FIBS-fähigen Nichtinvasive Metabolic Profiling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Gehalt an intrazellulärer Glukose oder Glutamin nicht-invasiv mit Hilfe von genetisch kodierten proteinbasierten Biosensoren zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst die interessierenden Zellen mit dem plasmidhaltigen Biosensor-Gen durchtrennt und nach den Zellen selektiert werden, die den Biosensor exprimieren. Im zweiten Schritt werden Zellkulturproben aus Batch- oder Fütter-Batch-Kulturen entnommen und deren Bundverhältnisse gemessen.

Die intrazelluläre Glukose- oder Glutaminkonzentration der Proben kann dann durch einen unabhängigen Assay bestimmt werden. Letztendlich kann das Bundverhältnis der Proben verwendet werden, um die intrazelluläre Konzentration von Glukose oder Glutamin nicht-invasiv und in Echtzeit zu berechnen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Verbesserung von Bioprozessen, da es sich um eine zuverlässige Methode zur Gewinnung von Echtzeit-Stoffwechselinformationen handelt, die für die Online-Optimierung und -Steuerung verwendet werden können.

Obwohl die Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Bioprozesstechnik zu erhalten, kann sie auch in anderen Systemen verwendet werden, einschließlich der Erfassung von Krankheitsmarkern. Beginnen Sie mit der Wiederbelebung von CHO-Zellen in neun Millilitern vollständigem Wachstumsmedium. Schleudern Sie dann die Zellen herunter, resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern frischem Wachstum, Medium und zählen Sie die Zellen nach Kutteln im blauen Matrizenausschluss.

Als nächstes initiieren Sie eine Kultur bei einer Aussaatdichte von dreimal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter in 125 Millilitern. Schüttelkolben bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 auf einer orbitalen Schüttelplattform. Mit einer Rotation von 125 U/min subkultivieren die Zellen alle drei bis vier Tage im vollständigen Wachstumsmedium bei einer Sitzdichte von zweimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter für die Zelltransfektion.

Halten Sie die Zellen vor der Transfektion 12 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, um sicherzustellen, dass sich die Zellen aktiv teilen. Nach der Vorbereitung der Plasmid-DNA werden die Zellen nach Ausschluss von Kutteln und blauem Würfel gezählt und die Zellen auf ein Arbeitsvolumen von 20 Millilitern Zellkulturmedium verdünnt. In einem 125-Milliliter-Kolben wird der Kolben in einer Konzentration von eins mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter geschüttelt.

Verwenden Sie ein geeignetes Transfektionskit für die verwendete Zelllinie, das mindestens eine Negativkontrollvertiefung enthält, die Zellen, aber keine DNA enthält. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen vier Tage lang im statischen Modus. Geben Sie nun das geeignete Antibiotikum für die Plasmidauswahl in einer geeigneten Konzentration, die durch eine Kill-Kurve bestimmt wird.

Zum Beispiel wurde in dieser Studie Zin zu einer Endkonzentration von 400 Gramm pro Milliliter hinzugefügt, um die transfizierten Zellen auszuwählen und dann die Kulturen auf eine Schüttelplattform zu übertragen, die sich mit 125 U/min drehte. Wechseln Sie das Medium in einem für die Zelllinie geeigneten Zeitintervall und fügen Sie jedes Mal ein Antibiotikum hinzu, bis die Zellen in der Kontrollvertiefung abgestorben sind. Benutzt die konfluierendsten Vertiefungen, um zu den Schüttelkulturen zu gelangen.

Frieren Sie dann die Zellen in kryogenen Fläschchen ein, die eine mal 10 bis die siebte lebensfähige Zellen in einem Milliliter Gefriermischung enthalten, um Batch- und Fütter-Batch-Wachstumskurven zu erzeugen. Zunächst werden dreifache Zellkulturen der transfizierten CHO-Zellen in 250-Milliliter-Shake-Kolben mit einem Arbeitsvolumen von 50 Millilitern etabliert. Legen Sie dann die Kulturen unter Schütteln in einen befeuchteten Zellinkubator und entnehmen Sie in 24-Stunden-Intervallen 4,1 Milliliter Proben aus jeder wachsenden Kultur. Ergänzen Sie die Zellen für die Fed-Chargenkulturen am sechsten Tag mit der entsprechenden Menge Glukose oder Glutamin, um ihre Konzentrationen wieder auf ihre Ausgangswerte zu bringen.

Wenn Sie die Kontrollkulturen mit dem gleichen Volumen an reinem Wasser füttern, verwenden Sie 100 Mikroliter der 4,1 Milliliter Proben von 4,2 Millilitern täglich, um die Zellen nach Auslösung und Blaudie-Ausschluss zu zählen, bis die Konzentration lebensfähiger Zellen auf Null reduziert ist. Um das Bundverhältnis zu bestimmen, zentrifugieren Sie zwei Milliliter der täglichen Proben und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern eiskaltem PBS, übertragen Sie die Hälfte der Zellsuspension in eine Sechs-Well-Platte und fügen Sie eine leere Probe ohne Zellen zu einer Platte hinzu. Nun, dann messen Sie sofort die Niveaus der blauen und gelben Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 430 mit einer Bandbreite von 35 Nanometern und einer Missionswellenlänge von 465 mit einer Bandbreite von 35 Nanometern und 520 mit einer Bandbreite von 10 Nanometern für die blaue bzw. gelbe Fluoreszenz.

Berechnen Sie die Bundverhältnisse, indem Sie das Verhältnis der detektierten gelben Fluoreszenz zu dem der blauen Fluoreszenz bestimmen. Schleudern Sie nun die letzten zwei Milliliter der Tagesproben herunter und waschen Sie das Pellet nach der zweiten Wäsche zweimal in eiskaltem PBS. Die Probe wird fünfmal für jeweils drei Minuten mit einem Impuls von 15 Sekunden an und 15 Sekunden aus besonnomen.

Führen Sie schließlich die Metaboliten-Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und verwenden Sie die resultierenden Standardkurven, um die intrazellulären Glukose- oder Glutaminspiegel entsprechend zu berechnen. In diesem repräsentativen Experiment wurden chargenüberwucherte Kulturen von zwei Zelllinien beibehalten, wie gerade anhand von täglichen Proben gezeigt wurde, die für die in vivo Kalibrierung der einzelnen Zellen verwendet wurden. Ein repräsentatives Wachstumsprofil lebensfähiger Zellen der beiden Zelllinien in Bezug auf ihre intrazellulären Glukose- oder Glutaminspiegel ist in dieser Grafik dargestellt und die entsprechenden Bundmessungen und intrazellulären Metabolitenkonzentrationen, die durch die enzymatischen Assays bestimmt wurden, sind in dieser Tabelle dargestellt.

Es wurde festgestellt, dass die geringe Zellzahl in den ersten vier Tagen der Kultur zu einem unzuverlässigen Bundsignal führte. In ähnlicher Weise erzeugte der hohe Gehalt an Zelllysat, der nach dem achten Tag der Kultur vorhanden war, eine hohe Menge an Lichtstreuung. Daher werden nur Daten für die Tage vier bis acht verwendet, um die Kalibrierungskurven für die Glukose- und Glutaminfibs zu erstellen.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das FIB-Signal eine zuverlässige Korrelation mit den intrazellulären Konzentrationen zwischen einem und fünf Millimolaren für Glukose und 0,3 und zwei Millimolaren für Glutamin herstellt. Um die Fibs-Ergebnisse zu validieren, wurden mit überwucherten Kulturen der beiden Zelllinien gefüttert. Am sechsten Tag der Zellkultur wurde ein Feed mit einer hohen Substratkonzentration ergänzt, um die extrazellulären Konzentrationen des Substrats zu erhöhen.

Wie die Transplantate darstellen, zeigen die Bundverhältnisse an jedem Tag eine klare Reaktion auf die Fütterung. Indem sie den Trend umkehrten, folgten sie bis zum sechsten Tag. In den mit Glukose gefütterten Kulturen stieg beispielsweise die extrazelluläre Glukosekonzentration wieder auf 36 Millimolar an.

In den mit Glutamin gefütterten Kulturen stieg die Glutaminkonzentration auf vier Millimolare an. Im Glukoseexperiment nahm das Bundverhältnis für die von der Glukoselinie gewählten Zelllinie am siebten Tag als Reaktion auf die Zugabe von Glukose ab. Da die Glukosefibs bei der Konfiguration dem APO folgt.

In ähnlicher Weise erhöhte sich im Glutamin-Experiment das Bundverhältnis für die Glutamin-Fibs der gewählten Zelllinie als Reaktion auf die Zugabe von Glutamin in Übereinstimmung mit dem Prinzip der APO-Off-Sensoren. Diese Bundmessungen wurden schließlich verwendet, um die entsprechenden intrazellulären Glukose- und Glutaminkonzentrationen auf der Grundlage der oben genannten Kalibrierkurven zu berechnen. Sie werden mit den tatsächlichen intrazellulären Konzentrationen dieser Substrate verglichen, die mit den enzymatischen Glukose- und Glutamin-Assays bestimmt wurden, und zeigen nach ihrer Entwicklung eine ausreichende Übereinstimmung.

Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Forschung den Weg, die Wirkung verschiedener Medienformulierungen auf die Proteinproduktivität zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie genetisch kodierte Biosensoren zur Überwachung intrazellulärer Metabolitenkonzentrationen verwenden können.