Eine Peptid-Microarray-Technologie zur Erstellung von Spezifitätsprofilen von Antikörpern

Nehmen Sie einen Microarray-Objektträger, der Histonpeptide mit posttranslationalen Ziel- und Nichtzielmodifikationen (PTMs) enthält.

Die Peptide werden über konjugiertes Biotin an bestimmten Stellen auf dem Streptavidin-funktionalisierten Glasobjektträger immobilisiert.

Die Flecken enthalten auch ein immobilisiertes Biotin-konjugiertes grünes Fluorophor, das die Identifizierung der Flecken erleichtert.

Führen Sie einen Blockierungspuffer ein, der eine unspezifische Antikörperinteraktion verhindert.

Entfernen Sie den Puffer und zentrifugieren Sie, um den Objektträger zu trocknen.

Umrande das Array in einem Wachsimprinter mit Wachs.

Äquilibrieren Sie das Array mit einem Hybridisierungspuffer.

Inkubieren Sie mit den primären Antikörpern, die für ein Ziel-PTM spezifisch sind.

Führen Sie rote Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper ein, die an die primären Antikörper binden.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper und zentrifugieren Sie, um den Objektträger zu trocknen.

Bilde den Objektträger mit einem Microarray-Scanner. Die grüne Fluoreszenz hilft bei der Identifizierung der Flecken, während die rote Fluoreszenz auf eine PTM-Antikörper-Interaktion hinweist, was die Antikörperspezifität zeigt.

Die Erkennung des Ziel-PTM zeigt Antikörperspezifität, während die Erkennung von Nicht-Ziel-PTMs auf eine Antikörper-Kreuzreaktivität hinweist.

Laden Sie 1 bis 2 Mikroliter jedes Peptidmerkmals in die dafür vorgesehenen Vertiefungen einer oder mehrerer 384-Well-Platten mit kleinem Volumen. Verdünnen Sie jedes Merkmal zehnfach mit 1x Protein-Microarray-Druckpuffer, ergänzt mit 1 % Rinderserumalbumin und 5 Mikrogramm pro Mikroliter Fluorescein-markiertem Biotin. Dann zentrifugieren Sie die Platten bei 500 mal g bei Raumtemperatur für 2 Minuten. Leeren Sie anschließend den Abfallbehälter des Microarray-Druckers. Füllen Sie die Waschlösung in Befeuchterbehälter mit sterilem destilliertem Wasser. Geben Sie die Parameter für den Array-Objektträger in der Microarray-Druckersoftware ein.

Stellen Sie den Waschvorgang auf 1 Sekunde Wäsche mit einmaligem Eintauchen ein, den Nachwaschvorgang auf fünfmaliges Erneuern der Stecknadeln und die Luftfeuchtigkeit auf 60 %. Setzen Sie dann mit Streptavidin beschichtete Objektträger in die Substratplatten ein. Laden Sie die Platten in den Plattenaufzug. Setzen Sie die Quellplatten in die Plattenhalter ein und laden Sie die Halter in den Quellenplattenaufzug. Führen Sie den Druckvorgang aus.

Entfernen Sie dann die Substratplatten vom Instrument. Blockieren Sie die gedruckten Objektträger mit 1x Protein-Microarray-Blockierungspuffer für 30 Minuten unter Schütteln. Waschen Sie die Objektträger dann 10 Minuten lang in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung bei Raumtemperatur mit pH 7,6. Wiederholen Sie die Wäsche mit einer frischen Charge PBS. Trocknen Sie die Objektträger durch Zentrifugieren für 30 Sekunden bei Raumtemperatur.

Heizen Sie anschließend einen Microarray-Wachsimprinter 30 Minuten lang auf 85 Grad Celsius vor oder bis das Wachs geschmolzen ist. Setzen Sie dann einen Objektträger mit der bedruckten Seite nach unten in den Halter ein und richten Sie den Halter an der Imprinterform aus. Bringen Sie die Form in Kontakt mit dem Objektträger und halten Sie sie zwei Sekunden lang gedrückt. Nehmen Sie dann schnell den Objektträger aus der Halterung und überprüfen Sie die Wachsränder, um sicherzustellen, dass die Arrays richtig eingeschlossen sind. Lagern Sie die abgeteilten Dias bei 4 Grad Celsius an einem trockenen, dunklen Ort.

Um den Hybridisierungsvorgang zu starten, legen Sie einen Objektträger mit partitioniertem Array in eine Kunststoffschale und bedecken Sie den Objektträger mit Hybridisierungspuffer. Äquilibrieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius, während Sie bei niedriger Geschwindigkeit schütteln. Trocknen Sie den Objektträger, indem Sie ihn in einer Microarray-Objektträgerzentrifuge bei Raumtemperatur drehen. Geben Sie dann 5 Mikroliter jeder Histon-PTM-Antikörperlösung in mindestens zwei Vertiefungen des Arrays und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 4 Grad Celsius.

Entfernen Sie nach der Inkubation die Antikörperlösung und waschen Sie das Array dreimal jeweils 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit kaltem PBS. Als nächstes inkubieren Sie das Array in einer mit Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Sekundärantikörperlösung für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius unter Ausschluss von Licht. Waschen Sie die Rutsche wie zuvor dreimal mit kaltem PBS.

Tauchen Sie das Array in eine Raumtemperatur von 0,1x PBS, um überschüssige Salze zu entfernen, und trocknen Sie den Objektträger durch kurzes Zentrifugieren bei Raumtemperatur. Bilden Sie den Objektträger mit einem Microarray-Scanner mit einer Auflösung von mindestens 25 Mikrometern ab.