Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, eine native Matrix aus Fibroblasten zu erzeugen, um die Invasion von Tumorzellen zu bewerten. Zunächst werden Fibroblasten in einem sorbinsäureangereicherten Medium auf Kunststoff kultiviert, um die native Matrix zu bilden. In einem zweiten Schritt wird die native Matrix von der Kunststoffoberfläche gelöst und abgelöst, anschließend mit Tumorzellen besiedelt und nach einer festgelegten Zeit an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche angehoben.

Diese 3D-Kulturen werden zur histologischen Analyse der Tumorzellinvasion geerntet. Letztendlich können die Auswirkungen der nativen Fibroblastenmatrix auf die Tumorzellinvasion mittels immunhistologischer Analyse bewertet werden. Der Vorteil dieser Technik zur Erzeugung von 3D-typischen Kulturen liegt also darin, dass wir die von Fibroblasten selbst produzierte native Matrix in Abwesenheit synthetischer oder fremder Substrate, wie beispielsweise artfremdem Kollagen Typ I, untersuchen können. Beginnen Sie damit, 200.000 Fibroblasten pro Vertiefung in Sechs-Vertiefungs-Platten in Fibroblasten-Medium, ergänzt mit frisch zubereiteter IC-Säure, auszusäen.

Zwei Mal pro Woche ersetzen Sie das Phosphat die Zellen mit zwei bis fünf Milliliter frischem Medium. Am Ende von sechs Wochen bildet sich eine dicke Zellschicht, die in der extrazellulären Matrix eingebettet ist und mit bloßem Auge sichtbar ist. Je nach verwendeten Zellen kann die sichtbare Matrix früher oder später entstehen und sich wie hier gezeigt von der Petrischale ablösen.

Um diese Schicht von der Zellkulturschale zu lösen, vorsichtig den Rand der Matrix mit einer 1-milliliter-Mikropipettenspitze abstreifen und anschließend die Ränder der Matrix zur Mitte der Vertiefung hin zusammenschieben. Die Zellen und die native Matrix sollten sich leicht von der Oberfläche der Schale lösen und nun in dem Medium schwimmen. Die native Matrix im Medium gleichmäßig verteilen, um zu verhindern, dass sie sich zusammenfaltet.

Lassen Sie die native Matrix fünf Tage lang schweben und remodellieren, wobei das Medium alle zwei bis drei Tage aufgrund der Zugfestigkeit und der intrinsischen Remodellierung gewechselt wird. Die Matrix zieht sich stark zusammen und reduziert sich zu einer kleineren, aber dickeren nativen Matrix, die dann zur Verwendung bereitsteht. Für den Invasionstest.

Für den Invasionsassay. Überführen Sie die native Matrix zunächst vorsichtig mit stumpfen Pinzetten auf ein Nylonnetz. Breiten Sie die Matrix dann mit einer 1-milliliter-Mikropipettenspitze und stumpfen Pinzetten so flach wie möglich aus.

Als Nächstes wird eine kleine Menge Vaseline auf ein Ende eines sterilen klonalen Zylinders pro Matrix aufgetragen. Anschließend werden die Zylinder mit der Vaseline-Seite nach unten auf die nativen Matrizen platziert, um eine dichte Abdichtung zwischen der nativen Matrix und den klonalen Ringen sicherzustellen. Nun werden 250.000 kutane Plattenepithelkarzinom- oder SCC-Zellen in Karat-Site-Wachstumsmedium zu den Zylindern gegeben.

Nachdem sich die kutanen SCC-Zellen auf der nativen Matrix angesiedelt haben, entfernen Sie die Zylinder, heben Sie das Nylonnetz mit der nativen Matrix und den kutanen SEC-Zellen an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und auf eine gebogene Edelstahldrahtgitterunterlage. Schließlich geben Sie Keratinozyten-Wachstumsmedium hinzu, ergänzt mit Sorbinsäure, bis der Mediumspiegel die Unterseite der nativen Matrix berührt. Erneuern Sie das Medium alle zwei bis drei Tage und ernten Sie sieben und 14 Tage nach der Aussaat der kutanen SCC-Zellen. Diese Technik eröffnet die Möglichkeit, das invasive Verhalten von Tumorzellen unter verschiedenen 3D-stromalen Umgebungen zu untersuchen und zu vergleichen.

Wie in diesen Bildern zu sehen ist, war die Invasion der RDEB-kutanen SCC-Keratinozyten in den rechten Panels, in denen C7 native Matrizen überexprimierte, im Vergleich zu den C7-defizienten RDEB-Kontrollen in den linken Panels deutlich verlangsamt. Die Entwicklung dieser Technik hat es Forschern ermöglicht, den direkten Einfluss der von Fibroblasten produzierten nativen Matrix auf Tumorzellprozesse wie die Invasion zu bewerten.