Name: im lebenden Organismus Reprogrammierung adulter somatischer Zellen zur Pluripotenz durch Überexpression von Yamanaka-Faktoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T09:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung adulter Hepatozyten zur Pluripotenz in vivo durch hydrodynamische Injektion von Yamanaka-Faktoren. Diese Methode ermöglicht effiziente und sichere Zellreprogrammierung ohne Teratombildung.

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Diese Arbeit wurde teilweise vom Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Swindon, Vereinigtes Königreich) und den FP-7-Programmen der Europäischen Kommission NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) und ANTICARB (HEALTH-2008-20157) unterstützt. AY wurde durch ein Vollzeit-Promotionsstipendium des Bildungsministeriums (Türkei) unterstützt, und IL bedankt sich für eine teilweise Unterstützung durch den British Council und die CAIXA Foundation (Spanien). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

1. In vivo Reprogrammierung von Lebergewebe durch HTV-Verabreichung von pDNA
<ol>
	<li>Lassen Sie weibliche Balb/C-Mäuse, die 6 Wochen alt sind, eine Woche lang an die Tiereinrichtung gewöhnen, bevor ein Eingriff durchgeführt wird.</li>
	<li>0,9 % Kochsalzlösung in destilliertem Wasser zubereiten und durch einen 0,22 μm Mikrofilter filtrieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung mit 75 μg pCX-OKS-2A und 75 μg pCX-cMyc-Plasmid-DNA in 1,5 ml 0,9 % Kochsalzlösung pro Maus vor. Anmerkung: Das Gesamtinjektionsvolumen muss zwischen 8-10% des Gesamtkörpergewichts liegen. 
	Hinweis: Halten Sie die Mäuse vor der Injektion in einer Heizkammer bei 37 °C, bis die Schwanzvenen leicht sichtbar sind und erweitert erscheinen.</li>
	<li>Induzieren Sie eine Anästhesie mit Isofluran vor (in der Heizkammer) und während der Injektion (mit einer Anästhesiemaske).</li>
	<li>Verabreichen Sie die pDNA-Lösung oder die Kochsalzlösung mit einer 27-G-Spritze durch HTV-Injektion. Hinweis: Damit die Transfektion erfolgreich ist, sollte das Gesamtvolumen in nicht mehr als 5-7 Sekunden injiziert werden.</li>
	<li>Überwachen, ob sich die Tiere ordnungsgemäß von der Injektion erholen.</li>
</ol>
2. Leberperfusion und Isolierung von primären Hepaktozyten für qRT-PCR-Studien
<ol>
	<li>Zu verschiedenen Zeitpunkten, einschließlich 2, 4, 8, 12 und 24 Tage nach der HTV-Injektion, eine Tiefenanästhesie mit Isofluran einleiten.</li>
	<li>Sprühen Sie 70%iges Ethanol auf den Bauch des Tieres, machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt durch die Haut an der ventralen Mittellinie und präparieren Sie die Bauchmuskelschicht, um die Eingeweide freizulegen.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Schere das Zwerchfell ab, um die Brusthöhle freizulegen, und klemmen Sie die Vena cava mit einer Verriegelungszange fest.</li>
	<li>Verschieben Sie die Eingeweide nach rechts und die Leberlappen so, dass sowohl die untere Cava als auch die Pfortader leicht zugänglich sind.</li>
	<li>Kanülieren Sie die Vena cava inferior mit einem 22 G Katheter und schneiden Sie die Pfortader, um einen Überdruck zu vermeiden.</li>
	<li>Beginnen Sie die Perfusion mit 10 ml HBSS-Puffer (Ca2+ und Mg2+ frei, mit Bicarbonat), vorgewärmt auf 37 °C. Perfundieren Sie den Puffer langsam mit einer 10 ml Spritze, bis die Leber weiß wird (3 min).</li>
	<li>Die Perfusion mit Liver Digest Medium, vorgewärmt auf 37 °C, bei einer Flussrate von 0,6 ml/min (für 15 min) fortsetzen, bis die Leber anschwillt und sich lockert. Anmerkung: Übermäßige Verdauung und Durchblutung können Hepatozyten oder reprogrammierte Zellen schädigen.</li>
	<li>Der Versuch wird bei 4 °C fortgesetzt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Leber mit einer Pinzette, nachdem Sie die falciformen und koronaren Bänder durchtrennt haben, und waschen Sie sie mit Hepatozytenwaschmedium, während Sie sie durch ein 100 μm Zellsieb führen, um eine Zellsuspension zu erhalten.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellsuspension in 50-ml-Röhrchen und stellen Sie das Volumen mit Hepatozytenwaschmedium auf 15 ml ein.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 g für 4 min. Halten Sie die Temperatur bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand (der Kupffer- und Epithelzellen enthält) und resuspendieren Sie das Zellpellet (mit den Hepatozyten) in 10 ml Hepatozytenwaschmedium. Anmerkung: Das Zellpellet sollte sehr vorsichtig resuspendiert werden, Hepatozyten sind sehr zerbrechliche Zellen.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang insgesamt dreimal und resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 10 ml Hepatozytenwaschmedium.</li>
	<li>Schätzen Sie die Zellzahl mit einem optischen Mikroskop und einem Hämozytometer.</li>
	<li>Aliquots von 2 x 106 Zellen vorbereiten, bei 300 x g zentrifugieren, um alle Zellen zu gewinnen, und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Zu diesem Zeitpunkt kann das Zellpellet eingefroren und bis zur Weiterverarbeitung bei -20 °C aufbewahrt oder direkt für die RNA-Extraktion verwendet werden.</li>
</ol>
3. Genexpressionsstudie von isolierten Hepatozyten zur Hochregulierung von pluripotenten Genen
<ol>
	<li>Extrahieren Sie RNA aus 2 x 106 Zellen mit einem Spin-Säulen-Kit gemäß den Anweisungen des Lieferanten.</li>
	<li>Verwenden Sie 1 μg der extrahierten RNA, um eine zweistufige qRT-PCR gemäß den Anweisungen des Lieferanten durchzuführen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Hepatozyten der in Kochsalzlösung injizierten Tiere als Kontrolle, um die relative Genexpression von Reprogrammierungs-, Pluripotenz- und Hepatozytenmarkern zu korrigieren.</li>
</ol>
4. Durchflusszytometrische Analyse der erhöhten Pluripotenz auf Proteinebene
<ol>
	<li>Führen Sie an den Tagen 1 und 4 nach der Injektion eine Leberperfusion durch und isolieren Sie die primären Hepatozyten wie oben angegeben.</li>
	<li>Die Zelldichte auf 1 x 107 Zellen/ml einstellen und 100 μl Aliquots vorbereiten.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit BD Cytofix Fixationspuffer und permeabilisieren Sie sie mit 1x BD Perm/Wash Puffer.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen entweder mit Anti-Maus OCT4-PerCP-Cy5.5 oder Anti-Maus Nanog-PE für 30 Minuten.</li>
	<li>Enthalten sind Negativ- und Isotyp-Steuerelemente.</li>
	<li>Analysieren Sie die gefärbten Zellen mit dem CyAn ADP Hochleistungs-Durchflusszytometer.</li>
</ol>
5. Immunfärbung von Leberschnitten auf Marker der Pluripotenz
<ol>
	<li>Vier Tage nach der Injektion perfundieren Sie die Leber wie oben angegeben, jedoch nur mit HBSS-Puffer, um das Blut aus dem Lebergewebe zu entfernen.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Stück Lebergewebe ab und tauchen Sie es in 2-Methylbutan (vorgekühlt in flüssigem Stickstoff), um mit der Kryosektion fortzufahren.</li>
	<li>Gefrorenes Gewebe kann bei -80 °C aufbewahrt oder direkt mit einem Kryostaten in 14 μm dicke Schnitte geschnitten werden.</li>
	<li>Trocknen Sie die Gewebeschnitte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur an der Luft und anschließend mit Methanol, vorgekühlt bei -20 °C für 10 min. Trocknen Sie sie 15 Minuten lang an der Luft und waschen Sie die Schnitte dann zweimal mit PBS (jeweils 5 min).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schnitte in Blockierungspuffer (5 % Ziegenserum - 0,1 % Triton in PBS pH 7,3) bei Raumtemperatur für 1 Stunde, gefolgt von zwei Waschschritten mit Waschpuffer (1 % BSA - 0,1 % Triton in PBS, pH 7,3).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gewebeschnitte über Nacht bei 4 °C mit Anti-OCT4-, Anti-SOX2- und Anti-Nanog-Primärantikörpern.</li>
	<li>Am nächsten Tag waschen Sie die Schnitte 3x (je 5 min) mit Waschpuffer und inkubieren Sie sie für 1,5 h bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper.</li>
	<li>Leberschnitte mit PBS waschen (3x, je 5 min) und in DAPI und Antifade-haltiges Medium einbetten.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Objektträger unter einem Epifluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>
6. Färbung von Lebergewebeschnitten durch alkalische Phosphatase (ALP)
<ol>
	<li>Entnehmen Sie Lebergewebeschnitte wie oben beschrieben.</li>
	<li>Erwärmen Sie die Gewebeschnitte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Färbung durchführen.</li>
	<li>Fixieren Sie mit 4% Paraformaldehyd für 2 Minuten. Hinweis: Eine übermäßige Fixierzeit kann die ALP-Aktivität verringern.</li>
	<li>Trocknen Sie die Schnitte 30 Minuten lang an der Luft und inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang mit flüssigem BCIP/NBT-Substrat bei 37 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser und montieren Sie sie mit wässrigen Eindeckmedien.</li>
	<li>Nehmen Sie zufällige Bilder durch Lichtmikroskopie auf.</li>
</ol>
7. Quantifizierung von Albumin- und Leberenzymspiegeln im Serum zur Beurteilung der Lebertoxizität
<ol>
	<li>Entnehmen Sie an den Tagen 4, 8, 12 und 120 nach der Transfektion 300 μl Blut direkt aus dem Herzventrikel.</li>
	<li>Halten Sie das Blut auf Eis, während die verschiedenen Proben entnommen werden, um eine Gerinnung zu vermeiden.</li>
	<li>Sobald alle Proben fertig sind, 30 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis das Blut gerinnt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 x g für 5 min.</li>
	<li>Das Serum (im Überstand) vorsichtig in ein neues Eppendorf-Röhrchen pipettieren und bis zur Verarbeitung der Proben bei -80 °C einfrieren.</li>
	<li>Analysieren Sie die Serumspiegel auf Albumin, ALT, AST, ALP und GLDH.</li>
</ol>
8. Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) und periodische Säure-Schiff (PAS)-Färbung von Leberschnitten zur Beurteilung der Lebertoxizität
<ol>
	<li>Zu verschiedenen Zeitpunkten, einschließlich 2, 4, 8, 12, 24, 50 und 120 Tage nach der HTV-Injektion, führen Sie die Leberperfusion mit HBSS-Puffer nur wie zuvor beschrieben durch.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Stück Lebergewebe ab und fixieren Sie es mit 4% Paraformaldehyd.</li>
	<li>Lebergewebe in Paraffinblöcke einbetten, schneiden und färben Sie entweder mit H&E- oder PAS-Färbung.</li>
	<li>Nehmen Sie zufällige Bilder durch Lichtmikroskopie auf.</li>
</ol>

<ol><li>Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+In+The+Absence+Of+Drug+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection.</a> Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+Of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblasts+By+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+Of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Mouse+Embryonic+And+Adult+Fibroblast+Cultures+By+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
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<li>Gonzalez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Mouse-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+By+Transient+Expression+Of+A+Single+Nonviral+Polycistronic+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Without+Viral+Vectors.+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. </a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piggybac+Transposition+Reprograms+Fibroblasts+To+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
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<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+To+Pluripotency+And+Directed+Differentiation+Of+Human+Cells+With+Synthetic+Modified+Mrna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+By+Direct+Delivery+Of+Reprogramming+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Mirna-Mediated+Reprogramming+Of+Mouse+And+Human+Somatic+Cells+To+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).</li>
<li>Lin, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Of+Somatic+Cell+Reprogramming+Through+Inducible+Mir-302+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression.</a> Nucleic Acids Res. , (2011).</li>
<li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Of+Mouse+And+Human+Cells+To+Pluripotency+Using+Mature+Micrornas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas.</a> Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Targets+Of+Mir-302+And+Mir-372+Promote+Reprogramming+Of+Human+Fibroblasts+To+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).</li>
<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flaw+In+Induced-Stem-Cell+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flaw In Induced-Stem-Cell Model.</a> Nature. 470, 13 (2011).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+In+The+Safety+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines.</a> Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).</li>
<li>Pera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dark+Side+Of+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Dark Side Of Pluripotency.</a> Nature. 471, 46-47 (2011).</li>
<li>Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Challenges+In+Using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+To+Model+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease.</a> Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Germline-Competent+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
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<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Adeno-Associated+Viral+Vectors+For+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy.</a> Gene Ther. 19, 162-168 (2012).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+And+Prospects%3A+Naked+Dna+Gene+Transfer+And+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy.</a> Gene Ther. 10, 453-458 (2003).</li>
<li>Wolff, J. A., Budker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+Of+Naked+Dna+Uptake+And+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression.</a> Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Diese Studie liefert einen prinzipiellen Beweis für die in vivo Zellreprogrammierung in Richtung Pluripotenz nach dem effizienten Transfer und der Überexpression der OKSM-Faktoren auf die adulte Mausleber. Mit Hilfe verschiedener Techniken wie qRT-PCR, Durchflusszytometrie, IHC oder Serumanalyse wurde das Zielgewebe untersucht, um in vivo die Zellreprogrammierung zu beobachten. Sehr schnell nach der Induktion der OKSM-Faktor-Überexpression im Gewebe wurden die Pluripotenzmarker auf mRNA- und Proteinebene (innerhalb von 48 Stunden) hochreguliert. Während dieser Experimente wurde gezeigt, dass zwischen 5 und 15 % der aus dem Gewebe extrahierten Zellen Nanog- und Oct3/4-positiv waren. Darüber hinaus wurden während der gesamten 120 Tage keine strukturellen oder funktionellen Anomalien in der Leber beobachtet. Die Expression von Transgenen durch HTV-Injektion von Plasmid-DNA in anderen Geweben als der Leber (Lunge, Milz, Niere und Herz) wurde bereits früher berichtet, jedoch waren die Genexpressionsniveaus mindestens 3 Größenordnungen niedriger als die in Hepatozyten30. Die Daten in dieser Studie deuten darauf hin, dass die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo in einen pluripotenten Zustand sicher, schnell und effizient ist. In Anbetracht der Mehrzahl der bestehenden in vitro Zellreprogrammierungsmethoden, die in der Regel eine pluripotente (iPS) Zellgenerierung innerhalb von 3 Wochen mit weniger als 1 % der Effizienz erreichen32, kann die in vivo Reprogrammierung auf Pluripotenz sehr interessante Alternativen bieten. Wir stellen die Hypothese auf, dass das Konzept der in vivo Reprogrammierung zur Pluripotenz auf verschiedene Arten von somatischen Zellen mit hoher Effizienz angewendet werden könnte (abhängig vom verwendeten Vektor), jedoch muss das Niveau der funktionellen Pluripotenz, das in den in vivo reprogrammierten Zellen erreicht wird, bestimmt werden. Darüber hinaus könnten mit der Entwicklung verbesserter Protokolle und Technologien in vivo reprogrammierte Zellen potenziell extrahiert und für Zwecke der regenerativen Medizin verwendet werden.
Es gibt einige kritische Schritte, die zu befolgen sind, um adulte, somatische Zellen in vivo mit hoher Effizienz umzuprogrammieren. Das Erreichen einer hohen Genexpression im Zielgewebe ist Voraussetzung. In dieser Studie wurde dies anhand des effizienten Transfers und der Expression von Plasmid-DNA zu Hepatozyten mittels HTV-Injektion veranschaulicht. Die wichtigsten Faktoren für die HTV-Injektion sind das Volumen, das zwischen 8-10% des Gesamtkörpergewichts des Tieres liegen sollte, und die Geschwindigkeit der Injektion, die innerhalb von 5-7 Sekunden durchgeführt werden muss. Mäuse, die jünger als 6 Wochen sind, sollten nicht verwendet werden, da die HTV-Injektion mehr Gewebeschäden in der Leber verursachen kann, was die Effizienz der zellulären Reprogrammierung beeinträchtigen kann. Der genetische Hintergrund der Tiere hatte keinen Einfluss auf die Wirksamkeit der in vivo-Reprogrammierung, da wir zuvor über ähnliche Reprogrammierungsniveaus sowohl bei Balb/C- als auch bei TNG-A-Mäusen berichtet haben, wobei es sich bei letzterem um einen transgenen Stamm handelt, der den eGFP-Reporter trägt, der in den Nanog-Locus eingefügt ist und auf dem Sv129-Hintergrund gezüchtet wurde29.
Wir spekulieren, dass die in vivo Zellreprogrammierung in einen pluripotenten Zustand (der bestimmt werden muss) auf andere Gewebetypen angewendet werden kann, vorausgesetzt, die OKSM-Faktoren werden effizient an die Zielzellen abgegeben, was ein hohes Maß an Genexpression ermöglicht. In präklinischen und klinischen Studien wurde eine Vielzahl von nichtviralen und viralen Genverabreichungsvektoren untersucht, um auf verschiedene Zell- und Gewebetypen abzuzielen33. Zum Beispiel waren Adeno-assoziierte Viren für neuronales oder okuläres Gewebe die bevorzugte Vektorwahl für einen effizienten in vivo Gentransfer34-37, während in Muskelgewebe gezeigt wurde, dass nackte Plasmid-DNA-Injektionen zu einer relativ hohen Genexpression führen38,39. Daher sollte die Methode des Gentransfervektors in Abhängigkeit vom Gewebetyp sorgfältig ausgewählt werden, um eine effiziente und schnelle in vivo Zellreprogrammierung in einen pluripotenten Zustand zu erreichen.

Ethische Bedenken hinsichtlich der Verwendung embryonaler Stammzellen waren eine der Einschränkungen bei der Entwicklung der Stammzellenforschung. Die Entdeckung von Yamanaka und Kollegen, dass die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren (nämlich: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) zu einer In-vitro-Reprogrammierung von somatischen Zellen in pluripotente Zellen führen könnte, die als induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) bezeichnet werden, hat jedoch neue Möglichkeiten eröffnet. Der virale1-5- und der nichtvirale6-10-Gentransfer, die zytoplasmatische Proteintranslokation11,12 und die miRNA13-16-Transfektion gehören zu den verschiedenen Methoden, die heute zur Erzeugung von iPS-Zellen verwendet werden. Solche Reprogrammierungsmethoden leiden jedoch unter verschiedenen Problemen, die ihre Umsetzung in die Klinik einschränken, wie zum Beispiel: a) starke Einschränkungen in der Effizienz der Zellreprogrammierung; b) die überwiegende Verwendung viraler Vektoren; c) lange und mehrstufige Protokolle der Kultivierungsbedingungen; und d) das Risiko einer Tumorigenität durch Implantation der in vitro erzeugteniPS-Zellen 17-20.
Der Gentransfer von definierten Transkriptionsfaktoren3-5 durch Retroviren ist die am häufigsten verwendete Methode, um somatische Zellen umzuprogrammieren. Es enthält jedoch die Risiken, die sich aus der Möglichkeit einer Insertionsmutagenese, einer stabilen Transduktion und einer langfristigen Proto-Onkogen-Expression ergeben21,22. Nichtvirale Gentransfervektoren wie Plasmid-DNA6,7,23 oder RNA 10-Verabreichung mittels Liposomen oder Elektroporation wurden ebenfalls untersucht. Diese Vektoren sind zwar sicherer im Vergleich zu Viren, bieten aber eine deutlich eingeschränkte Transduktions- und Reprogrammierungseffizienz24,25 .
Eines der zentralen Dogmen dieses aufstrebenden Gebietes ist, dass die in vivo Implantation von iPS-Zellen zu deren unkontrollierter Differenzierung und zur Bildung einer tumorähnlichen Masse (Teratom) führt, die aus verschiedenen Geweben der drei verschiedenen Keimblätter besteht. Daher konzentrierte sich das Konzept der Reprogrammierung zur Pluripotenz in erster Linie auf die In-vitro-Manipulation von primär extrahierten somatischen Zellen (am häufigsten Fibroblasten). Wie oben beschrieben, leidet dieses Prinzip jedoch unter langen und komplexen Zellkulturprotokollen, einschließlich mehrerer Behandlungsrunden (Gentransfer, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Antioxidantien), die ihrerseits das Risiko für die Bildung von Teratomen oder andere Formen der Tumorgenese bei der Implantation der Zellen erhöhenkönnen 24-28.
Wir schlagen vor, dass die Reprogrammierung adulter somatischer Zellen in vivo durch die vorübergehende Überexpression der OKSM-Transkriptionsfaktoren nicht zur nachfolgenden Bildung von Teratomenführt 29. Die Methode, um dies zu erreichen, hängt davon ab, ein hohes Maß an Transkriptionsfaktorexpression im Zielgewebe auf möglichst sichere Weise zu erreichen. In dieser Studie haben wir eine etablierte virusfreie Gentransfertechnologie ausgewählt, die nachweislich effizient auf die Leber abzielt, um Zellen in vivo auf Pluripotenz umzuprogrammieren. Diese Technologie beinhaltet die großvolumige, schnelle hydrodynamische Schwanzveneninjektion (HTV) von Plasmid-DNA30,31. Mit dieser nichtviralen Gentransfermethode können hohe Expressionsniveaus von transfizierten Genen in adulten Hepatozyten erreicht werden. Darüber hinaus minimiert diese Technologie die potenziellen Risiken durch die Verwendung viraler Vektoren (z. B. dauerhafte genomische Insertion, Insertionsmutagenese).

<table><tbody><tr><td>pCX-OKS-2A pDNA</td><td>Addgen</td><td>19771</td><td>Gewonnen aus Addgene als bakterieller Stab, Plasmidproduktion in der Plasmidfabrik (Deutschland)</td></tr><tr><td>pCX-cMyc</td><td>Addgene</td><td>19772</td><td>Gewonnen aus Addgene als bakterieller Stab, Plasmidproduktion in der Plasmidfabrik (Deutschland)</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Filter</td><td>Milliopore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>B505</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td>Ca2+ und Mg2+ frei, mit Bicarbonat</td></tr><tr><td>Leberverdaumedium</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozytenwaschmedium</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>100 & My; m cell strainer</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA II kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.25</td><td>Kit für die RNA-Isolierung aus Zellen und Geweben</td></tr><tr><td>iScript cDNA-Synthesekit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iO SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 Forward Primer</td><td>Sigma Sequenz</td><td>in Kommentaren angegeben</td><td>TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA</td></tr><tr><td>Okt3/4 Reverse-Primer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren</td><td>CTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC</td></tr><tr><td>Sox2-Vorwärtsprimer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren</td><td>GGTTACCTCTCCCCCCCCCAG</td></tr>, <tr><td>Sox2-Reverse-Primer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren TCACATGTGTGCGACAGGCAG</td><td></td></tr><tr><td>C-myc-Vorwärtsprimer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren</td><td>CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC</td></tr><tr><td>C-myc-Reverse-Primer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren</td><td>TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG</td></tr><tr><td>Nanog-Vorwärtsprimer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren</td><td>CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG</td></tr><tr><td>Nanog-Reverse-Primer-Sigma-Sequenz</td><td></td><td>in Kommentaren</td><td>GCAATGGATGCTGGGATACTC</td></tr><tr><td>Ecat1-Vorwärtsprimer</td><td></td><td>Sigma-Sequenz in Kommentaren angegeben</td><td>TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT</td></tr><tr><td>Ecat1 Reverse-Primer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren angegeben</td><td>ATGGGCCGCCATACGACGACGACGCTCAACT</td></tr><tr><td>Rex1 Vorwärtsprimer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren</td><td>gegeben ACGAGTGGCAGTTTTTCTTCTTGGGA</td></tr><tr><td>Rex1 Reverse-Primer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in Kommentaren</td><td>angegeben TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT</td></tr><tr><td>Alb Vorwärtsprimer</td><td>Sigma</td><td>in den Kommentaren angegebene Sequenz</td><td>GTTCGCTACACCCAGAAAGC</td></tr><tr><td>Alb umgekehrter Primer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in den Kommentaren</td><td>CCACACAAGGCAGTCTCTGA</td></tr><tr><td>Aat Vorwärtsprimer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in den Kommentaren</td><td>CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG</td></tr><tr><td>Aat umgekehrter Primer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in den Kommentaren</td><td>ATGGACAGTCTGGGGAAGTG</td></tr><tr><td>Trf vorwärts Primer</td><td>Sigma</td><td>in den Kommentaren angegebene Sequenz</td><td>ACCATGTTGTGGTGTCTCACGA</td></tr><tr><td>Trf reverse</td><td>Primer Sigma-Sequenz</td><td>in den Kommentaren</td><td>ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG</td></tr><tr><td>B Aktin-Vorwärtsprimer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in den Kommentaren</td><td>GACCTCTATGCCAACACAGT</td></tr><tr><td>B Aktin-reverser Primer</td><td>Sigma-Sequenz</td><td>in den Kommentaren angegeben</td><td>AGTACTTGCGCTCAGGAGGA</td></tr><tr><td>BD Cytofix-Fixierungspuffer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560585</tr><tr><td>1x BD Perm/Wash Puffer</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus OCT4-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Nanog-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>X100-Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen pAb anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>Anwendung in einer Konzentration von 3 μm; g/ml</td></tr><tr><td>Kaninchen pAb anti-SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>In einer Konzentration von 1 μm verwenden g/ml</td></tr><tr><td>Kaninchen pAb anti-Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892</td><td>Anwendung in einer Konzentration von 1 μm; g/ml</td></tr><tr><td>Maus mAb anti-SSEA1</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Anwendung in einer Konzentration von 20 μm; g/ml</td></tr><tr><td>Ziegen-pAb Anti-Kaninchen-IgG, markiert mit Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-165-003-JIR</td><td>Anwendung in einer Konzentration von 1/250</td></tr><tr><td>Ziegen-pAb-Anti-Maus-IgG, markiert mit Cy3</td>, <td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>115-165-003-JIR</td><td>Verwendung in einer Konzentration von 1/250</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT flüssiges Substratsystem</td><td>Sigma</td><td>B1911</td><td></td></tr><tr><td>Wässriges Eindeckmedium</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>AA433689M</td><td>Stammlösung beträgt 16%, verwenden Sie es bei 4</td></tr>%<tr><td>Hämatoxylin und Eosin</td><td>Sigma</td><td>GH53/HT110216 PAS-Färbung</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>395B</td><td></td></tr></tbody></table>

im lebenden organismus reprogrammierung adulter somatischer zellen zur pluripotenz durch Überexpression von yamanaka-faktoren

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die aus der Reprogrammierung somatischer Zellen in einen pluripotenten Zustand durch erzwungene Expression definierter Faktoren resultieren, bieten neue Möglichkeiten für die regenerative Medizin. Solche klinischen Anwendungen von iPS-Zellen waren bisher begrenzt, hauptsächlich aufgrund der geringen Effizienz der bestehenden Reprogrammierungsmethoden und des Risikos, dass die erzeugten iPS-Zellen bei der Implantation Tumore bilden.
Wir stellten die Hypothese auf, dass die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo durch Gentransfer von Reprogrammierungsfaktoren erreicht werden könnte. Um Zellen in vivo effizient reprogrammieren zu können, müssen hohe Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren von Yamanaka (OKSM) im Zielgewebe exprimiert werden. Dies kann durch die Verwendung unterschiedlicher viraler oder nicht-viraler Genvektoren je nach Zielgewebe erreicht werden. In dieser speziellen Studie wurde die hydrodynamische Schwanzvenen-Injektion (HTV) von Plasmid-DNA verwendet, um die OKSM-Faktoren an die Hepatozyten der Maus zu verabreichen. Dies lieferte den Beweis für die in vivo Reprogrammierung adulter, somatischer Zellen in einen pluripotenten Zustand mit hoher Effizienz und schneller Kinetik. Darüber hinaus wurde in situ keine Tumor- oder Teratombildung beobachtet.
Es kann gefolgert werden, dass die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo einen potenziellen Ansatz zur schnellen, effizienten und sicheren Induktion einer erhöhten Pluripotenz im Vergleich zu in vitro durchgeführten Protokollen bieten könnte und in Zukunft auf verschiedene Gewebetypen angewendet werden kann.

Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über das Verfahren, das die Genübertragung von OKSM-kodierenden Plasmiden in die Leber von Mäusen und die verschiedenen Techniken zur Beobachtung der in vivo-Zellreprogrammierung umfasst. Nach der HTV-Injektion der Plasmide wurde am zweiten Tag nach der Injektion ein signifikanter Anstieg der Genexpression der transfizierten Reprogrammierungsfaktoren (Oct3/4, Sox2, Klf4 und cMyc) auf mRNA-Ebene beobachtet. Die Expression dieser Faktoren nimmt im Verlauf der Zeit nach der Injektion ab, wie in Abbildung 2a dargestellt. Hinsichtlich der Expression endogener Pluripotenzmarker (Nanog, Ecat1 und Rex1) waren ihre Spiegel im Vergleich zu Hepatozyten von mit Kochsalzlösung behandelten Tieren am zweiten und vierten Tag nach der Injektion signifikant erhöht und kehrten ab dem achten Tag wieder auf Ausgangswerte zurück (Abbildung 2b). Gleichzeitig wurde die Dedifferenzierung der Hepatozytenpopulation durch die Herabregulation hepatocyten-spezifischer Gene (Alb, Aat und Trf) bestätigt, was am vierten Tag statistisch signifikant war und ab dem achten Tag wieder Ausgangswerte erreichte (Abbildung 2d).
Die Expression von Oct3/4 und Nanog auf Proteinebene wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht. Wie in Abbildung 2c gezeigt, wird nur Oct3/4 am Tag 1 nach HTV-Injektion exprimiert, während für die Expression des endogenen Pluripotenzmarkers Nanog bis zum Tag 4 gewartet werden musste.
Das Vorkommen einer in vivo-Zellreprogrammierung wurde weiterhin durch immunhistochemische Analyse von Lebergeweben mit Anti-OCT4-, Anti-SOX2- und Anti-Nanog-Antikörpern sowie durch spezifische Färbung der ALP-Aktivität bestätigt. Positive Zellen für alle Marker und die enzymatische Aktivität werden reproduzierbar in den Lebergeweben von OKSM-injizierten Tieren, jedoch nicht in den Kontrollen mit Salzlösungsinjektion gefunden (Abbildung 3).
Die möglichen toxischen Nebenwirkungen und die Teratombildung durch eine in vivo-Zellreprogrammierung mittels HTV-Injektion von pDNA wurden durch die Quantifizierung der Leberenzymwerte im Serum sowie durch H&amp;E- und PAS-Färbung von Lebergewebeschnitten über einen Zeitraum von 120 Tagen untersucht. Vorübergehende und nicht schwere Anzeichen von Gewebeschäden wurden bis zum Tag 2 beobachtet, danach jedoch nicht mehr. Während des gesamten Untersuchungszeitraums wurden keine Teratombildung oder Hinweise auf Dysplasie oder morphologische Veränderungen festgestellt (Abbildung 4). Es traten keine hepatischen strukturellen oder funktionellen Auffälligkeiten bei einem der Tiere während der Studie auf, was durch Albumin- und Leberenzymwerte sowie die Glykogenfärbung der Gewebeschnitte bestätigt wurde (Abbildungen 4b und c).
<img alt="Injektion von Faktoren zur In-vivo-Umprogrammierung, Mäusediagramm, Plasmid, Gewebeanalyse, PCR, Zytometrie." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Übersichtsschema des in-vivo-Umprogrammierungsverfahrens und dessen Analyse. Das Protokoll umfasst zwei Hauptphasen: (i) die Applikation von Umprogrammierungsfaktoren in vivo und (ii) die Gewebeentnahme sowie die Probenanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Analyse der Genexpression; Balkendiagramme mit relativen Expressionsergebnissen über Tage; Abbildungen a-d; wissenschaftliche Ergebnisse." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. In-vivo-Überexpression der Yamanaka-Transkriptionsfaktoren in der Leber erwachsener Mäuse. Balb/C-Mäuse erhielten eine HTV-Injektion mit 0,9 %iger Kochsalzlösung allein oder mit 75 μg pCX-OKS-2A und 75 μg pCX-cMyc in 0,9 %iger Kochsalzlösung. An den Tagen 2, 4, 8, 12 und 24 wurde eine RT-qPCR-Analyse von Hepatozyten durchgeführt, um die relative Genexpression von: (a) transfizierten Transkriptionsfaktoren (OKSM) und (b) endogenen Pluripotenzmarkern zu bestimmen; (c) Durchflusszytometrie-Analyse von OCT3/4-positiven und Nanog-positiven Zellen; (d) relative Genexpression von Hepatozytenmarkern, wie mittels RT-qPCR ermittelt. Alle Genexpressionswerte wurden auf die Gruppe mit Kochsalzlösung-HTV-Injektion normalisiert. (* p&lt;0,05 zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung HTV-injizierten Gruppen an, ermittelt durch Varianzanalyse und Tukey’s paarweisen Vergleich). Abbildung modifiziert nach Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig2large.jpg" target="_blank"> Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Vergleich der Immunfluoreszenzmikroskopie von OCT4, SOX2, NANOG in Saline- versus OKSM-behandelten Zellen." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. In-vivo-Zellreprogrammierung an erwachsenem Mauslebergewebe mittels Immunhistochemie. Balb/C-Mäuse wurden mittels HTV mit alleiniger 0,9%iger Saline oder mit 75 μg pCX-OKS-2A und 75 μg pCX-cMyc in 0,9%iger Saline injiziert. Am Tag 4 wurden die Lebern entnommen, und gefrorene Gewebeschnitte wurden mit Anti-OCT4-, Anti-SOX2- oder Anti-Nanog-Antikörpern zur Beurteilung der Immunreaktivität oder mit BCIP/NBT zur Bestimmung der ALP-Aktivität im Gewebe (40X) gefärbt. Maßstabsbalken entsprechen 100 μm. Abbildung modifiziert nach Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig3large.jpg" target="_blank"> Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Leberhistologie, Enzymspiegel und Albumin bei Behandlung mit Kochsalzlösung im Vergleich zu OKSM, Versuchsergebnisse." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4. Die Wirkung einer in vivo-Zellreprogrammierung auf die Leberfunktion und Histopathologie. Balb/C-Mäuse wurden mittels HTV entweder mit 75 μg pCX-OKS-2A und 75 μg pCX-cMyc in 0,9%iger Kochsalzlösung oder allein mit 0,9%iger Kochsalzlösung injiziert. An den Tagen 2, 4, 8, 12, 50 und 120 wurden Lebergewebe und Serum isoliert und analysiert hinsichtlich: (a) H&amp;E-Färbung; (b) Spiegel der Leberenzyme; (c) Spiegel von Albumin; (d) PAS-Färbung. Repräsentative Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie (10X) aufgenommen. Maßstabsbalken entsprechen 100 μm. Abbildung modifiziert nach Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.

Diese Studie zeigt die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo in Richtung Pluripotenz ohne die Erzeugung von Teratomen. Wir verwendeten eine hydrodynamische Schwanzveneninjektion von Plasmid-DNA, die für die Yamanka-Faktoren kodiert, um die in vivo Reprogrammierung von adulten Hepatozyten in Zellen mit erhöhter Pluripotenz zu induzieren.

im lebenden Organismus Reprogrammierung adulter somatischer Zellen zur Pluripotenz durch Überexpression von Yamanaka-Faktoren

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Reprogrammierung somatischer Zellen in Richtung Pluripotenz in ihrer in vivo Mikroumgebung zu induzieren und zu bewerten. Dies wird erreicht, indem eine Spritze mit Plasmid-DNAs, die für die Yamanaka-Faktoren kodieren, beladen und in einem zweiten Schritt hydrodynamisch in die Schwanzvene einer BC-Maus injiziert wird. Primäre Hepatozyten werden aus Lebergewebe isoliert und relevante Gen- und Proteinexpressionsniveaus werden durch Echtzeit-Q-R-T-P-C-R und Durchflusszytometrie untersucht.Anschließend wird das gesamte Lebergewebe geschnitten und mit verschiedenen Techniken gefärbt, um die Reprogrammierung des Gewebes zu bestätigen und die Toxizität des Verfahrens zu bewerten. Es werden Ergebnisse erzielt, die Unterschiede in der Gen- und Proteinexpression von Reprogrammierung, Pluripotenz und hepatozytenspezifischen Markern zeigen. Darüber hinaus ist die Sicherheit des Ansatzes auch mit biochemischen und histologischen Beweisen validiert.Der Hauptvorteil der Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo besteht darin, dass sie schnell, effizient und vorübergehend erfolgt. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Neuprogrammierung zu beantworten. Zum Beispiel die Ergebnisse der Induktion von Pluripotenz bei Erwachsenen in vivo.Um mit der Betäubung zu beginnen, wird eine sechs Wochen alte weibliche Bullby-Maus betäubt. Bereiten Sie dann eine Plasmid-DNA-Lösung ENC vor, die für die Yamanaka-Faktoren kodiert, und eine Kochsalzlösung, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Damit die Transfektion erfolgreich ist, injizieren Sie die gesamte Dosis in nicht mehr als fünf bis sieben Sekunden zu festgelegten Zeitpunkten nach der Injektion. Isolieren Sie die primären Hepatozyten, indem Sie die Brusthöhle freilegen und die Leber mit vorwarmem HBSS-Puffer perfundieren, und perforieren Sie dann das Leberverdauungsmedium 15 Minuten lang mit einer Flussrate von 0,6 Litern pro Minute, bis die Leber anschwillt und locker wird.Entfernen Sie dann die Leber mit einer Pinzette, nachdem Sie die Falor- und Koronarbänder durchtrennt haben. Weitere Informationen zur Isolierung von primären Leberzellen finden Sie in den Schritten in diesem zusätzlichen JoVE-Video. Waschen Sie anschließend die Leber mit Hepatozyten-Waschmedium, während Sie es durch ein 100-Mikron-Zellsieb führen.Um eine Zellsuspension zu erhalten, sammeln Sie die Zellsuspension in 50-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie das Volumen mit Hepatozyten-Waschmedium auf 15 Milliliter ein. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 G für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet.In 10 Millilitern Hepatozyten-Waschmedium sollte das Zellpellet vorsichtig suspendiert werden, da Hepatozyten sehr zerbrechliche Zellen sind. Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang insgesamt dreimal und suspendieren Sie das endgültige Pellet in 10 Millilitern Hepatozyten-Waschmedium. Schätzen Sie dann die Zellzahl mit einem Hämozytometer und einem optischen Mikroskop, um die Genexpression isolierter Hepatozyten zu untersuchen.Beginnen Sie damit, zweimal 10 bis zu den sechsten Zellen bei 300 mal G zu zentrifugieren und das Snat zu verwerfen. Extrahieren Sie dann die RNA mit einem Spin-Column-Kit aus den Zellen, indem Sie den Anweisungen des Lieferanten folgen. Als nächstes verwenden Sie ein Mikrogramm der extrahierten RNA aus der Behandlungs- und Kontrollgruppe, um eine zweistufige Q-R-T-P-C-R durchzuführen, um nach Veränderungen in den Werten der Reprogrammierungspluripotenz und der Hepatozytenmarker zu suchen.Um die erhöhte Pluripotenz von Zellen auf Proteinebene zu analysieren, nehmen Sie die isolierten Hepatozyten und stellen Sie die Dichte der Zellen auf eins mal 10 bis siebte Zellen pro Milliliter ein. Für die Durchflusszytometrie bereiten Sie 100 Mikroliter Aliquote der Zellsuspension vor und fixieren sie dann in 100 Mikrolitern BD-Zyto. Fixieren Sie den Fixationspuffer nach der Fixierung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, pelletieren Sie die Zellen und die Wiederbelebung, suspendieren Sie sie in 100 Mikrolitern eines X BD Permeationswaschpuffers, inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang, fügen Sie Raumtemperatur hinzu.Als nächstes inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit primären Antikörpern gegen Transkriptionsfaktoren, die in pluripotenten Zellen exprimiert werden. Dazu gehören entweder Anti-Maus T vier pro CP SCI 5.5 oder Anti-US-Nag Pe. Achten Sie darauf, auch Negativ- und Isotypkontrollen einzubeziehen.Analysieren Sie dann vier Tage nach der Injektion des Plasmid-DNA-Kryoschnitts die gefärbten Zellen im Durchflusszytometer mit CP sci 5,5 und PE-Kanälen, der Leber, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Anschließend werden die Methanol-fixierten Abschnitte in einem Blockpuffer bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert, gefolgt von zwei Waschschritten für jeweils fünf Minuten mit Waschpuffer. Fügen Sie als Nächstes Anti-T, vier, Anti-Socken, zwei und Anti-Nag-Primärantikörper auf separate Objektträger hinzu und achten Sie darauf, dass das Lebergewebe vollständig bedeckt ist.Decken Sie die Proben bis zur vorbeugenden Aberration ab und inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit Waschpuffer. Anschließend inkubieren Sie sie nach der Inkubation 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur mit ihren jeweiligen Sekundärantikörpern.Waschen Sie die Leberabschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS. Montieren Sie sie in Dappy Anti Fade Medium und schützen Sie sie mit Deckgläsern. Visualisieren Sie dann die Objektträger mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop.Erwärmen Sie die Kryoschnitte 15 Minuten lang auf Raumtemperatur und fixieren Sie sie zwei Minuten lang mit 4%Paraformaldehyd. Trocknen Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang an der Luft. Nach dem Trocknen werden die Schnitte 30 Minuten lang mit flüssigem Substrat B-C-I-P-N-B-T bei 37 Grad Celsius inkubiert.Während dieser Zeit reagiert die Lösung mit der alkalischen Phosphatase im Gewebe und bildet einen unlöslichen Niederschlag, der mikroskopisch sichtbar ist. Waschen Sie die Objektträger nach 30 Minuten mit destilliertem Wasser und montieren Sie sie mit wässrigem Eindeckmedium. Nehmen Sie dann Bilder mit Lichtmikroskopie an den Tagen 4, 8, 12 und 120 auf.Entnehmen Sie nach der Transfektion 300 Mikroliter Blut direkt aus der Herzkammer. Halten Sie das Blut auf Eis, während die verschiedenen Proben entnommen werden, damit es nicht zu früh gerinnt. Sobald alle Proben entnommen sind, inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius oder bis das Blut gerinnt.Dann zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 2000 g und pipettieren das Serum vorsichtig in ein neues Einor-Röhrchen. Analysieren Sie dann die Serumspiegel auf Albumin und die Leberenzyme, A-L-T-A-S-T-A-L-P und GLDH mit einem Spektralphotometer. Neben dem Screening des Blutes zur Beurteilung der Lebertoxizität sollten auch in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte vorbereitet werden, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.Anschließend färben Sie das Gewebe mit H- und D- oder PIS-Färbung und analysieren Sie die aufgenommenen Bilder. Lichtmikroskopie nach hydrodynamischer Schwanzveneninjektion der Plasmide, eine signifikante Erhöhung der Genexpression der transfizierten Reprogrammierungsfaktoren. T drei, vier Socken, zwei und CMIC auf mRNA-Ebene wurden am zweiten Tag nach der Injektion beobachtet.Die Expression dieser Faktoren nimmt mit der Zeit nach der Injektion ab. Die endogenen Pluripotenzmarker, nano g ECAT one und REX one, oder auch signifikant hochreguliert im Vergleich zu denen in Hepatozyten von Tieren, die am zweiten und vierten Tag nach der Injektion in Kochsalzlösung injiziert wurden, und waren ab dem achten Tag wieder auf dem Ausgangsniveau. Gleichzeitig wurde die Dedifferenzierung der Hepatozytenpopulation durch die Herunterregulierung der hepatozytenspezifischen Gene A-L-B-A-A-T und TRF bestätigt, die am vierten Tag statistisch signifikant waren und ab dem achten Tag die Ausgangswerte erreichten.Auch die Expression von T, drei, vier und nag auf Proteinebene wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht, wie hier gezeigt. Nur OC drei vier wird am ersten Tag exprimiert. Nach der HTV-Injektion musste für die Expression des endogenen Pluripotenzmarkers nano G bis zum vierten Tag gewartet werden.Das Auftreten einer in vivo Zellreprogrammierung wurde durch immunhistochemische Analysen von Lebergeweben weiter bestätigt. Positive Zellen für alle Marker und enzymatische Aktivität finden sich reproduzierbar im Lebergewebe von KSM-injizierten Tieren, nicht jedoch in den mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollen. Die H- und E- und PAS-Färbung zeigt vorübergehende, aber nicht schwerwiegende Anzeichen von Gewebeschäden, die sich nach dem zweiten Tag aufgelöst haben.Während des Zeitraums der Studie wurde keine Bildung von Teratomen oder Anzeichen von Dysplasie oder morphologischen Veränderungen beobachtet. Es gab auch keine Leberfunktionsanomalien während des gesamten Verlaufs der Studie bei einem der Tiere, was durch die hier gezeigten Albumin- und Leberenzymwerte bestätigt wurde. Diese Studie liefert den Beweis für den prinzipiellen Beweis der in vivo Zellreprogrammierung in Richtung Pluripotenz.Dies geschah schnell, transitiv und effizient nach der Verabreichung der Yamanaka-Faktoren. Wir stellten die Hypothese auf, dass in vivo Reprogrammierung in anderen Geweben als der Leber erreicht werden kann, vorausgesetzt, dass ein adäquates Gen vorhanden ist. Lebervektoren sind so konzipiert, dass sie das Zielgewebe transfizieren.Darüber hinaus könnte es mit verbesserten Protokollen und Technologien möglich sein, die in vivo Programmzellen zu extrahieren, um sie für weitere Studien zu verwenden.

in-vivo-reprogramming-adult-somatic-cells-to-pluripotency

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

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Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Verfügbarkeit von somatischen SCs ist entscheidend für die regenerative Medizin Krankheit Modellierung und Einblick in SC Eigenschaften. Hier präsentieren wir experimentelle Strategien reprogram, in Vitro unterscheiden sich adulte Zellen in ihre entsprechenden erweiterbar gewebespezifische Stammzellen/Progenitor-Zellen durch die transiente Expression die transkriptionelle Coaktivator YAP.

De Novo Generation von somatischen Stammzellen von YAP/TAZ

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

Erfahren Sie die Reprogrammierung adulter Hepatozyten zur Pluripotenz in vivo durch hydrodynamische Injektion von Yamanaka-Faktoren. Diese Methode ermöglicht effiziente und sichere Zellreprogrammierung ohne Teratombildung.

im lebenden Organismus Reprogrammierung adulter somatischer Zellen zur Pluripotenz durch Überexpression von Yamanaka-Faktoren

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