im lebenden Organismus Reprogrammierung adulter somatischer Zellen zur Pluripotenz durch Überexpression von Yamanaka-Faktoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Reprogrammierung somatischer Zellen in Richtung Pluripotenz in ihrer in vivo Mikroumgebung zu induzieren und zu bewerten. Dies wird erreicht, indem eine Spritze mit Plasmid-DNAs, die für die Yamanaka-Faktoren kodieren, beladen und in einem zweiten Schritt hydrodynamisch in die Schwanzvene einer BC-Maus injiziert wird. Primäre Hepatozyten werden aus Lebergewebe isoliert und relevante Gen- und Proteinexpressionsniveaus werden durch Echtzeit-Q-R-T-P-C-R und Durchflusszytometrie untersucht.

Anschließend wird das gesamte Lebergewebe geschnitten und mit verschiedenen Techniken gefärbt, um die Reprogrammierung des Gewebes zu bestätigen und die Toxizität des Verfahrens zu bewerten. Es werden Ergebnisse erzielt, die Unterschiede in der Gen- und Proteinexpression von Reprogrammierung, Pluripotenz und hepatozytenspezifischen Markern zeigen. Darüber hinaus ist die Sicherheit des Ansatzes auch mit biochemischen und histologischen Beweisen validiert.

Der Hauptvorteil der Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo besteht darin, dass sie schnell, effizient und vorübergehend erfolgt. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Neuprogrammierung zu beantworten. Zum Beispiel die Ergebnisse der Induktion von Pluripotenz bei Erwachsenen in vivo.

Um mit der Betäubung zu beginnen, wird eine sechs Wochen alte weibliche Bullby-Maus betäubt. Bereiten Sie dann eine Plasmid-DNA-Lösung ENC vor, die für die Yamanaka-Faktoren kodiert, und eine Kochsalzlösung, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Damit die Transfektion erfolgreich ist, injizieren Sie die gesamte Dosis in nicht mehr als fünf bis sieben Sekunden zu festgelegten Zeitpunkten nach der Injektion. Isolieren Sie die primären Hepatozyten, indem Sie die Brusthöhle freilegen und die Leber mit vorwarmem HBSS-Puffer perfundieren, und perforieren Sie dann das Leberverdauungsmedium 15 Minuten lang mit einer Flussrate von 0,6 Litern pro Minute, bis die Leber anschwillt und locker wird.

Entfernen Sie dann die Leber mit einer Pinzette, nachdem Sie die Falor- und Koronarbänder durchtrennt haben. Weitere Informationen zur Isolierung von primären Leberzellen finden Sie in den Schritten in diesem zusätzlichen JoVE-Video. Waschen Sie anschließend die Leber mit Hepatozyten-Waschmedium, während Sie es durch ein 100-Mikron-Zellsieb führen.

Um eine Zellsuspension zu erhalten, sammeln Sie die Zellsuspension in 50-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie das Volumen mit Hepatozyten-Waschmedium auf 15 Milliliter ein. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 G für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet.

In 10 Millilitern Hepatozyten-Waschmedium sollte das Zellpellet vorsichtig suspendiert werden, da Hepatozyten sehr zerbrechliche Zellen sind. Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang insgesamt dreimal und suspendieren Sie das endgültige Pellet in 10 Millilitern Hepatozyten-Waschmedium. Schätzen Sie dann die Zellzahl mit einem Hämozytometer und einem optischen Mikroskop, um die Genexpression isolierter Hepatozyten zu untersuchen.

Beginnen Sie damit, zweimal 10 bis zu den sechsten Zellen bei 300 mal G zu zentrifugieren und das Snat zu verwerfen. Extrahieren Sie dann die RNA mit einem Spin-Column-Kit aus den Zellen, indem Sie den Anweisungen des Lieferanten folgen. Als nächstes verwenden Sie ein Mikrogramm der extrahierten RNA aus der Behandlungs- und Kontrollgruppe, um eine zweistufige Q-R-T-P-C-R durchzuführen, um nach Veränderungen in den Werten der Reprogrammierungspluripotenz und der Hepatozytenmarker zu suchen.

Um die erhöhte Pluripotenz von Zellen auf Proteinebene zu analysieren, nehmen Sie die isolierten Hepatozyten und stellen Sie die Dichte der Zellen auf eins mal 10 bis siebte Zellen pro Milliliter ein. Für die Durchflusszytometrie bereiten Sie 100 Mikroliter Aliquote der Zellsuspension vor und fixieren sie dann in 100 Mikrolitern BD-Zyto. Fixieren Sie den Fixationspuffer nach der Fixierung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, pelletieren Sie die Zellen und die Wiederbelebung, suspendieren Sie sie in 100 Mikrolitern eines X BD Permeationswaschpuffers, inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang, fügen Sie Raumtemperatur hinzu.

Als nächstes inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit primären Antikörpern gegen Transkriptionsfaktoren, die in pluripotenten Zellen exprimiert werden. Dazu gehören entweder Anti-Maus T vier pro CP SCI 5.5 oder Anti-US-Nag Pe. Achten Sie darauf, auch Negativ- und Isotypkontrollen einzubeziehen.

Analysieren Sie dann vier Tage nach der Injektion des Plasmid-DNA-Kryoschnitts die gefärbten Zellen im Durchflusszytometer mit CP sci 5,5 und PE-Kanälen, der Leber, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Anschließend werden die Methanol-fixierten Abschnitte in einem Blockpuffer bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert, gefolgt von zwei Waschschritten für jeweils fünf Minuten mit Waschpuffer. Fügen Sie als Nächstes Anti-T, vier, Anti-Socken, zwei und Anti-Nag-Primärantikörper auf separate Objektträger hinzu und achten Sie darauf, dass das Lebergewebe vollständig bedeckt ist.

Decken Sie die Proben bis zur vorbeugenden Aberration ab und inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit Waschpuffer. Anschließend inkubieren Sie sie nach der Inkubation 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur mit ihren jeweiligen Sekundärantikörpern.

Waschen Sie die Leberabschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS. Montieren Sie sie in Dappy Anti Fade Medium und schützen Sie sie mit Deckgläsern. Visualisieren Sie dann die Objektträger mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop

Erwärmen Sie die Kryoschnitte 15 Minuten lang auf Raumtemperatur und fixieren Sie sie zwei Minuten lang mit 4%Paraformaldehyd. Trocknen Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang an der Luft. Nach dem Trocknen werden die Schnitte 30 Minuten lang mit flüssigem Substrat B-C-I-P-N-B-T bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Während dieser Zeit reagiert die Lösung mit der alkalischen Phosphatase im Gewebe und bildet einen unlöslichen Niederschlag, der mikroskopisch sichtbar ist. Waschen Sie die Objektträger nach 30 Minuten mit destilliertem Wasser und montieren Sie sie mit wässrigem Eindeckmedium. Nehmen Sie dann Bilder mit Lichtmikroskopie an den Tagen 4, 8, 12 und 120 auf.

Entnehmen Sie nach der Transfektion 300 Mikroliter Blut direkt aus der Herzkammer. Halten Sie das Blut auf Eis, während die verschiedenen Proben entnommen werden, damit es nicht zu früh gerinnt. Sobald alle Proben entnommen sind, inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius oder bis das Blut gerinnt.

Dann zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 2000 g und pipettieren das Serum vorsichtig in ein neues Einor-Röhrchen. Analysieren Sie dann die Serumspiegel auf Albumin und die Leberenzyme, A-L-T-A-S-T-A-L-P und GLDH mit einem Spektralphotometer. Neben dem Screening des Blutes zur Beurteilung der Lebertoxizität sollten auch in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte vorbereitet werden, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Anschließend färben Sie das Gewebe mit H- und D- oder PIS-Färbung und analysieren Sie die aufgenommenen Bilder. Lichtmikroskopie nach hydrodynamischer Schwanzveneninjektion der Plasmide, eine signifikante Erhöhung der Genexpression der transfizierten Reprogrammierungsfaktoren. T drei, vier Socken, zwei und CMIC auf mRNA-Ebene wurden am zweiten Tag nach der Injektion beobachtet.

Die Expression dieser Faktoren nimmt mit der Zeit nach der Injektion ab. Die endogenen Pluripotenzmarker, nano g ECAT one und REX one, oder auch signifikant hochreguliert im Vergleich zu denen in Hepatozyten von Tieren, die am zweiten und vierten Tag nach der Injektion in Kochsalzlösung injiziert wurden, und waren ab dem achten Tag wieder auf dem Ausgangsniveau. Gleichzeitig wurde die Dedifferenzierung der Hepatozytenpopulation durch die Herunterregulierung der hepatozytenspezifischen Gene A-L-B-A-A-T und TRF bestätigt, die am vierten Tag statistisch signifikant waren und ab dem achten Tag die Ausgangswerte erreichten.

Auch die Expression von T, drei, vier und nag auf Proteinebene wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht, wie hier gezeigt. Nur OC drei vier wird am ersten Tag exprimiert. Nach der HTV-Injektion musste für die Expression des endogenen Pluripotenzmarkers nano G bis zum vierten Tag gewartet werden.

Das Auftreten einer in vivo Zellreprogrammierung wurde durch immunhistochemische Analysen von Lebergeweben weiter bestätigt. Positive Zellen für alle Marker und enzymatische Aktivität finden sich reproduzierbar im Lebergewebe von KSM-injizierten Tieren, nicht jedoch in den mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollen. Die H- und E- und PAS-Färbung zeigt vorübergehende, aber nicht schwerwiegende Anzeichen von Gewebeschäden, die sich nach dem zweiten Tag aufgelöst haben.

Während des Zeitraums der Studie wurde keine Bildung von Teratomen oder Anzeichen von Dysplasie oder morphologischen Veränderungen beobachtet. Es gab auch keine Leberfunktionsanomalien während des gesamten Verlaufs der Studie bei einem der Tiere, was durch die hier gezeigten Albumin- und Leberenzymwerte bestätigt wurde. Diese Studie liefert den Beweis für den prinzipiellen Beweis der in vivo Zellreprogrammierung in Richtung Pluripotenz.

Dies geschah schnell, transitiv und effizient nach der Verabreichung der Yamanaka-Faktoren. Wir stellten die Hypothese auf, dass in vivo Reprogrammierung in anderen Geweben als der Leber erreicht werden kann, vorausgesetzt, dass ein adäquates Gen vorhanden ist. Lebervektoren sind so konzipiert, dass sie das Zielgewebe transfizieren.

Darüber hinaus könnte es mit verbesserten Protokollen und Technologien möglich sein, die in vivo Programmzellen zu extrahieren, um sie für weitere Studien zu verwenden.