012 und den Arbeitskosten von 14 pro Stunde.Panel B vergleicht die Kosten des zellfreien Expressionssystems TX mit denen anderer kommerzieller Systeme. Die Kosten werden pro Mikroliter aufgeschlüsselt, obwohl die Reaktionsvolumina je nach Kit variieren können. Die Materialkosten für dieses System betragen etwa 3 Cent pro Mikroliter Reaktion, was einer Kostenreduzierung von 98 % im Vergleich zu vergleichbaren kommerziellen zellfreien Systemen entspricht.Panel C zeigt einen Vergleich der Ausbeute des zellfreien Expressionssystems TX TL mit anderen kommerziellen Systemen. Dieses System kann bis zu 0,75 Milligramm pro Milliliter Reporterprotein produzieren, wobei entweder ein Sigma 70-basierter Promotor mit Lambda-Phagen-Operatoren oder ein T-Sieben-getriebener Promotor verwendet wird. Diese Vergleiche deuten darauf hin, dass das zellfreie Expressionssystem TX TL äquivalente Mengen an Protein produzieren kann, da T-7-basierte Systeme eine enorme Kostensenkung gegenüber ähnlichen kommerziellen Systemen darstellen.Wir hoffen, dass diese Technik den Weg für die Vereinfachung des Engineering-Prozesses in der synthetischen Biologie ebnet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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