Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung von Phänotypmodulatoren wie dem Silencing von Wirtsgenen oder dem Einfluss kleiner Moleküle auf Mycobacterium tuberculosis und die intrazelluläre Replikation zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst kleine Moleküle und 384-Well-Platten dispensiert oder Zellen mit irna durchtrennt und in einen Komplex transfiziert werden. Der nächste Schritt besteht darin, Zellen mit grün fluoreszierendem Protein zu infizieren, das Mycobacterium tuberculosis oder G-F-P-M-T-B exprimiert, Zellen in das kleine Molekül mit Vertiefungen zu geben und die Mikroplatte fünf Tage lang zu inkubieren.

Für den RNAi-Ansatz fügen Sie Zellen in einen RNAi-transfiktierten Komplex hinzu, der Vertiefungen enthält. Inkubieren Sie die Mikroplatte drei Tage lang und infizieren Sie dann die Zellen mit G-F-P-M-T-B, das Mycobacterium tuberculosis exprimiert. Nach der Färbung der Zellen erfolgt der letzte Schritt darin, die Platten mit einem automatisierten Konfokalmikroskop abzulesen.

Letztendlich wird eine automatisierte Fluoreszenzmikroskopie mit anschließender bildbasierter Analyse verwendet, um die Veränderungen des intrazellulären G-F-P-M-T-V-Wachstums zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik der bestehenden Methode wie der Koloniebildung bei der Uni-Jagd besteht darin, dass sie eine lange Inkubationszeit spart und einen höheren Durchsatz ermöglicht. Dieses Verfahren wird von Christophe Keval oder SONG und drei Postdoktoranden aus meinem Forschungsteam demonstriert.

Die Protokolle für das SI-RNA-Bibliotheksscreening und das Screening von Verbindungsbibliotheken verwenden zwei Wochen alte GFP-exprimierende MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV-Kulturen. Zur Herstellung der G-F-P-M-T-B-Bakteriensuspension wird die Kultur zunächst fünf Minuten lang bei 4.000 g zentrifugiert, dann wird der Überstand Resus verworfen, die Kultur in DPBS suspendiert und auf diese Weise erneut zentrifugiert. Waschen Sie die Kultur dreimal mit DPBS.

Nach der dritten Wäsche entsorgen Sie das Supernat und resuspendieren das Bakterienpellet in 10 Millilitern 10 % FBS, das RPMI 1640 Medium enthält. Lassen Sie die Suspension eine Stunde lang bei Raumtemperatur, damit sich die Bakterienaggregate absetzen können. Sammeln Sie das bakterielle Supernat und messen Sie die OD bei 600 Nanometern und GFP-Fluoreszenz.

Mit einem Mikroplatten-Reader zur Bestimmung der Bakterienkonzentration sollte der OD bei 600 Nanometern zwischen 0,6 und 0,8 liegen. Berechnen Sie den Titer der Suspension anhand einer Referenzregressionsgeraden, wobei der RFU-Wert als Funktion des CFU-Werts angezeigt wird, der vor den Experimenten an einer anderen Kultur erzeugt wurde, die unter denselben Bedingungen hergestellt wurde. Eine typische Konzentration liegt bei eins mal 10 bis acht Bakterien pro Milliliter.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die getrocknete SI-RNA-Bibliothek, die in 96 gespeichert ist, mit Resus suspendieren. Bohren Sie die Mutterplatten mit einem X-S-I-R-N-A-Puffer auf eine Konzentration von zwei Mikromolaren. Übertragen Sie 10 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung einer 384-Well-Tochterplatte, übertragen Sie 2,5 Mikroliter SI-RNA aus jeder Vertiefung der Tochterplatte in eine 384-Well-Assay-Platte auf dieselbe Assay-Platte.

Geben Sie jeweils 2,5 Mikroliter einer negativen und einer positiven Kontroll-IRNA in ihre jeweiligen Vertiefungen. Wenn die Tochterplatte nicht verwendet wird, versiegeln Sie sie sofort mit einer abziehbaren Aluminiumdichtung. Die versiegelte Platte kann bei minus 20 Grad Celsius mindestens sechs Monate und je nach IRNA bis zu zwei bis drei Jahre gelagert werden.

Empfehlungen des Bibliotheksherstellers. Bereiten Sie die Transfektionsreagenzien vor, indem Sie sie in einem X-D-P-B-S verdünnen, um genügend Lösung zu erhalten, um jeweils 0,1 Mikroliter zu erhalten. Die verdünnte Transfektionslösung wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur vorinkubiert.

Geben Sie 7,5 Mikroliter der verdünnten Transfektionslösung in jede Vertiefung der 384-Well-Assay-Platte und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in jede Vertiefung der Assay-Platte bei 40 Mikrolitern menschlicher Pneumozyten vom Typ 2, A 5 4 9 Zellen, die in RPMI 1640-Medium suspendiert sind, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum. Halten Sie die Zellen für eine dreitägige Inkubationszeit bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid enthält. Diese Zellen teilen sich alle 24 Stunden, so dass sich drei Tage nach der Transfektion etwa 12.000 Zellen in jeder Vertiefung befinden.

Drei Tage nach si. Die RNA-Transfektion von 5 49 Zellen stellt eine MTBH 37 RV GFP-Bakteriensuspension her. Wie bereits gezeigt.

Die Suspension sollte 2,4 mal 10 bis sechs Bakterien pro Milliliter enthalten, was einer Infektionsmehrheit von fünf entspricht. Entfernen Sie das Medium aus der 384-Well-Assay-Platte und fügen Sie 25 Mikroliter der Bakteriensuspension pro Well hinzu. Die 384-Well-Assay-Platte wird fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Nach fünf Stunden. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit RPMI-Medium, das mit 10 % FBS ergänzt ist, um die verbleibenden extrazellulären Bakterien abzutöten. Behandeln Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 50 Mikrolitern.

Ein frisches R-P-M-I-F-B-S-Medium, das 50 Mikrogramm Amikacin pro Milliliter enthält. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid enthält. Entfernen Sie zuletzt das Amikacin-haltige Medium und fügen Sie 50 Mikroliter frisches RPMI-Medium hinzu, das mit 10% FBS pro Person ergänzt wird. Brunnen.

Die Assay-Platte wird fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubiert, bevor das Screening durch konfokale Mikroskopie erfolgt. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Sie eine 384-Well-Mutterplatte auf, die die in 100 %DMSO solubilisierte Verbindungsbibliothek enthält, und übertragen Sie 0,5 Mikroliter der Verbindungen von der Mutterplatte auf eine 384-Well-Tochterplatte, die 10 Mikroliter RPMI 1640 pro Vertiefung enthält. Medium, ergänzt mit 10% FPS, nächste Ernte sechs Tage alte primäre menschliche Makrophagen bei viermal 10 zu den fünf Zellen pro Milliliter in RPMI 1640.

Medium ergänzt mit 10% FPS und 50 Nanogramm pro Milliliter. Rekombinante humane MCSF inkubieren die verdünnten Primärzellen mit Basien bei verschiedenen MOIs von eins bis fünf in Suspension mit leichtem Schütteln bei 90 U/min für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die infizierten Zellen durch Zentrifugation bei 350 GS für fünf Minuten, um die extrazellulären Bakterien zu entfernen.

Beatmung der Pellets in RPMI 1640. Medium ergänzt mit 10% FPS und Zentrifuge. Wiederholen Sie dies erneut, waschen Sie es zweimal nach der letzten Wäsche.

Die Reanimation suspendiert die infizierten Zellen in RPMI 1640 Medium, das mit 10 % FBS und 50 Mikrogramm pro Milliliter ergänzt wird. Amikacin inkubiert die Suspension unter leichtem Schütteln für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und zentrifugiert bei 350 GS für fünf Minuten. Entfernen Sie das Amikacin-haltige Medium und waschen Sie die infizierten Zellen mit vollständigem RPMI 1640.

Medium ergänzt mit 10% FBS und 50 Nanogramm pro Milliliter. Rekombinante humane MCSF. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal.

Geben Sie 40 Mikroliter der infizierten Makrophagensuspension pro Vertiefung in dieselbe zuvor vorbereitete 384-Well-Assay-Platte, die bereits 10 Mikroliter der Verdünnungen der Verbindung enthält. Die endgültige Konzentration von DMSO in jeder Vertiefung beträgt nun 1 %Inkubieren Sie die Assay-Platten fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid enthält, bevor Sie sie durch konfokale Mikroskopie für die SI-RNA-Bibliothek untersuchen. Screening vor der Bildaufnahme: Geben Sie in jede Vertiefung der Assay-Platte 10 Mikroliter frisch zubereitete 30 Mikrogramm pro Milliliter DPI in PBS und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Für das Screening von Verbindungen Vor der Bildaufnahme färben Sie die lebenden Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit zellpermeiertem farrotem Fluoreszenzfarbstoff. Laden Sie die Assay-Platten in ein automatisiertes konfokales Mikroskop. Stellen Sie die Belichtungsparameter ein: Erfassen Sie die DPI-Fluoreszenz mit einem Anregungslaser bei 405 Nanometern und einem Emissionsfilter bei 450 Nanometern.

Aufzeichnung der GFP-Fluoreszenz mit einem Anregungslaser bei 488 Nanometern und einem Emissionsfilter bei 520 Nanometern. Wählen Sie die Wells und die Felder an jedem Well aus, die erfasst werden sollen, die dann als Layouts und Unterlayouts bezeichnet werden. Parameter generiert die Experimentdatei mit den eingestellten Parametern und führt die automatische Erfassung aus.

In diesem Fall werden vier verschiedene Bilder desselben Wells und Feldes aufgezeichnet und übertragen Bilder an einen Remote-Server. Anschließend werden die Bilder mit der Bildanalysesoftware acapella 2.6 für das SI-RNA-Screening ausgewertet. Jedes Feld enthält zwei Kanäle oder Farben.

Grün für die Bakterien und Blau für die Zelle. Zellkerne detektieren Zellkerne aus dem DAPI-Kanal mit einem Zellkerndetektionsalgorithmus und den Bakterienbereich aus dem GFP-Kanal mit einem Algorithmus für Pixelintensitätseigenschaften. Durch das Zusammenführen der Kanäle und das Zählen der Anzahl der Pixel, die sowohl von Bakterien als auch von Zellen geteilt werden, wird die Anzahl der intrazellulären Bakterien quantifiziert.

Die Endergebnisse, ausgedrückt als Durchschnitt der vier Felder, sind die gesamte Bakterienfläche, die Gesamtzahl der Zellen, der Prozentsatz der infizierten Zellen und die Bakterienfläche pro Zelle. Für das Screening von Verbindungen enthält jedes Feld zwei Kanäle oder Farben, grün für die Bakterien und dunkelrot für die Zelle. Zellkerne und Zytoplasma detektieren den Zellbereich aus dem fernen roten Kanal und den bakteriellen Bereich aus dem GFP-Kanal unter Verwendung eines Algorithmus für Pixelintensitätseigenschaften.

Durch das Zusammenführen der Kanäle und das Zählen der Anzahl der Pixel, die sowohl von Bakterien als auch von Zellkernen geteilt werden, wird das intrazelluläre Bakterium quantifiziert. Die Endergebnisse, ausgedrückt als Durchschnitt der vier Felder, sind die Gesamtbakterienfläche, die Gesamtzellfläche, die Gesamtfläche der intrazellulären Bakterien und das Verhältnis zwischen der intrazellulären Bakterienfläche und der Gesamtfläche der Zellen. Repräsentative Ergebnisse aus dem genomweiten Hochdurchsatz-SI-RNA-Screening werden hier vorgestellt, wobei die Stummschaltung der Expression von Din One mit SI-RNA zu einer Abnahme der intrazellulären Mykobakterienmenge in 5 49 Zellen führte.

Wie in diesen repräsentativen konfokalen Bildern von 5 49 Zellen gezeigt, die mit Nicht-Ziel-IRNA oder mit SI-RNA, spezifisch für din eins, transfiziert und mit GFP infiziert wurden, exprimieren Sie MTB für fünf Tage. GFP MT BH 37 RV wurde in grün und die Zellen in rot dargestellt. Die Anzahl der Zellen und die intrazelluläre G-F-P-M-T-B-H 37 RV-Last wurden mit Hilfe einer bildbasierten Analysesoftware bestimmt.

Dieses Diagramm zeigt den Prozentsatz der infizierten a 5 49 Zellen in fünf Replikaten von Scramble IRNA, dargestellt durch blaue Kreise und din eine IRNA, dargestellt durch rote Kreise. Nach drei Tagen Silencing und fünf Tagen Infektion ist der Prozentsatz der infizierten Zellen bei 5 bis 49 Zellen um die Hälfte reduziert, verglichen mit Zellen, die mit Non-Target-Scramble-IRNA transfiziert wurden. Zur Definition des Z-Scores wurde eine probenbasierte Normalisierung der SI-RNA mit dem Ziel von DIN eins im Vergleich zu Scramble angewendet.

Ein Z-Score-Durchschnitt um -15 wurde für SI erhalten, ein gezielter DIN-Durchschnitt. Die drei Sternchen stehen für einen P-Wert von weniger als 0,0001. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DIN eins als Positivkontrolle für das si verwendet werden kann, ein Screening zur Entdeckung anderer neuer Wirtsfaktoren, die an der MTB-Besiedlung beteiligt sind, und Pneumozyten, die den gleichen Phänotyp wie der mit dins IRNA im Screening von hochgehaltenen Verbindungen aufweisen könnten.

Die Wirksamkeit von Verbindungen auf das intrazelluläre Bakterienwachstum wurde durch die Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve (DRC) und die Normalisierung auf die positiven und negativen Referenzverbindungen bewertet. In diesem Beispiel wurden humane primäre Makrophagen, die mit einem GFP-exprimierenden MTBH 37 RV-Stamm infiziert waren, mit 1 %DMSO als Negativkontrolle oder mit steigenden Konzentrationen von zwei Referenzverbindungen, isid, INH und Rifampicin, inkubiert. RIF. Die Makrophagen sind mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert und die grüne Farbe zeigt an, dass die MTB-Analyse der konfokalen Fluoreszenzbilder der infizierten menschlichen Makrophagen zeigte, dass die Wirkstoffe die intrazelluläre Replikation von MTB in Wirtszellen beeinflussen, was zu einer Abnahme der mykobakteriellen Last führt, die der Fläche des GFP-Signals in den Zellen entspricht.

Das Verhältnis zwischen der intrazellulären Bakterienfläche und der Gesamtzellfläche wurde berechnet und dann als Funktion der Verbindungskonzentration aufgetragen, um den DRC zu erzeugen, der hier gezeigt wird, sind die DRCs von isid und rifampicin in jedem Diagramm. Die DRC der Verbindung wurde auf 1 %DMSO, die Negativkontrolle, und 0,1 Mikrogramm pro Milliliter ist die Positivkontrolle normalisiert. Diese Kurven ermöglichen die Bestimmung sowohl der Konzentration, die erforderlich ist, um 50 % der Bakterienbesiedlung zu hemmen, als auch der minimalen Konzentration, die erforderlich ist, um 99 % der bakteriellen Replikation zu hemmen. Ein Semester.

Diese Technik kann in 10 Stunden durchgeführt werden, die wie folgt aufgeteilt sind: zwei Stunden für die Zelltransfektion oder die Herstellung von Verbindungen, sechs Stunden für die Zellinfektion und die Abgabe in Mikrotiterplatten und zwei Stunden für die Aufrechterhaltung einer Bildaufnahme. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mycobacterium tuberculosis über einen Zeitraum von acht Tagen äußerst künstlerisch sein kann und dass frühreif, wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich einer Maske, während dieser Prozedur immer mitgenommen werden sollte.