Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, eine native Matrix aus Fibroblasten zu generieren, um die Invasion von Tumorzellen zu beurteilen. Dies wird zunächst erreicht, indem Fibroblasten auf Kunststoff in einem mit Sorbinsäure angereicherten Medium gezüchtet werden, um die native Matrix zu erzeugen. Im zweiten Schritt wird die native Matrix von der plastischen Wachstumsoberfläche abgelöst und freigesetzt, und dann wird diese Matrix mit Tumorzellen besiedelt und nach einer festgelegten Zeit an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gehoben.

Diese 3D-Kulturen werden für die histologische Analyse der Tumorzellinvasion geerntet. Letztendlich können die Auswirkungen der nativen Fibroblastenmatrix auf die Invasion von Tumorzellen durch immunhistologische Analysen bewertet werden. Der Vorteil dieser Technik zur Erzeugung typischer 3D-Kulturen besteht also darin, dass wir die von den Fibroblasten selbst produzierte native Matrix in Abwesenheit von synthetischen oder fremden Substraten, wie z. B. Kollagen vom Typ 1, beurteilen können. Beginnen Sie mit der Aussaat von 200.000 Fibroblasten pro Vertiefung in sechs Vertiefungsplatten in Faserstrahlmedien, ergänzt mit frisch zubereiteter IC-Säure.

Zwei Phosphate versorgen die Zellen alle zwei bis drei Tage mit zwei bis fünf Millilitern frischem Medium. Am Ende von sechs Wochen bildet sich eine dicke Zellschicht, die in eine extrazelluläre Matrix eingebettet ist, die mit bloßem Auge sichtbar ist. Abhängig von den verwendeten Zellen kann sich früher oder später die sichtbare Matrix bilden und sich von der Schale zu lösen beginnen, wie hier zu sehen.

Um diese Schicht von der Gewebekulturplatte zu lösen, kratzen Sie vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Mikropipettenspitze den Umfang der Matrix ab und schieben Sie dann die Ränder der Matrix in Richtung der Mitte der Vertiefung. Die Zellen und die native Matrix sollten sich leicht von der Plattenoberfläche lösen und nun im Medium schweben. Verteilen Sie die native Matrix innerhalb des Mediums, um zu vermeiden, dass sie sich in sich selbst faltet.

Lassen Sie die native Matrix fünf Tage lang schweben und umgestalten, wobei Sie das Medium aufgrund der Zugfestigkeit und des intrinsischen Umbaus alle zwei bis drei Tage wechseln müssen. Die Matrix wird sich drastisch zusammenziehen und auf eine kleinere, aber dickere native Matrix reduziert, zu diesem Zeitpunkt kann sie verwendet werden. Für den Invasions-Assay.

Für den Invasions-Assay. Übertragen Sie zunächst mit einer stumpfen Pinzette die native Matrix vorsichtig auf ein Nylonnetz. Sobald Sie sich im Netz befinden, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Mikropipettenspitze und eine stumpfe Pinzette, um die Matrize vorsichtig so flach wie möglich zu verteilen.

Als nächstes schmieren Sie eine kleine Menge Vaseline auf ein Ende eines sterilen klonalen Zylinders pro Matrix. Platzieren Sie dann die Zylinder mit der Vaselineseite nach unten auf den nativen Matrizen, um eine dichte Abdichtung zwischen der nativen Matrix und den klonalen Ringen zu gewährleisten. Geben Sie nun 250.000 kutane Plattenepithelkarzinome oder SCC-Zellen in Wachstumsmedien an der Karatstelle in die Zylinder.

Nachdem sich die kutanen SCC-Zellen auf der nativen Matrix abgesetzt haben, entfernen Sie die Zylinder und heben Sie dann die native Nylonnetz-Matrix und die kutanen SEC-Zellen an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und auf eine gebogene Edelstahl-Drahtgeflechthalterung. Fügen Sie schließlich Keratinozyten-Wachstumsmedien hinzu, die mit Sorbinsäure ergänzt werden, bis der Medienspiegel den Boden der nativen Matrix berührt, wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage und ernten Sie sieben und 14 Tage nach der Aussaat der kutanen SCC-Zellen. Diese Technik eröffnet die Möglichkeit, das invasive Verhalten von Tumorzellen unter verschiedenen 3D-Stromaumgebungen zu untersuchen und zu vergleichen.

Wie in diesen Bildern zu sehen ist, war die Invasion der RDEB-kutanen SCC-Keratinozyten in C seven gegenüber exprimierenden nativen Matrizen in den rechten Panels signifikant verzögert, verglichen mit den C 7-defizienten RDEB-Kontrollen in den linken Panels. Die Entwicklung dieser Technik hat es den Forschern ermöglicht, den Einfluss der von Fibroblasten produzierten nativen Matrix auf Tumorzellprozesse wie die Invasion direkt zu bewerten.