"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Antigene zu untersuchen, die auf der Zelloberfläche verschiedener Zelltypen vorhanden sind, um Antigene zu finden, die für diesen Zell- oder Gewebetyp spezifisch sind. Die Technik, die wir hier vorstellen, ermöglicht die Anreicherung von Zellmembranproteinen aus einem Ganzzelllysat, um sie schließlich mit massenspektrometrischer Proteomik zu analysieren. Eine spezifische Anwendung dieses Protokolls besteht also darin, es auf Tumorzellen anzuwenden, um nach Antigenen zu suchen, die auf der Oberfläche dieser Krebszellen vorhanden sind, und nicht nach normalen Zellen, die als neuartige Ziele für Krebsimmuntherapien dienen könnten.

Eine Sache, die Sie bei diesem Protokoll beachten sollten, ist, dass es wichtig sein kann, Ihre Probeneingabe für Ihr Experiment von Interesse zu optimieren. Es kann also mehrere Iterationen oder Titrationen brauchen, um die optimalen Bedingungen zu finden. Das Verfahren wird von Akul Naik, einem Junior-Spezialisten aus unserem Labor, vorgeführt.

Zu Beginn wird das gefrorene, mit Biotin markierte Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius entnommen und auf Eis aufgetaut. Geben Sie 500 Mikroliter 2X Lysis Buffer in das Pellet, mischen Sie es gründlich und wirbeln Sie es 30 Sekunden lang kräftig auf. Beschallen Sie das Zelllysat auf Eis und zentrifugieren Sie das Lysat bei 17.200 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, um alle verbleibenden Ablagerungen zu pelletieren.

Während das Lysat zentrifugiert, geben Sie 100 Mikroliter NeutrAvidin Agarose-Harzkügelchen in eine Filtrationssäule, die am Vakuumverteiler befestigt ist. Saugen Sie die Kügelchen sanft ab und waschen Sie sie, indem Sie 3 Milliliter Waschpuffer 1 darüber fließen lassen. Entfernen Sie die Filtrationssäule aus dem Vakuumverteiler, verschließen Sie den Boden und geben Sie das geklärte Zelllysat in die Säule mit den Kügelchen.

Verschließen Sie die Oberseite der Säule und inkubieren Sie das Lysat mit den Kügelchen auf einem End-to-End-Rotor für 120 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nach Abschluss der Lysatinkubation setzen Sie die Filtrationssäule wieder auf den Vakuumverteiler und wenden Sie ein sanftes Vakuum an. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie fünf Milliliter Waschpuffer 1 darüber fließen lassen.

Wiederholen Sie den Waschschritt mit fünf Millilitern Waschpuffer 2 und Waschpuffer 3. Sobald der letzte Waschpuffer vollständig durch die Perlen geflossen ist, entfernen Sie die Säule aus dem Verteiler. Geben Sie dann 100 Mikroliter Lyselösung zu den Kügelchen und geben Sie sie mit einer Pipette in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.

Drehen Sie das Röhrchen kurz, um die Kügelchen abzusetzen, und entfernen Sie 50 Mikroliter der Lösung. Legen Sie das Rohr anschließend 10 Minuten lang bei 1000 U/min bei 65 Grad Celsius auf einen Heatblock-Shaker. Resuspendieren Sie das getrocknete Trypsin im Aufschlussröhrchen aus dem Kit, indem Sie 210 Mikroliter der Resuspendierungslösung hinzufügen und mehrmals auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass das gesamte getrocknete Trypsin resuspendiert wird.

Am Ende der Kügelcheninkubation nehmen Sie es aus dem Heizblockschüttler und fügen Sie 50 Mikroliter der resuspendierten Trypsinlösung zu den Kügelchen hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es mindestens 90 Minuten lang bei 500 U/min, um das Protein zu verdauen. Sobald der Aufschluss abgeschlossen ist, überführen Sie die Lösung mit den Kügelchen in eine Spin-Säule und setzen Sie die Säule in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung ein.

Drehen Sie das Röhrchen, um die verdaute Peptidlösung von den Kügelchen zu trennen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der Stopplösung hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen und die Peptidlösung anzusäuern. Platzieren Sie mit einem Röhrchenadapter eine Entsalzungssäule in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.

Geben Sie die gesamte angesäuerte Peptidlösung in die Säule. Die Säule wird 3 Minuten lang bei 3.800 g gedreht, so dass die Lösung durch die Säule fließt. Verwerfen Sie den Durchfluss, da die Peptide nun an die Säule gebunden sind.

Geben Sie 200 Mikroliter Waschlösung 1 in die Säule, schleudern Sie bei 3.800 g 3 Minuten lang bei Raumtemperatur und entsorgen Sie dann den Durchfluss. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 200 Mikrolitern Wash 2 Lösung. Übertragen Sie die Säule in ein neues markiertes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.

Geben Sie 100 Mikroliter Elulösung in die Säule und drehen Sie sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 3.800 g. Die Peptide werden nun von der Säule in das Röhrchen eluiert. Geben Sie die Peptidlösung in eine Vakuumzentrifuge und lassen Sie sie über Nacht trocknen.

Platzieren Sie die getrockneten Peptide bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Quantifizierung und Analyse auf dem Massenspektrometer bereit sind. Zur Charakterisierung der angereicherten Zelloberflächenproteine mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie wurde eine Proteomanalyse durchgeführt. Eine endgültige Peptidkonzentration von etwa 630 Nanogramm pro Mikroliter wurde auf der Grundlage des kolorimetrischen Peptidquantifizierungsassays erhalten.

Massenspektrometrische Daten, die mit MaxQuant analysiert wurden, und die anschließende Datensatzanalyse der Zelloberflächenproteine ergaben 601 Oberflächenproteine in der Probe, etwa 27 % aller identifizierten Proteine. Hier ist ein Diagramm dargestellt, das die Verteilung des identifizierten Proteins im Andromeda-Score darstellt, und das Streudiagramm veranschaulicht die Korrelation von Probe zu Probe. Die Boxplots stellten die Variation von Lauf zu Lauf dar.

Und das stichprobenweise Verteilungsdiagramm stellte die Datenqualität von Replikaten dar. Das Wichtigste, was Sie beachten sollten, ist, wo sich die Peptide bei jedem Schritt befinden. Zuerst sind sie in Lösung, dann werden sie bis zum Aufschluss an die Kügelchen gebunden, dann werden sie an die Entsalzungssäule gebunden, bis sie schließlich eluiert werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren gibt es verschiedene Möglichkeiten, eine Handvoll der identifizierten Proteine zu validieren, wie z. B. die gezielte Durchflusszytometrie und die gezielte Proteomik. Dies wird detailliertere Informationen über die Expressionsniveaus dieser Proteine in der Probe geben.