Name: Cell Surface Capture-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Lernen Sie die markierungsfreie Anreicherung von Zelloberflächenproteinen aus Zelllysaten für die Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung spezifischer Antigene auf Tumorzellen als potenzielle Ziele für Krebsimmuntherapien.

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Wir danken Dr. Kamal Mandal (Abteilung für Labormedizin, UCSF) für die Hilfe bei der Einrichtung des LC-MS/MS-Laufs, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) für die Hilfe bei der Datenanalyse und Dr. Audrey Reeves (Abteilung für Labormedizin, UCSF) für die Hilfe bei der Datenanalyse. Die entsprechende Arbeit im A.P.W.-Labor wird vom NIH R01 CA226851 und dem Chan Zuckerberg Biohub unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2B wurden unter Verwendung von BioRender.com erstellt.

HINWEIS: AMO1-Plasmozytomzellen wurden für dieses Zelloberflächenproteom-Experiment verwendet. Das gleiche Protokoll kann auch für andere Zelltypen verwendet werden, einschließlich einer breiten Palette von Suspensions- und adhärenten Zelllinien9, sowie für verschiedene Arten von Primärproben10. Die Zellzahlen (Ausgangsmaterial für das Experiment) müssen jedoch in der Regel für eine gleichwertige Proteomabdeckung optimiert werden. Weitere Informationen zu Materialien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle. Einzelheiten zu Puffern und Reagenzien und deren Zusammensetzung finden Sie in Tabelle 1.
1. Markierung von Zelloberflächen mit Biotin
<ol>
	<li>Die kultivierten Zellen und das Pellet werden ca. 3,5 × 107 lebende Zellen durch Zentrifugation (5 min bei 500 × g, 24 °C) gezählt. 
	HINWEIS: Die AMO1-Plasmozytomzellen wurden vor der Entnahme alle 3 Tage mit frischem Medium durchgelassen.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie 1 ml kalte (4 °C) Dulbecco-phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) (kein Kalzium, kein Magnesium) hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Zellen erneut (wie in Schritt 1.1) und wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 1.2) noch einmal (insgesamt zwei Wäschen).</li>
	<li>Nach dem zweiten Waschen pelletieren Sie die Zellen (wie in Schritt 1.1) und resuspendieren sie in 990 μl kaltem D-PBS durch vorsichtiges Pipettieren.</li>
	<li>Bereiten Sie zuvor eine Stammlösung von 160 mM Natriummetaperiodat (NaIO4) vor. In 50 μL Aliquots aufteilen und bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern. In Schritt 1.4 werden 10 μl 160 mM Natriummetaperiodatlösung in die Zellsuspension gegeben, gründlich gemischt und 20 Minuten lang bei 4 °C auf einem End-to-End-Rotor inkubiert.</li>
	<li>Nach Abschluss der Inkubation werden die Zellen pelletiert (wie in Schritt 1.1), der Überstand dekantiert und in 1 ml kaltem D-PBS resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal (insgesamt drei Wäschen). Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 989 μl D-PBS.</li>
	<li>Bereiten Sie zuvor eine Stammlösung von 100 mM Biocytinhydrazid vor. In 50 μl Aliquots aufteilen und bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern. In Schritt 1.6 werden 1 μl Anilin und 10 μl 100 mM Biocytinhydrazid in die Zellsuspension gegeben, gründlich gemischt und auf einem End-to-End-Rotor 60 min bei 4 °C inkubiert.</li>
	<li>Nach Abschluss der Inkubation werden die Zellen pelletiert (wie in Schritt 1.1), der Überstand dekantiert und in 1 ml kaltem D-PBS resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).</li>
	<li>Nach dem dritten Waschen wird der Überstand vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt und das Küvettenpellet durch Einlegen des Röhrchens in die Flüssigkeit N2 eingefroren. Legen Sie das gefrorene Pellet bei -80 °C, bis es mit der Lyse und dem Abziehen fortfährt.</li>
</ol>
2. Zelllyse und Biotin-Pulldown
<ol>
	<li>Tauen Sie das gefrorene Zellpellet auf Eis auf.</li>
	<li>500 μl 2x Lysepuffer zum Pellet geben, gründlich mischen und 30 s. 
	HINWEIS: Kräftiges Pipettieren und Vortexen kann erforderlich sein, um das Pellet vollständig zu lysieren. Einige unlösliche Rückstände (z. B. DNA) sind akzeptabel, da sie im nachfolgenden Beschallungsschritt entfernt werden.</li>
	<li>Beschallung des Zelllysats auf Eis (drei Stöße à 20 s, 60 % Einschaltdauer).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Lysat, um verbleibende Rückstände zu pelletieren (10 min bei 17.200 × g bei 4 °C).</li>
	<li>Während das Lysat zentrifugiert, geben Sie 100 μl Neutravidin-Agarose-Harzkügelchen in eine Filtrationssäule. Befestigen Sie die Säule an einem Vakuumverteiler, saugen Sie sie sanft ab und waschen Sie die Perlen, indem Sie 3 ml Waschpuffer 1 darüber fließen lassen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Filtrationssäule aus dem Vakuumverteiler, verschließen Sie den Boden und geben Sie das geklärte Zelllysat in die Säule mit den Kügelchen. Verschließen Sie die Oberseite der Säule und inkubieren Sie das Lysat mit den Kügelchen auf einem End-to-End-Rotor für 120 min bei 4 °C. 
	HINWEIS: Wenn Sie die Oberseite der Säule verschließen, halten Sie die untere Kappe fest an Ort und Stelle, da sie sich sonst lösen kann und das Zelllysat während der Inkubation austreten kann.</li>
	<li>Bereiten Sie die Waschpuffer 1, 2 und 3 vor (ca. 5 ml jedes Waschpuffers pro Probe, siehe Tabelle 1) und legen Sie sie in ein 42 °C warmes Wasserbad</li>
	<li>Nachdem das Lysat die Inkubation beendet hat, setzen Sie die Filtrationssäule wieder auf den Vakuumverteiler, wenden Sie ein sanftes Vakuum an und waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 5 mL Waschpuffer 1 darüber fließen lassen. 
	HINWEIS: Mehr als 5 ml der Waschpuffer können zum Waschen verwendet werden; Zusätzliches Waschen kann den Hintergrund und die unspezifische Bindung an die Perlen reduzieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Waschschritt mit 5 mL Waschpuffer 2.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Waschschritt mit 5 mL Waschpuffer 3.</li>
	<li>Sobald der letzte Waschpuffer vollständig durch die Kügelchen geflossen ist, entfernen Sie die Säule aus dem Verteiler. Geben Sie 100 μl "Lyse"-Lösung zu den Kügelchen und geben Sie sie mit einer Pipette in ein 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Drehen Sie das Röhrchen kurz, um die Kügelchen abzusetzen, und entfernen Sie 50 μl der Lösung, ohne die abgesetzten Kügelchen zu stören. 
	HINWEIS: Für die Reagenzien in diesem Schritt und allen nachfolgenden Schritten wird ein im Handel erhältliches Proteomik-Probenvorbereitungskit verwendet. Das Kit bietet einen optimierten, vereinfachten Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung. Diese Schritte können jedoch auch unabhängig vom Kit durchgeführt werden, wobei ein traditioneller Proteomik-Workflow verwendet wird, wie in Verma et al.9 beschrieben. Wenn die Kügelchen an der Seite oder am Boden der Säule kleben bleiben, lassen Sie die Kügelchen, die in das Röhrchen übertragen wurden, sich absetzen, und verwenden Sie eine zusätzliche "Lyse"-Lösung im Röhrchen, um die verbleibenden Kügelchen zu übertragen.</li>
	<li>Stellen Sie das Rohr auf einen Heizblock/Shaker bei 65 °C und schütteln Sie es bei 1.000 U/min für 10 min. 
	HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Reduktion und Alkylierung von Cysteinrückständen vor dem Aufschluss erforderlich.</li>
</ol>
3. Proteinverdauung
<ol>
	<li>Das getrocknete Trypsin wird durch Zugabe von 210 μl der "Resuspend"-Lösung resuspendiert ("Digest"-Röhrchen im Kit, gelagert bei -20 °C). Pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass das gesamte getrocknete Trypsin resuspendiert wird.</li>
	<li>Nach Abschluss der Inkubation geben Sie 50 μl der resuspendierten Trypsinlösung zu den Kügelchen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C und schütteln Sie es mindestens 90 Minuten lang bei 500 U/min, um das Protein zu verdauen.</li>
	<li>Sobald der Aufschluss abgeschlossen ist, überführen Sie die Lösung mit den Kügelchen in eine Spin-Säule und setzen Sie die Säule in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung ein. Drehen Sie das Röhrchen (500 × g für 5 min bei Raumtemperatur [RT]), um die verdaute Peptidlösung von den Kügelchen zu trennen. 
	HINWEIS: In diesem Stadium kann eine PNGase-Behandlung an den Kügelchen durchgeführt werden, sobald sie von der Peptidlösung getrennt sind, um biotinylierte Peptidfragmente aus den Streptavidin-Kügelchen zu eluieren. Diese Peptidprobe kann dann als separate, sekundäre Peptidprobe durch den restlichen Arbeitsablauf geführt werden, die analysiert und mit der Primärprobe aus der On-Bead-Trypsinisierung verglichen werden kann. Der PNGase-Ansatz wird wahrscheinlich komplementäre Daten zur On-Bead-Trypsinisierung liefern, da die eingefangene N-glykosylierte Asparagine aufgrund der MS-nachweisbaren Seitenkettenmodifikation zusätzlich spezifiziert sind12. Der Nachteil dieses sequentiellen Elutionsansatzes ist jedoch die doppelte Zeit des Massenspektrometers pro Probenanalyse.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl der "Stop"-Lösung hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen und die Peptidlösung anzusäuern.</li>
</ol>
4. Entsalzung von Peptiden
<ol>
	<li>Setzen Sie mit einem Röhrchenadapter eine Entsalzungssäule in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung ein. Geben Sie die gesamte angesäuerte Peptidlösung in die Säule. Die Säule (3.800 × g für 3 min) drehen, so dass die Lösung durch die Säule fließt. Die Peptide sind nun an die Säule gebunden; Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>200 μl "Wash 1"-Lösung in die Säule geben und schleudern (3.800 × g für 3 min, RT). Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>200 μl "Wash 2"-Lösung in die Säule geben und schleudern (3.800 × g für 3 min, RT). Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>Übertragen Sie die Säule in ein neues, beschriftetes 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Geben Sie 100 μl "Elut"-Lösung in die Säule und schleudern Sie sie (3.800 × g für 3 min, RT). Geben Sie weitere 100 μl "Elu"-Lösung in die Säule und schleudern Sie sie (3.800 × g für 3 min, RT). Die Peptide werden nun von der Säule in das Röhrchen eluiert.</li>
	<li>Geben Sie die Peptidlösung in eine Vakuumzentrifuge und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Die getrockneten Peptide werden bis zur Quantifizierung bei -80 °C bei -80 °C platziert und auf dem Massenspektrometer analysiert.</li>
</ol>
5. Peptid-Resuspension und Quantifizierung
<ol>
	<li>Resuspendieren Sie die eingetrockneten Peptide in 20 μl Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure, 2 % Acetonitril).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die resuspendierten Peptide (17.200 × g für 10 min), um unlösliche Rückstände zu pelletieren.</li>
	<li>Bereiten Sie Peptidstandards für den kolorimetrischen Peptidquantifizierungsassay vor.
	<ol>
		<li>Geben Sie 5 μl 1.000 mg/ml Peptidstammlösung in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte.</li>
		<li>Führen Sie eine siebenstufige serielle Verdünnung in der Platte mit deionisiertem (DI) Wasser wie folgt mit 5 μl jedes Standards pro Vertiefung durch: 1.000 mg/ml, 500 mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,25 mg/ml und 15,625 mg/ml. Geben Sie 5 μl DI-Wasser in eine achte Vertiefung für den Rohling.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Geben Sie 4 μl DI-Wasser in drei separate Vertiefungen der 96-Well-Platte. Geben Sie 1 μl der resuspendierten Peptidlösung in jede Vertiefung, um ein Gesamtvolumen von 5 μl zu erhalten. 
	HINWEIS: Wenn Sie die Peptidlösung zur Quantifizierung pipettieren, pipettieren Sie vorsichtig von der Oberseite der Lösung, um eine Störung abgesetzter Rückstände zu vermeiden.</li>
	<li>Berechnen Sie, wie viel funktionierendes Reagenz benötigt wird (45 μl pro Vertiefung erforderlich). Bereiten Sie das erforderliche Volumen des kolorimetrischen Assay-Arbeitsreagenzes vor; Wirbeln Sie das Arbeitsreagenz vor, um eine ordnungsgemäße Durchmischung der Komponenten zu gewährleisten.</li>
	<li>Geben Sie jeweils 45 μl des Arbeitsreagenzes in die Standard- und Probenvertiefungen. 
	HINWEIS: Machen Sie die Standards in Duplikaten und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um einen minimalen Unterschied im Zeitpunkt der Zugabe des Reagenzes zu den Wells zu gewährleisten.</li>
	<li>Die Platte mit Alufolie abdecken und bei 37 °C 15 min inkubieren.</li>
	<li>Analysieren Sie die Platte mit einem automatisierten Plattenlesegerät. Verwenden Sie die für die Standardproben aufgezeichneten Absorptionswerte, um eine lineare Standardkurve zu erstellen. Bestimmen Sie die Gleichung aus der Normkurve und demR2-Wert. Wenn derR2-Wert angemessen ist (≥0,95), verwenden Sie die Standardkurve, um die Konzentration der resuspendierten Peptide zu bestimmen, wobei die fünffache Verdünnung in der kolorimetrischen Testplatte berücksichtigt wird.</li>
</ol>
6. Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analyse der verdauten Peptide
<ol>
	<li>Passen Sie die Konzentration der Peptidproben durch Zugabe von Lösungsmittel A auf 0,2 μg/μl an und überführen Sie 10 μl in ein 0,6 mL Röhrchen mit geringer Proteinbindung.</li>
	<li>Legen Sie das Röhrchen in den LC-Autosampler.</li>
	<li>Stellen Sie die Parameter LC und MS/MS gemäß Abbildung 2 und Abbildung 3 ein.</li>
	<li>Injizieren Sie 5 μl (1 μg) der Peptidprobe zur Analyse in das LC-MS/MS-Setup. 
	HINWEIS: Die hier gezeigten LC-MS/MS-Einstellungen sind nur repräsentativ für die Abbildungen. Abhängig von der Verfügbarkeit des LC- und MS-Instruments können Benutzer die Einstellungen für den LC-Gradienten und die MS/MS-Parameter ändern, um eine tiefe Proteomabdeckung zu erhalten. Für diese Arbeit wurde die MS-Datenanalyse mit MaxQuant https://www.maxquant.org/, die Sekundärdatenanalyse mit Perseus https://maxquant.net/perseus/ und die Pathway-Analyse mit https://reactome.org/ durchgeführt.</li>
</ol>

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<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li>
<li>van Oostrum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mouse+B+cell+types+using+surfaceome+proteotype+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps.</a> Nature Communications. 10 (1), 5734(2019).</li>
<li>Berg Luecke, L., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+streptavidin+bead+binding+capacity+to+improve+quality+of+streptavidin-based+enrichment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies.</a> Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die unvoreingenommene Charakterisierung von Tausenden von unbekannten Proteinen in einem bisher unmöglichen Maßstab ermöglicht hat. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Proteine zu identifizieren und zu quantifizieren sowie eine Reihe von Erkenntnissen über die Struktur- und Signalkapazitäten von Zellen und Geweben zu gewinnen, indem wir die Vielfalt der in einer bestimmten Probe vorhandenen Proteine charakterisieren. Die Massenspektr...

Proteine dienen als grundlegende Einheiten, durch die die meisten zellulären Funktionen ausgeführt werden. Die Charakterisierung der Struktur und Funktion relevanter Proteine ist ein wesentlicher Schritt, um biologische Prozesse zu verstehen. In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte in der Massenspektrometrietechnologie, der Analysesoftware und den Datenbanken den genauen Nachweis und die Messung von Proteinen auf einer proteomweiten Skala ermöglicht1. Die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik kann in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, von der grundlagenwissenschaftlichen Analyse biochemischer Signalwege über die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele in einem translationalen Umfeld bis hin zur Diagnose und Überwachung von Krankheiten in der Klinik2. Beim Screening nach neuartigen Wirkstoffzielen ist die Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms besonders wichtig, da über 65 % der derzeit zugelassenen Humanarzneimittel auf Zelloberflächenproteine abzielen3. Auch das Gebiet der Krebsimmuntherapie stützt sich vollständig auf krebsspezifische Zelloberflächenantigene, um Tumorzellen anzugreifen und spezifisch zu eliminieren4. Die massenspektrometrische Proteomik kann daher als vielversprechendes Werkzeug dienen, um neue Zelloberflächenproteine für therapeutische Eingriffe zu identifizieren.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei der Verwendung herkömmlicher Proteomik-Methoden, um Tumorzellen auf neue Ziele für Zelloberflächenproteine zu untersuchen. Ein Hauptproblem ist, dass Oberflächenproteine nur einen sehr kleinen Teil der gesamten Proteinmoleküle in einer Zelle ausmachen. Daher werden Fragmente dieser Proteine bei der massenspektrometrischen Analyse des Ganzzelllysats durch eine hohe Abundanz intrazellulärer Proteine maskiert5. Diese Einschränkung macht es schwierig, das Proteom der Zelloberfläche mit einem herkömmlichen Proteomik-Workflow genau zu charakterisieren. Um diese Herausforderung zu bewältigen, ist es notwendig, Wege zu entwickeln, um Zelloberflächenproteine aus dem Ganzzelllysat anzureichern, bevor sie mit dem Massenspektrometer analysiert werden. Eine dieser Methoden beinhaltet die Oxidation und Biotinmarkierung von glykosylierten Zelloberflächenproteinen in den intakten Zellen und die anschließende Anreicherung dieser biotinylierten Proteine aus dem Lysat mit einem Neutravidin-Pulldown, ein Prozess, der als "cell surface capture" bezeichnet wurde6. Da man davon ausgeht, dass ~85% der Oberflächenproteine von Säugetierzellen glykosyliert sind7, dient dies als effektive Methode zur Anreicherung des Zelloberflächenproteoms aus dem gesamten Zelllysat. Dieser Artikel beschreibt einen vollständigen Arbeitsablauf, beginnend mit kultivierten Zellen, von der Biotinmarkierung auf der Zelloberfläche bis hin zur anschließenden Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse (Abbildung 1). Über mehrere Replikate hinweg bietet diese Methode eine robuste Abdeckung des Zelloberflächenproteoms einer bestimmten Probe. Die Verwendung dieser Methode zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms sowohl von Tumorzellen als auch von gesunden Zellen kann die Entdeckung neuartiger Zelloberflächenantigene erleichtern, um potenzielle immuntherapeutische Ziele zu identifizieren8.

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96X iST Probenvorbereitungskit</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>Proteomics-Probenvorbereitungskit. Enthält Reagenzien für die Reduktion, Alkylierung und den Aufschluss. Fügen Sie auch Entsalzungssäulen und Reagenzien hinzu.</td></tr><tr><td>Pierce Quantitativer kolorimetrischer Peptid-Assay</td><td>Thermo</td><td>23275</td><td>Peptid-Quantifizierungskit. Enthält Peptidstandards und Komponenten von Arbeitsreagenzien.</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Millipore Sigma</td><td>09830-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Biocytinhydrazid</td><td>Biotium</td><td>90060</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (ohne Calcium- und Magnesiumsalze)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003-225B01</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Honeywell</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease- und Phosphatase-Inhibitor Einweg-Cocktail</td><td>Thermo</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin Agaroseharz</td><td>Thermo</td><td>29204</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>UCSF-Zellkulturanlage</td><td>CCFAL001-22J01</td><td></td></tr><tr><td>RIPA-Lysepuffer, 10x</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Natriummetaperiodat</td><td>Alfa Aesar</td><td>13798</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Fleck (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrarein 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff (Proteomics-Qualität)</td><td>VWR</td><td>M123-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Ausrüstung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>PrismR Mikrozentrifuge</td><td>Labnet International</td><td>C2500-R-230V</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>VWR</td><td>Branson Sonifier 240</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumverteiler</td><td>Promega</td><td>Promega Vac-Man</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Heatblock</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>End-to-End-Rotator</td><td>Labnet</td><td>Revolver Verstellbarer Rotator</td><td></td></tr><tr><td>LC</td><td>Thermo</td><td>Ultimate 3000 HPLC und UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Massenspektrometer</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Biotek</td><td>Biotek Synergy 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkonzentrator</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Protein LoBind Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtrationssäulen</td><td>Bio-Rad</td><td>7326008</td><td></td></tr><tr><td>Spin Säulen</td><td>Thermo</td><td>Artikel-Nr.: 69725</td><td></td></tr></tbody></table>

"cell surface capture"-workflow zur markierungsfreien quantifizierung des zelloberflächenproteoms

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

In den letzten zehn Jahren hat die massenspektrometrische Proteomik eine tiefgreifende Charakterisierung biologischer Systeme in einer breiten Palette von Anwendungen ermöglicht. Das Zelloberflächenproteom ("Oberflächenom") bei menschlichen Krankheiten ist von großem Interesse, da Plasmamembranproteine das primäre Ziel der meisten klinisch zugelassenen Therapeutika sowie ein Schlüsselmerkmal zur diagnostischen Unterscheidung erkrankter Zellen von gesundem Gewebe sind. Die fokussierte Charakterisierung von Membran- und Oberflächenproteinen der Zelle blieb jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Komplexität der zellulären Lysate, die die interessierenden Proteine durch andere Proteine mit hoher Abundanz maskieren. Um diese technische Barriere zu überwinden und das Zelloberflächenproteom verschiedener Zelltypen mit Hilfe der massenspektrometrischen Proteomik genau zu definieren, ist es notwendig, das Zelllysat für Zelloberflächenproteine vor der Analyse auf dem Massenspektrometer anzureichern. In diesem Artikel wird ein detaillierter Arbeitsablauf für die Markierung von Zelloberflächenproteinen aus Krebszellen, die Anreicherung dieser Proteine aus dem Zelllysat und die anschließende Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse vorgestellt.

Für dieses Experiment charakterisierten wir das Zelloberflächenproteom einer Tumorzelllinie durch Markierung N-glykosylierte Membranproteine intakter Zellen mit Biotin markieren und diese markierten Proteine aus dem gesamten Zelllysat mittels Neutravidin-Pulldown anreichern (Abbildung 1). Weiterhin führten wir eine Proteom-Analyse mittels LC-MS/MS durch, um angereicherte Zelloberflächenproteine zu charakterisieren. Im Gegensatz zur Analyse des gesamten Zellproteoms bestand das Ziel ...

Hier beschreiben wir einen Proteomik-Workflow zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms verschiedener Zelltypen. Dieser Arbeitsablauf umfasst die Anreicherung von Proteinen auf der Zelloberfläche, die anschließende Probenvorbereitung, die Analyse mit einer LC-MS/MS-Plattform und die Datenverarbeitung mit spezieller Software.

"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Antigene zu untersuchen, die auf der Zelloberfläche verschiedener Zelltypen vorhanden sind, um Antigene zu finden, die für diesen Zell- oder Gewebetyp spezifisch sind. Die Technik, die wir hier vorstellen, ermöglicht die Anreicherung von Zellmembranproteinen aus einem Ganzzelllysat, um sie schließlich mit massenspektrometrischer Proteomik zu analysieren. Eine spezifische Anwendung dieses Protokolls besteht also darin, es auf Tumorzellen anzuwenden, um nach Antigenen zu suchen, die auf der Oberfläche dieser Krebszellen vorhanden sind, und nicht nach normalen Zellen, die als neuartige Ziele für Krebsimmuntherapien dienen könnten.Eine Sache, die Sie bei diesem Protokoll beachten sollten, ist, dass es wichtig sein kann, Ihre Probeneingabe für Ihr Experiment von Interesse zu optimieren. Es kann also mehrere Iterationen oder Titrationen brauchen, um die optimalen Bedingungen zu finden. Das Verfahren wird von Akul Naik, einem Junior-Spezialisten aus unserem Labor, vorgeführt.Zu Beginn wird das gefrorene, mit Biotin markierte Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius entnommen und auf Eis aufgetaut. Geben Sie 500 Mikroliter 2X Lysis Buffer in das Pellet, mischen Sie es gründlich und wirbeln Sie es 30 Sekunden lang kräftig auf. Beschallen Sie das Zelllysat auf Eis und zentrifugieren Sie das Lysat bei 17.200 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, um alle verbleibenden Ablagerungen zu pelletieren.Während das Lysat zentrifugiert, geben Sie 100 Mikroliter NeutrAvidin Agarose-Harzkügelchen in eine Filtrationssäule, die am Vakuumverteiler befestigt ist. Saugen Sie die Kügelchen sanft ab und waschen Sie sie, indem Sie 3 Milliliter Waschpuffer 1 darüber fließen lassen. Entfernen Sie die Filtrationssäule aus dem Vakuumverteiler, verschließen Sie den Boden und geben Sie das geklärte Zelllysat in die Säule mit den Kügelchen.Verschließen Sie die Oberseite der Säule und inkubieren Sie das Lysat mit den Kügelchen auf einem End-to-End-Rotor für 120 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nach Abschluss der Lysatinkubation setzen Sie die Filtrationssäule wieder auf den Vakuumverteiler und wenden Sie ein sanftes Vakuum an. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie fünf Milliliter Waschpuffer 1 darüber fließen lassen.Wiederholen Sie den Waschschritt mit fünf Millilitern Waschpuffer 2 und Waschpuffer 3. Sobald der letzte Waschpuffer vollständig durch die Perlen geflossen ist, entfernen Sie die Säule aus dem Verteiler. Geben Sie dann 100 Mikroliter Lyselösung zu den Kügelchen und geben Sie sie mit einer Pipette in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.Drehen Sie das Röhrchen kurz, um die Kügelchen abzusetzen, und entfernen Sie 50 Mikroliter der Lösung. Legen Sie das Rohr anschließend 10 Minuten lang bei 1000 U/min bei 65 Grad Celsius auf einen Heatblock-Shaker. Resuspendieren Sie das getrocknete Trypsin im Aufschlussröhrchen aus dem Kit, indem Sie 210 Mikroliter der Resuspendierungslösung hinzufügen und mehrmals auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass das gesamte getrocknete Trypsin resuspendiert wird.Am Ende der Kügelcheninkubation nehmen Sie es aus dem Heizblockschüttler und fügen Sie 50 Mikroliter der resuspendierten Trypsinlösung zu den Kügelchen hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es mindestens 90 Minuten lang bei 500 U/min, um das Protein zu verdauen. Sobald der Aufschluss abgeschlossen ist, überführen Sie die Lösung mit den Kügelchen in eine Spin-Säule und setzen Sie die Säule in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung ein.Drehen Sie das Röhrchen, um die verdaute Peptidlösung von den Kügelchen zu trennen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der Stopplösung hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen und die Peptidlösung anzusäuern. Platzieren Sie mit einem Röhrchenadapter eine Entsalzungssäule in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.Geben Sie die gesamte angesäuerte Peptidlösung in die Säule. Die Säule wird 3 Minuten lang bei 3.800 g gedreht, so dass die Lösung durch die Säule fließt. Verwerfen Sie den Durchfluss, da die Peptide nun an die Säule gebunden sind.Geben Sie 200 Mikroliter Waschlösung 1 in die Säule, schleudern Sie bei 3.800 g 3 Minuten lang bei Raumtemperatur und entsorgen Sie dann den Durchfluss. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 200 Mikrolitern Wash 2 Lösung. Übertragen Sie die Säule in ein neues markiertes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.Geben Sie 100 Mikroliter Elulösung in die Säule und drehen Sie sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 3.800 g. Die Peptide werden nun von der Säule in das Röhrchen eluiert. Geben Sie die Peptidlösung in eine Vakuumzentrifuge und lassen Sie sie über Nacht trocknen.Platzieren Sie die getrockneten Peptide bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Quantifizierung und Analyse auf dem Massenspektrometer bereit sind. Zur Charakterisierung der angereicherten Zelloberflächenproteine mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie wurde eine Proteomanalyse durchgeführt. Eine endgültige Peptidkonzentration von etwa 630 Nanogramm pro Mikroliter wurde auf der Grundlage des kolorimetrischen Peptidquantifizierungsassays erhalten.Massenspektrometrische Daten, die mit MaxQuant analysiert wurden, und die anschließende Datensatzanalyse der Zelloberflächenproteine ergaben 601 Oberflächenproteine in der Probe, etwa 27 % aller identifizierten Proteine. Hier ist ein Diagramm dargestellt, das die Verteilung des identifizierten Proteins im Andromeda-Score darstellt, und das Streudiagramm veranschaulicht die Korrelation von Probe zu Probe. Die Boxplots stellten die Variation von Lauf zu Lauf dar.Und das stichprobenweise Verteilungsdiagramm stellte die Datenqualität von Replikaten dar. Das Wichtigste, was Sie beachten sollten, ist, wo sich die Peptide bei jedem Schritt befinden. Zuerst sind sie in Lösung, dann werden sie bis zum Aufschluss an die Kügelchen gebunden, dann werden sie an die Entsalzungssäule gebunden, bis sie schließlich eluiert werden.Im Anschluss an dieses Verfahren gibt es verschiedene Möglichkeiten, eine Handvoll der identifizierten Proteine zu validieren, wie z. B. die gezielte Durchflusszytometrie und die gezielte Proteomik. Dies wird detailliertere Informationen über die Expressionsniveaus dieser Proteine in der Probe geben.

cell-surface-capture-workflow-for-label-free-quantification-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Eine einfache und spezifische Methode wurde für Fluoreszenzmarkierung und verbesserte Erkennung von Zelloberflächen-Proteine ​​ohne Fraktionierung Schritt demonstriert. Differential Fülle in Zelloberflächenproteine ​​wurde mittels zweidimensionaler (2-D)-Elektrophorese und Ettan ™ DIGE Technologie.

Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf...

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Zelloberflächen-Proteine ​​sind biologisch wichtige und weithin glykosyliert. Wir stellen hier eine Glykopeptid-Capture-Ansatz für einfache LC-MS basierte Proteomanalysen löslich zu machen, zu bereichern, und deglycosylieren diese Proteine.

Glycopeptid-Capture für Zelloberflächen Proteomics

Dargestellt ist eine flexible Informatik Workflow ermöglicht Multiplex bildbasierte Analyse fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Workflow quantifiziert nukleäre und zytoplasmatische Marker und berechnet Marker Translokation zwischen diesen Fächern. Verfahren für Störung von Zellen mit siRNA und zuverlässige Methode zur Markerdetektion durch indirekte Immunfluoreszenz in 96-Well-Formaten zur Verfügung gestellt.

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Interzellulären Kommunikation ist wichtig für die Steuerung verschiedener physiologischer Aktivitäten innerhalb und außerhalb der Zelle. Dieser Aufsatz beschreibt ein Protokoll zum Messen der räumlich-zeitliche Art der Einzelzellsekrete. Um dies zu erreichen, ist ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der markierungsfreien nanoplasmonische Erfassung mit Live Cell Imaging integriert.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP). Diese neuartige Methode ermöglicht bestimmte Isolierung und Charakterisierung der nachgeschalteten Proteomic zwei interagierenden Proteine während ausgenommen un komplexiert einzelne Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger während der Infektion durch Massenspektrometrie-basierte Proteomik zu profilieren. Dieses Protokoll verwendet die etikettenfreie Quantifizierung, um Veränderungen in der Proteinmenge sowohl von Wirten (z. B. Makrophagen) als auch von Erregern (z. B. Cryptococcus neoformans) in einem einzigen Experiment zu messen.

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

Lernen Sie die markierungsfreie Anreicherung von Zelloberflächenproteinen aus Zelllysaten für die Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung spezifischer Antigene auf Tumorzellen als potenzielle Ziele für Krebsimmuntherapien.

"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

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