Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen

Die Ziele dieser ELISA-basierten Methode sind erstens, die Bindungsaffinität eines Zytokins an seinen Rezeptor zu bestimmen und zweitens, die Blockierungseffekte inhibitorischer Peptide der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Protein-Protein-Interaktionen zu beantworten, wie beispielsweise die Zytokin-Rezeptor-Bindung. Bindungsaffinitäten und deren Blockade können das allgemeine Verständnis der Interaktionsdynamik verbessern.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach durchzuführen ist, markierte Rezeptoren erzeugt und relativ günstig ist, aufgrund des einfachen Zugangs zu leicht verfügbaren Geräten wie einem ELISA-Reader. Obwohl diese Methode Einblicke in die Zytokin-Rezeptor-Interaktion geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie allgemeine Protein-Protein-Interaktionen und die Entwicklung von Blockierungsverbindungen zur Hemmung spezifischer Interaktionen angewendet werden. Bereiten Sie die Lösungen wie im Textprotokoll beschrieben vor.

Stellen Sie sicher, dass Sie den Karbonat-Beschichtungspuffer mit einer 0,22-Mikron-PES-Membran filtern. Verwenden Sie ein Vakuum. Bereiten Sie auch 10 verschiedene Konzentrationen jedes Liganden oder Peptids vor.

In diesem Video werden zwei Assays beschrieben, der erste ist die direkte Ligand-Rezeptor-Interaktion, ELISA. Sie kann verwendet werden, um die Dissociation-Konstante Rezeptor-Ligand zu messen, die die Bindungsaffinität von Rezeptor-Ligand repräsentiert. Der zweite Assay ist ein kürzlich optimierter kompetitiver Ligand-Rezeptor-Interaktions-ELISA.

Dies ermöglicht das Screening von Peptiden und anderen Blockierungsverbindungen, die die Rezeptor-Ligand-Interaktion stören. Bereiten Sie für Effizienz Multichannel-Pipetten für 96-Well-Platten vor und gießen Sie beim Entleeren deren Inhalt einfach aus. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Platte mit einem rekombinanten Rezeptor beschichten.

Verdünnen Sie zuerst den Rezeptor in Karbonatpufferin 100 Nanogramm pro Mikroliter. Beladen Sie dann die Plattenbrunnen mit 100 Mikroliter Rezeptorlösung. Schließen Sie die äußeren Wände aus, um den Plattenrand-Artefakt zu vermeiden.

Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius. Führen Sie alle Platteninkubationen mit sanftem Schwenken durch. Am nächsten Tag entfernen Sie die Beschichtungslösung und waschen Sie die Platte dreimal mit der Waschlösung, PBS mit einem Hauch von Tween 20.

Blockieren Sie als Nächstes die freien Rezeptor-Bindungsstellen, indem Sie 200 Mikroliter 5% PSA hinzufügen. Lassen Sie die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um den Block abzuschließen. Leeren Sie später die Brunnen und waschen Sie die Platte wie zuvor.

Laden Sie nun die Brunnen mit 100 Mikroliter der verschiedenen Verdünnungen des rekombinanten His-Tag-Liganden. Laden Sie jede Konzentration im Duplikat. Beladen Sie die Leerbrunnen mit PBS allein.

Inkubieren Sie dann die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation mit den Liganden waschen Sie die Platte dreimal mit Waschlösung. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter Aliquote des primären Anti-His-Maus-Monoklonal-Antikörpers in jedes Brunnen und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Nach dem Auswaschen des Antikörpers fügen Sie zu jedem Brunnen 100 Mikroliter der frisch zubereiteten TMB-Lösung aus gleichen Mengen der Stammsubstratlösungen A und B hinzu. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um das Licht zu vermeiden. Inkubieren Sie dann die Platte 45 Minuten bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie die Standardwaschtechnik, um den Sekundärantikörper zu entfernen. Fügen Sie nun zu jedem Brunnen 100 Mikroliter frisch zubereiteter TMB aus gleichen Mengen der Stammsubstratlösungen A und B hinzu. Bewahren Sie die Platte dann 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur auf. Fügen Sie dann nach ausreichender Farbentwicklung 50 Mikroliter Stammlösung zu jedem Brunnen hinzu.

Das Protokoll basiert auf der Annahme, dass das gemessene Signal aus spezifischer Bindung resultiert. Es kann notwendig sein, den Beitrag der unspezifischen Bindung zum Signal abzuschätzen. Lesen Sie dann die Plattenabsorptionswerte bei 450 Nanometern ab und fahren Sie mit der Berechnung des KD-Wertes fort.

Das kompetitive LRA-Verfahren folgt den gleichen Schritten wie das direkte LRA-Verfahren, außer einigen wichtigen Änderungen. Nach dem Waschen der überschüssigen Beschichtungsliganden von der Platte blockieren Sie die Plattenbrunnen. Fügen Sie 200 Mikroliter 5% BSA-Lösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Während der Inkubation bereiten Sie die rekombinanten His-Tag-Liganden in einer festen Konzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter in PBS vor. Bereiten Sie dann das Blockierungspeptid in verschiedenen Konzentrationen in PBS vor, von 10 Nanomolar bis 100 Mikromolar, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu garantieren. So kann der IC50-Wert für das Blockierungspeptid gefunden werden.

In den Kontrollbrunnen laden Sie die feste Ligandenkonzentration ohne Peptid, um die maximale Bindung abzuleiten. In den Leerbrunnen fügen Sie nur PBS ohne Ligand oder Peptid hinzu. In den anderen Brunnen fügen Sie 50 Mikroliter der Liganden und 50 Mikroliter jeder Peptidkonzentration hinzu.

Inkubieren Sie dann die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur und fahren Sie wie gewohnt fort. Die Dissociation-Konstanten zwischen drei verschiedenen Interferon-Ligand-Peptiden und der Rezeptor-Alpha-Untereinheit IL28R-a wurden mit dem direkten LRA bestimmt, wobei der Anteil der besetzten Bindungsstellen gegen den Logarithmus der jeweiligen Interferon-Konzentration aufgetragen wurde. Diese Ergebnisse veranschaulichen eine Bindungskurve, die analysiert werden kann, um den KD-Wert zu schätzen, indem die Daten an die Hill-Gleichung angepasst werden.

Ein Scatchard-Plot veranschaulicht die Kooperativität der Ligandbindung, letztendlich hat Interferon-Ligand 1 die höchste Bindungsaffinität, gefolgt von Interferon-Ligand 2 und Interferon-Ligand 3. Der Hill-Koeffizientenwert von mehr als 1 deutet auf eine erhöhte Affinität für zusätzliche Liganden nach der anfänglichen Ligand-Rezeptor-Interaktion hin. Als Nächstes wurde kompetitiver LRA verwendet, um den Einfluss eines Blockierungspeptids auf die Interaktion zwischen den Interferon-Ligand-Peptiden und der Rezeptoruntereinheit zu quantifizieren.

Der Anteil der besetzten Bindungsstellen für ein Interferon-Ligand-Peptid bei 10 Nanogramm pro Milliliter wird gegen den Logarithmus der Interferon-Peptid-Konzentration aufgetragen. Aus diesen Daten wurden die IC50-Werte geschätzt. Den berechneten Werten zufolge hemmte das Blockierungspeptid die Interaktion zwischen Interferon-Ligand 3 und IL28R-a am stärksten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden durchgeführt werden. Wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei dem Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass jede Sättigungskonzentration der Ligand-Rezeptor-Bindung, nach diesem Verfahren, die anderen Methoden wie durchgeführt werden können, um genauere KD-Werte zu erhalten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Ligand-Rezeptor-Interaktionen, inhibitorische Substanzen zu erforschen, um diese Interaktionen zu blockieren.