Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein auf E-Coli basierendes zellfreies Expressionssystem zu schaffen, das als Transkriptionstranslation oder TX tl bezeichnet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst drei Anfangskomponenten für TX TL Rohzellextrakt, Aminosäurelösung und Energielösung hergestellt werden. Die Aminosäurelösung und die Energielösung werden später kombiniert, um den TX TL-Puffer herzustellen.

Der zweite Schritt besteht darin, den Rohzellextrakt zu kalibrieren, um die optimalen Magnesium-, Kalium- und DTT-Konzentrationen zu bestimmen und TX TL-Reaktionen mit maximalen Expressionsniveaus zu erzeugen. Als nächstes werden die Kalibrierungsergebnisse verwendet, um ein TX TL-System mit drei Röhrchen herzustellen, das aus Pufferrohzellextrakt und DNA besteht. Der letzte Schritt besteht darin, eine TX TL-Reaktion mit den gerade hergestellten Reagenzien durchzuführen.

Letztendlich wird TX TL verwendet, um Schaltkreise der synthetischen Biologie sowie traditionelle Anwendungen der zellfreien Expression zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, Schaltkreise im Bereich der synthetischen Biologie zu testen, indem sie in vitro eine gleichwertige Umgebung bietet, die diese in vivo emuliert. Die Implikationen dieser Technik gehen so weit, dass die Geschwindigkeit des synthetischen biologischen Designs erhöht wird, da nicht mehr alle Prototyping-Schritte in vivo durchgeführt werden müssen.

Assistiert wird der Eingriff von Claire Hayes, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin in unserer Gruppe. Bitte beachten Sie, dass dieses Video nur ausgewählte Abschnitte des Protokolls durchläuft, die für die Dreharbeiten entscheidend sind. Das vollständige Protokoll finden Sie im Textartikel.

Zu Beginn dieses Protokolls wurden Bakterienzellen gezüchtet und pelletiert. Nun werden die Bakterienzellen mit einem Rührbesen lysiert. Bewahren Sie alle 50-Milliliter-Falkenröhrchen mit Zellsuspension auf Eis auf.

Für die Zwecke dieses Videos wird das Perlensticken nur für ein Rohr demonstriert. Die Kügelchen müssen intermittierend in drei Aliquoten in das Falcon-Röhrchen gegeben werden, wobei jeweils ein Drittel der Gesamtkügelchen verwendet wird. Geben Sie das erste Aliquot der Kügelchen für 30 Sekunden in den Röhrchenwirbel und legen Sie es auf Eis.

Auf die gleiche Weise das zweite Aliquot der Kügelchen hinzufügen, vortexen und auf Eis legen. Nach dem Hinzufügen des letzten Aliquots und dem Vortexen stellen Sie sicher, dass die Kügelchen gleichmäßig verteilt sind, nach dem dritten Vortexing-Schritt sollte eine dicke Paste gebildet werden. Lege das Rohr auf Eis.

Bereiten Sie eine Pipettenspitze mit einem Volumen von fünf Millilitern vor, indem Sie das Ende mit einer sterilen Schere abschneiden. Um eine Öffnung von drei bis vier Millimetern zu erzeugen, stellen Sie die Pipette auf zwei Milliliter ein. Legen Sie 20 sterile Perlenperlenröhrchen auf Eis.

Verwenden Sie die modifizierte Pipette, um die hohe Viskosität der Kügelzellenlösung zu überprüfen. Es sollte so viskos sein, dass es kaum aus der Pipettenspitze austritt. Entfernen Sie während des Auswurfs die Bead-Cell-Lösung aus dem Falcon-Röhrchen und überführen Sie sie in ein Bead-Bead-Röhrchen.

Füllen Sie es zu drei Vierteln und schleudern Sie es extrem kurz in einer Minizentrifuge. Um Luftblasen zu entfernen, ohne die Kügelchen neu zu verteilen, fügen Sie dem Röhrchen zum Schluss Perlenzellenlösung hinzu, um einen konkaven Meniskus zu bilden. Geben Sie als Nächstes einen sehr kleinen Tropfen Bead-Cell-Lösung auf die Innenseite einer Bead-Bead-Tube-Kappe.

Achten Sie darauf, keine Lösung in die äußere Lippe der Kappe zu geben. Andernfalls schließt das Perlenperlenrohr nicht ausreichend. Klopfen Sie mit der Kappe auf eine ebene Fläche und vergewissern Sie sich, dass sich keine Luftblasen auf der Unterseite der Kappe befinden.

Verschließen Sie das Perlenschlagrohr. Wenn es richtig gemacht wird, sollte die Kappe fest verschlossen sein. Es sollten keine Luftblasen sichtbar sein und von hier an sollte nur noch eine kleine oder gar keine Bead-Cell-Lösung überlaufen, es sind zwei Personen erforderlich, um das Bead-Beading effizient durchzuführen.

Übergeben Sie das gefüllte Röhrchen an einen Assistenten für das Bead-Bead-Verfahren, während der erste Demonstrator weitere Bead-Bead-Röhrchen mit der restlichen Bead-Cell-Lösung füllt. Nehmen Sie das gefüllte Perlenperlenrohr und legen Sie es auf Eis. Einmal wurden zwei gefüllte Perlenperlenröhrchen gesammelt, die mindestens eine Minute auf Eis lagen.

Beginnen Sie mit dem Perlenperlen, indem Sie ein Rohr 30 Sekunden lang bei 46 U/min abperlen. Lege es kopfüber für 30 Sekunden auf Eis, während du auf die andere Tube schlägst. Wiederholen Sie das Abperlen und Glasieren, so dass jedes gefüllte Perlenperlenrohr insgesamt eine Minute lang geschlagen wird.

Wenn alle gefüllten Perlenperlenröhrchen verarbeitet sind, wird aus einem 15 Milliliter Falkenröhrchen eine Filterapparatur konstruiert. Fügen Sie zuerst eine neue Perlenkappe mit dem flachen Teil nach oben zum Boden des Rohrs hinzu. Entfernen Sie dann die Kappe von einem bearbeiteten Bead-Bead-Röhrchen und drücken Sie eine Mikrochromatographie-Säule fest auf das Ende des aufbereiteten Bead-Bead-Röhrchens, bis es vollständig verschlossen ist.

Brechen Sie das eluciane Ende der Mikrochromatographiesäule ab und platzieren Sie es elucian. Enden Sie mit dem Ende in einem leeren Perlenperlenrohr. Geben Sie diesen Komplex in das 15 Milliliter Falkenröhrchen.

Konstruieren Sie die Filterapparate für alle gefüllten Perlschlagrohre und halten Sie sie auf Eis. Nach Abschluss der Zentrifuge wird das Falcon-Röhrchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 6.000 g geöffnet, um Extrakt und Pellet von den Kügelchen zu trennen. Vergewissern Sie sich nach der Zentrifugation, dass jedes Bead-Bead-Röhrchen einen lebensfähigen Extrakt produziert hat.

Richtig geschlagener Extrakt wird nicht trüb und das Pellet hat zwei unterschiedliche Schichten, wie durch das Rohr auf der linken Seite dargestellt. Trübe Röhren, wie im Beispiel rechts gezeigt, müssen entsorgt werden. Der Überstand aus nichtturiden Röhrchen wird in einzelne 1,75-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, wobei so wenig Pellet wie möglich entnommen wird.

Auf Eis legen, bis alle Perlenperlenröhrchen verarbeitet sind. Drehen Sie dann die Mikrozentrifugenröhrchen nach unten und sammeln Sie den Überstand. Nach der Konsolidierung von 500 Mikrolitern pelletfreiem Überstand in ein neues Perlenperlenrohr

Inkubieren Sie die Röhrchen mit entfernten Kappen bei 220 U/min und 37 Grad Celsius für 80 Minuten. Dadurch werden die verbleibenden Nukleinsäuren unter Verwendung von endogener Exonuklease verdaut, die während des Bead-Bead-Prozesses freigesetzt wird. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, sollte der Extrakt trüb aussehen.

Konsolidieren Sie den Extrakt in 1,75-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bis zu 1,5 Milliliter pro Röhrchenzentrifuge bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Konsolidieren Sie den pelletfreien Überstand mit einer Pipette entweder in ein 1,75-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für kleinere Ausbeuten oder in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen für größere Ausbeuten auf Eis. Verschließen Sie das Röhrchen und mischen Sie es gut, indem Sie es umdrehen.

Bewahren Sie 10 Mikroliter Überstand auf Eis auf, um die Proteinkonzentration später zu messen. Bestimmen Sie die Gesamtmenge des produzierten Extrakts und hydratisieren Sie die erforderliche Anzahl von 10 Dialysekassetten mit Molekulargewichtsgrenze, indem Sie zwei Minuten lang in S 30 B-Puffer eintauchen. Laden Sie Kassetten mit bis zu 2,5 Millilitern Extrakt.

Jedes Becherglas kann bis zu zwei Kassetten aufnehmen, die drei Stunden lang bei vier Grad Celsius gerührt werden. Für die Verarbeitungsschritte nach der Dialyse finden Sie im schriftlichen Artikel. Eine grundlegende Transkriptionstranslationsreaktion besteht aus drei Teilen: Rohzellextrakt, Puffer und DNA.

Obwohl Reaktionen in ihrem Volumen variieren können, verwendet dieses Protokoll eine vorgefertigte Vorlage, um eine 10-Mikroliter-Reaktion durchzuführen. Hier. Die violetten Elemente zeigen die vom Benutzer eingegebenen Werte an, und die blauen Elemente zeigen zusätzliche Reagenzien an, die dem Reaktionsdesign des Experiments in sili unter Verwendung des Mastermix-Vorbereitungsabschnitts und des DNA-Präparationsabschnitts hinzugefügt werden müssen. Im Allgemeinen können Konstanten in den Abschnitt zur Vorbereitung des Mastermixes eingefügt werden, während Variablen in den Abschnitt zur DNA-Vorbereitung eingefügt werden können.

Minimieren Sie die Proben pro Experiment, um Probenverdunstung und Verzerrungen der experimentellen Startzeit zu vermeiden. In dieser Tabelle finden Sie ein Beispiel-Setup. Um DNA-Proben für jede Probe vorzubereiten, aliquotieren Sie das angegebene DNA-Wasser und die vom Benutzer bereitgestellten Gegenstände in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Bereiten Sie den Mastermix, bestehend aus Pufferextrakt und allen globalen vom Benutzer bereitgestellten Artikeln, bei Raumtemperatur vor, die auf Eis bleiben und sich vortexen. Geben Sie nach der Zugabe jedes Artikels die entsprechende Menge Mastermix zu jeder DNA-Probe und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur auf. Behandeln Sie dies als Startzeit der Reaktion.

Jede Probe wird vortexen und 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur bei 10.000 g zentrifugiert, um Probenreste zu reduzieren und Blasenbildung zu reduzieren. Führen Sie die Reaktion in einer 384-Well-Platte bei 29 Grad Celsius durch. Die Laufzeiten variieren je nach Experiment, dauern aber in der Regel unter acht Stunden.

Nach Beendigung des Laufs können die Daten von einem Plattenleser ausgelesen werden. In dieser Arbeit wird ein fünftägiges Protokoll für die Herstellung eines endogenen E-Coli-basierten Transkriptionstranslations- oder TXTL-zellfreien Expressionssystems vorgestellt. Die Expressionsbedingungen dieses Systems wurden durch die Erprobung der Auswirkungen verschiedener Plasmid-Prozessierungsmethoden und des elucianischen Puffers optimiert.

Bestimmte Variablen, die in das TXTL-System eingeführt werden, sollten zuvor auf Toxizität kalibriert werden, z. B. wird beim Vergleich von Plasmid-Verarbeitungsmethoden bei der ersten Aufreinigungsmethode nur ein Kaya Prep Spin Mini Prep Kit verwendet, während bei der zweiten Reinigungsmethode das Plasmid unter Verwendung desselben Mini-Prep-Kits hergestellt und dann mit einem Kajak nachbearbeitet wird. Schnelles PCR-Aufreinigungskit. Dieses Diagramm zeigt die Endpunktfluoreszenz nach acht Stunden sowie die maximale Rate der Proteinproduktion basierend auf einem gleitenden 12-minütigen gleitenden durchschnittlichen Fehlerbalken sind eine Standardabweichung von vier unabhängigen Durchläufen an verschiedenen Tagen.

Der beobachtete Unterschied in der Expression ist auf den Unterschied im Salzgehalt zurückzuführen. Andere Elemente zeigen jedoch möglicherweise keine Auswirkungen auf TXTL, wie z. B. der elucianische Puffer. Verschiedene Konzentrationen von TS-Chlorid wurden in einer zellfreien Expressionsreaktion verglichen, die auf der Expression eines anomolaren Plasmids basierte.

Bei den angegebenen Konzentrationen handelt es sich um Endkonzentrationen von Trischlorid. In der Reaktion wird ein elucianischer Puffer von 10 Millimolar verwendet, Trischlorid-Fehlerbalken sind eine Standardabweichung von drei unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. Diese Abbildung zeigt typische Kalibrierungsdiagramme für Rohzellextrakte, kalibriert für zusätzliche Magnesiumglutamat-, Kaliumglutamat- und DTT-Werte.

Die Endpunktfluoreszenz nach acht Stunden sowie die maximale Rate der Proteinproduktion basierend auf einem gleitenden 12-Minuten-Durchschnitt sind dargestellt. Beachten Sie, dass jeder Rohzellextrakt unabhängig von diesen drei Variablen kalibriert werden muss. Im Allgemeinen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der Rohzellextrakt am empfindlichsten auf den Magnesiumglutamatspiegel reagiert, gefolgt vom Kaliumglutamatspiegel.

Basierend auf diesen Diagrammen beträgt ein akzeptabler Bereich für zusätzliches Magnesiumglutamat vier Millimolare, Kaliumglutamat 60 bis 80 Millimolar und DTT null bis drei Millimolare Belüftung auf der unteren Seite. Die Endeffizienz jedes Rohzellextraktpräparats kann je nach den Fähigkeiten des Benutzers und den Umgebungsbedingungen variieren. Obwohl die typische Ausbeutevariation zwischen fünf und 10 % liegt, wird hier die Endpunktfluoreszenz von zwei Rohextrakten gezeigt, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten hergestellt wurden.

Fehlerbalken sind eine Standardabweichung von drei unabhängigen Durchläufen an verschiedenen Tagen. Um das zellfreie Expressionssystem zu demonstrieren, wurde eine negative Rückkopplungsschleife basierend auf Tet-Repression konstruiert und getestet, wobei derselbe Schaltkreis mit und ohne TC eine siebenfache Endpunktexpression zeigte. Wechsel des D-E-G-F-P-Reporters nach acht Stunden Expressionsfehlerbalken sind eine Standardabweichung von drei unabhängigen Durchläufen an verschiedenen Tagen.

Der genetische Schaltkreis ist im Einschub dargestellt. Diese letzte Abbildung zeigt die Kosten und die Expressionsanalyse konkurrierender Rohzellextrakte. Das Tortendiagramm in a schlüsselt die Arbeits- und Materialkosten des zellfreien Expressionssystems TX TL auf, basierend auf den Kosten für Reagenzien im Dezember 2012 und den Arbeitskosten von 14 pro Stunde.

Panel B vergleicht die Kosten des zellfreien Expressionssystems TX mit denen anderer kommerzieller Systeme. Die Kosten werden pro Mikroliter aufgeschlüsselt, obwohl die Reaktionsvolumina je nach Kit variieren können. Die Materialkosten für dieses System betragen etwa 3 Cent pro Mikroliter Reaktion, was einer Kostenreduzierung von 98 % im Vergleich zu vergleichbaren kommerziellen zellfreien Systemen entspricht.

Panel C zeigt einen Vergleich der Ausbeute des zellfreien Expressionssystems TX TL mit anderen kommerziellen Systemen. Dieses System kann bis zu 0,75 Milligramm pro Milliliter Reporterprotein produzieren, wobei entweder ein Sigma 70-basierter Promotor mit Lambda-Phagen-Operatoren oder ein T-Sieben-getriebener Promotor verwendet wird. Diese Vergleiche deuten darauf hin, dass das zellfreie Expressionssystem TX TL äquivalente Mengen an Protein produzieren kann, da T-7-basierte Systeme eine enorme Kostensenkung gegenüber ähnlichen kommerziellen Systemen darstellen.

Wir hoffen, dass diese Technik den Weg für die Vereinfachung des Engineering-Prozesses in der synthetischen Biologie ebnet.