Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Ebenen des Eises sichtbar zu machen, die durch fluoreszenzmarkierte Frostschutzproteine gebunden sind. Dies wird erreicht, indem einzelne Eiskristalle gezüchtet werden, an die die Frostschutzproteine in einem zweiten Schritt binden können. Jeder Kristall wird durch gekreuzte Polarisatoren betrachtet, um seine Singularität und Ausrichtung zu bestimmen.

Als nächstes wird ein Eiskristall auf einen temperaturgesteuerten kalten Finger montiert und zu einer Halbkugel geformt. Es wird dann in eine Lösung aus fluoreszenzmarkierten Frostschutzproteinen getaucht, um das Frostschutzprotein auf spezifischen Bindungsebenen der wachsenden Hemisphäre zu absorbieren. Eisergebnisse werden durch Visualisierung und Abbildung von Eis erhalten, das durch fluoreszenzmarkiertes Frostschutzprotein gebunden ist, unter Verwendung von wellenlängenspezifischem Licht und Filtern in einem abgedunkelten Kühlraum.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Eisätzen besteht darin, dass die Frostschutzproteine fluoreszenzmarkiert sind. Um eine sofortige Visualisierung der proteingebundenen Eisebenen zu ermöglichen. Beginnen Sie mit der Kristallzüchtung, indem Sie ein temperaturgesteuertes Ethylenglykolbad bei minus 0,5 Grad Celsius vorbereiten und eine saubere Metallpfanne finden, die hineinpasst und darauf schwimmen kann. Die Kristalle werden in Formen geformt. Verwenden Sie zylindrische Formen, die drei bis vier Zentimeter hoch aus einem Polyvinylchloridrohr geschnitten sind.

Jede Form sollte auf einer Seite eine einen Millimeter breite und zwei Millimeter hohe Kerbe haben. Tragen Sie einen leichten Film aus Vakuumfett auf die Seite des Rings auf, aus der die Kerbe geschnitten wurde. Versiegeln Sie diese gefettete gekerbte Oberfläche auf der Metallpfanne, wobei die Kerbe von der Mitte der Pfanne weg ausgerichtet ist.

Achten Sie darauf, die Kerben nicht mit Fett zu füllen oder zu verstopfen. Bereiten Sie so viele Formen vor, wie in die Pfanne passen. Geben Sie als Nächstes gefilterte Entgasung und entionisiertes Wasser in die Mitte der Pfanne außerhalb der Formen.

Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Wenn die Wasserschicht auf fünf Millimeter angehoben wird, sollte das Wasser langsam durch die Kerben in die Formen eindringen. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie die Pfanne perfekt waagerecht in das Ethylenglykolbad.

Nachdem die Pfanne und das Wasser minus 0,5 Grad Celsius erreicht haben, geben Sie ein kleines Stück Eis in die Mitte der Pfanne außerhalb der Formen. Über Nacht inkubieren, um in den nächsten drei Tagen eine Eisschicht zu bilden. Kehren Sie ins Bad zurück, um den Formen Wasser hinzuzufügen.

Geben Sie 13 Milliliter mit vier Grad Celsius, Entgasung und entionisiertem Wasser in jede Form. Reduzieren Sie einmal täglich nach der Zugabe des Wassers die Temperatur des Ethylenglykolbades. Am vierten Tag sollten die Formen vollständig mit Eis gefüllt sein.

Holen Sie die Formen heraus und bereiten Sie eine saubere Oberfläche für das Eis vor. Ziehe jede Form aus der Pfanne und drücke den Eiskristall heraus. Legen Sie die saubere Oberfläche mit den Formen für eine Stunde in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius.

Vor der Handhabung. Wenn das Eis fertig ist, bringe es in einen Gefrierraum oder Kühlraum, um festzustellen, ob es sich um einen Einkristall handelt. Lege das Eis zwischen zwei gekreuzte Polarisatoren.

Wenn es sich bei dem Eis um einen Einkristall handelt, sollten keine Risse oder Diskontinuitäten zu sehen sein und die Lichtrichtung sollte sich innerhalb des Kristalls nicht ändern. Bestimmen Sie bei eingesetztem Polarisator die Ausrichtung der C-Achse, indem Sie das Licht beobachten, das durchgelassen wird, wenn das Eis gedreht wird. Um die Ausrichtung der A-AEs zu bestimmen, wickeln Sie das Eis fest in Alufolie ein.

Richten Sie eine Nadel senkrecht zur Meeresachse aus und stechen Sie ein kleines Loch durch die Folie und in das Eis. Legen Sie das Eis anschließend 20 Minuten lang in ein 0,5 Millibar Vakuum. Sobald der Kristall geborgen ist, decke ihn im Kühlraum auf.

Beobachte die hexagonale Ätzung auf der Basalebene. Die A-AEs verlaufen durch die Eckpunkte des sechszackigen Sterns. Dieser Kristall wird entlang einer Linie parallel zu gegenüberliegenden Punkten auf dem Stern in zwei Hälften geschnitten.

Um eine primäre Prismenebene freizulegen, halten Sie den Kristall sicher auf einer Bank. Schneide den Kristall mit einer Bügelsäge in zwei Hälften. Sammeln Sie die Teile, um sie an einem kalten Finger zu befestigen.

Der Eiskristall muss weiter für die Montage an einem kalten Finger vorbereitet werden, finden Sie zwei Aluminiumstäbe mit leicht unterschiedlichen Durchmessern, aber in der Größe vergleichbar mit dem kalten Finger. Verwenden Sie abwechselnd die Stäbe, um einen Hohlraum in die Oberseite des Kristallstoppers zu schmelzen, wenn es einen Hohlraum gibt, in den der kalte Finger passt. Kühlen Sie den kalten Finger auf minus 0,5 Grad Celsius ab und legen Sie ihn in den Eishohlraum.

Halte den Kristall an Ort und Stelle, bis er am Metall festfriert. Füllen Sie anschließend einen halbkugelförmigen Becher mit etwa dem doppelten Durchmesser des Eiskristalls mit gefiltertem, auf vier Grad Celsius abgekühltem deionisiertem Wasser. Tauchen Sie den kalten, an den Finger gebundenen Eiskristall in den Becher und entfernen Sie überschüssiges Wasser, so dass die Oberseite des Eiskristalls ungefähr auf gleicher Höhe mit der Flüssigkeit ist und das Eis sich nicht berührt.

Die Becherwände decken den Becher mit einer Isolierung ab und senken die Temperatur auf minus fünf Grad Celsius. Lassen Sie das Eis über etwa eine Stunde eine Halbkugel bilden. Bereiten Sie sich darauf vor, das fluoreszierende Protein hinzuzufügen.

Wenn die Hemisphäre bereit ist. Den Eiskristall aus dem Becher nehmen, Wasser aus dem Becher nehmen. Geben Sie dann 25 bis 30 Milliliter vorgekühlte, fluoreszenzmarkierte Proteinlösung in der gewünschten Konzentration hinzu.

Während das gesamte Flüssigkeitsvolumen unverändert bleibt, tauchen Sie den Eiskristall in den Becher. Wieder. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Kristalls auf gleicher Höhe mit der Flüssigkeit ist und die Becherwände nicht berührt. Senken Sie die kalte Fingertemperatur auf minus acht Grad Celsius und lassen Sie die Proteinlösung zwei bis drei Stunden lang im Kristall gefrieren.

Stoppen Sie das Eiswachstum, wenn sich mindestens fünf Millimeter Eis aus der Proteinlösung gebildet haben. Nehmen Sie mit dem kalten Finger den Eiskristall aus dem Becher. Nehmen Sie den kalten Finger ab, indem Sie das Kühlmittel auf knapp über null Grad Celsius erwärmen.

Warten Sie, bis der Eiskristall abschmilzt. Wenn der Kristall vom kalten Finger schmilzt, lege ihn mit der flachen Seite nach unten auf eine saubere Oberfläche. Achten Sie darauf, das neu gebildete Eis nicht zu berühren.

Lagern Sie den Kristall mindestens 20 Minuten bei minus 20 Grad Celsius, bevor Sie mit der Visualisierung der Fluoreszenzarbeit in einem kalten Raum fortfahren, der abgedunkelt werden kann. Bereiten Sie Lampen mit wellenlängenspezifischen Anregungsfiltern vor, um die Leuchtstoffmarkierung und die Kameraemissionsfilter anzuregen. Um unspezifisches Licht auszublenden, legen Sie das Eis mit der flachen Seite nach unten unter die Lampen, verdunkeln Sie den Raum und beobachten Sie die Muster im beleuchteten Eis.

Um die Eisebenen abzuschätzen, die durch die Frostschutzproteine gebunden sind, vergleichen Sie ein traditionelles Eisätzbild mit dem der entsprechenden fluoreszenzbasierten Eisebenen-Affinitätsanalyse mit trixy. Beide zeigen Frostschutzproteine vom Typ 1, die von der Winterflunder Pseudo pectus Americana produziert werden. Die Technik kann verwendet werden, um gleichzeitig Eisbindungsmuster verschiedener Frostschutzproteine zu vergleichen. In diesem Fall markierte Pacific Blue Typ 3 NFEA FP acht und Trixy markierte Typ 1 Frostschutzprotein.

Dies ist das Ergebnis der Visualisierung nur des Typs drei N-F-E-A-F-P acht, hier ist nur das Frostschutzprotein vom Typ 1 in diesem Bild sichtbar. Beides wird zusammen visualisiert. Hinweis: Die C-Achse ist für jedes Bild gleich.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Eiskristalle züchtet und ausrichtet, und die fluoreszenzbasierte Affinitätsanalyse für Eisebenen verwenden, um die Bindungsmuster von fluoreszenzmarkierten Frostschutzmittelproteinen zu bewerten.