Name: Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Erfahren Sie ELISA-basierte Bindungs- und Wettbewerbsassays zur Bestimmung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht die Messung von Bindungsaffinitäten und die Identifizierung wirksamer blockierender Peptide.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zürich und Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Schweiz) für seine kritische Überprüfung des Manuskripts.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Zur Herstellung von Karbonat Beschichtungspuffer, lösen sich 0,36 g Na 2 CO 3 und 0,84 g NaHCO 3 in 100 ml destilliertem Wasser; Sterilfilter der Puffer durch ein Vakuum von 0,22 um Polyethersulfon (PES) Membranfilter und lagern bei RT bis zur Verwendung angetrieben werden. </li><li> Bereiten Waschlösung durch Zugabe von 0,05% v / v Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Bereiten Sie eine 5% Rinderserumalbumin (BSA) (Blocking-Lösung) in PBS-Lösung durch Auflösen von 5 g BSA (≥98%) in 100 ml PBS und lagern bei 4 ° C. </li><li> Rekombinante Rezeptor, Liganden und Blocking Peptide <ol><li> Reconstitutethe rekombinanten humanen Interleukin-Rezeptor-alpha-Untereinheit (IL28RA) und rekombinante His-markierten Liganden des menschlichen IFN (IFNL1-3) gemäß den Anweisungen des Herstellers und bei -80 ° C. Blockierende Peptide synthetisieren und verwendet wie zuvor 4 beschrieben. Verwenden PBS auf verschiedene Konzentrationen von Ligand vorbereitens und Peptide zur Verwendung in den Assays. </li></ol></li><li> An den primären Antikörper herzustellen, verdünnte 6x His monoklonalen Maus-Antikörper in PBS mit 0,1% BSA auf 1: 1.000-Verdünnung. Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG (H + L) in PBS mit 0,1% BSA in 1 an den sekundären Antikörper herzustellen, verdünnter: 10.000-Verdünnung. </li><li> Bereiten Sie TMB-Lösung durch die Reagenzien A und B Mischen gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bereiten Sie Stop - Lösung durch Zugabe von 5 N Schwefelsäure (H 2 SO 4) in destilliertem Wasser und lagern bei RT. </li></ol> 2. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) HINWEIS: Die direkte Ligand-Rezeptor - Wechselwirkung ELISA (direct LRA, 1) können die Rezeptor-Ligand - Dissoziationskonstante (K D), als Maß für die Rezeptor-Liganden - Bindungsaffinität zu messen , verwendet werden. Der Wettbewerb Ligand-Rezeptor - Wechselwirkung ELISA (Wettbewerb LRA, Abbildung 2) alleOWS Screening von Peptiden (und andere blockierende Verbindungen), die mit der Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor zu interferieren handeln. Das Basisprotokoll , die zuvor 5 veröffentlicht wurde , wurde weiter optimiert. Hinweis: In beiden ELISA Methoden Mehrkanalpipette nach Lösungen zu den Vertiefungen von 96-Well-Platte in jedem Schritt hinzugefügt wird. In Lösung dekantieren oder Waschschritte, werfen die Lösungen direkt in die Spüle. <ol><li> Direkter Ligand-Rezeptor-Interaktion Assay (direkte LRA) HINWEIS: Eine Abbildung des Workflows (siehe Abbildung 1). <ol><li> Lackplatte mit rekombinanten Rezeptor <ol><li> Verdünne den rekombinanten Rezeptor in Carbonat-Puffer auf eine Endkonzentration von 100 ng / &amp; mgr; l. Coat Wells von 96-Well-Mikrotiterplatte mit festen Rezeptor-Konzentration (100 ng / ul) durch Pipettieren von 100 ul in jede Vertiefung einer Mehrkanalpipette mit. Ausschließen Außenwände der Platte gut Kante Artefakt zu vermeiden. Decken Sie die Platte mit einem Deckel und brüten diebei 4 ° CO / N Platte. </li></ol></li><li> Sperren und Zusatz von Liganden <ol><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie die Beschichtungslösung durch die Platte gegen das Waschbecken kippen und die Platte 3-mal mit Waschlösung (PBS + 0,05% v / v Tween 20) waschen. </li><li> Blockieren Sie die freien Rezeptor-Bindungsstellen in der beschichteten Platte unter Verwendung von 200 ul 5% BSA-Lösung in jede Vertiefung einer Mehrkanalpipette mit und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei RT. </li><li> Entsorgen Sie die Blockierungslösung (siehe Schritt 2.1.2.1.) Und waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschlösung. </li><li> Bereiten Sie die rekombinante His-markierte Liganden bei verschiedenen Konzentrationen (beispielsweise 8 &amp; mgr; g / ml, 4 ug / ml, 2 ug / ml, 1 &amp; mgr; g / ml, 0,5 ug / ml, 0,25 &amp; mgr; g / ml, 0,125 &amp; mgr; g / ml, 0,063 &amp; mgr; g / ml, 0,031 &amp; mgr; g / ml, 0,0 ug / ml) in PBS. In nur PBS in den leeren Brunnen. </li><li> Füge 100 ul jeder Ligandenkonzentration in die Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung und inkubiere die Platte für 2 h bei RT ermöglicht Rezeptor-LigandenInteraktion. </li></ol></li><li> Inkubation mit Antikörper <ol><li> Nach der Inkubation mit den Liganden, waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschlösung. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l der primären anti-His monoklonalen Maus-Antikörperlösung (1: 1000) in jede Vertiefung. </li><li> Die Platte bei RT für 2 h; nach der Inkubation, entsorgen Sie die Antikörperlösung (siehe Schritt 2.1.2.1.) und waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschlösung. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l HRP gekoppelten Ziege-anti-Maus-IgG-sekundärem Antikörper-Lösung (1: 10.000) in jede Vertiefung. Die Platte 45 min bei RT. </li><li> Entsorgen Sie die Antikörperlösung (siehe Schritt 2.1.2.1.) Und waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschlösung. </li></ol></li><li> Zugabe von Substrat und Entwicklung <ol><li> Bringen Sie die TMB Substratlösungen auf RT und bereiten TMB Substratlösung A und B in 1: 1-Verhältnis. 100 l frisch hergestellte Substrat in jede Vertiefung und halten die Platte bei RT für 15-30 min. Nach ausreichender col<html> oder Entwicklung werden 50 &amp; mgr; l Stopplösung. </li></ol></li><li> Das Lesen der Platte und Datenanalyse HINWEIS: Die beschriebene Protokoll wird auf der Annahme basiert, dass das gemessene Signal von spezifischen Bindungs ​​ansteigt. Es könnte erforderlich sein, den Beitrag der unspezifischen Bindung an das Signal zu schätzen, aber dies ist aus dem Geltungsbereich dieses Protokolls. <ol><li> Die Absorption (optische Dichte, OD) direkt bei 450 nm. </li><li> Ziehen Sie das Hintergrundsignal aus den gemessenen OD-Werte und normalisieren. Wandeln Sie alle Werte der Ligandenkonzentration auf logarithmische Skala (Basis 10, log 10). </li><li> Plot der normierten und Hintergrund korrigierten OD - Werte (Y-Achse entspricht dem Anteil der besetzten Rezeptor - Bindungsstellen) gegen den Logarithmus der Ligandenkonzentration (X-Achse, 10 Skala log). </li><li> Um den K D - Wert zu schätzen, passen die Daten an die folgende Form der Hill - Gleichung: tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg &quot;/&gt; HINWEIS: Hier Y bezeichnet den Anteil der besetzten Rezeptor - Bindungsstellen und Y max die maximale Bindung; [L] die Konzentration an freiem Liganden und der Hill-Koeffizient. Wenn es nur eine Bindungsstelle für den Liganden ist, ist der Hill-Koeffizient n = 1. Bei Systemen mit mehr als einem Ligandenbindungsstelle, die Bindungs ​​weist positive Kooperativität, wenn n&gt; 1 ist, negativen Kooperativität wenn n &lt;1 und keine Kooperativität wenn n = 1. die mikroskopische Dissoziationskonstante wird bezeichnet und entspricht der Hälfte der maximalen wirksamen Konzentration EC 50 6. Die scheinbare Dissoziationskonstante K d = (K D) n. Im einfachsten Fall , in dem n = 1, die Dissoziationskonstante entspricht dem Ligandenkonzentration , bei der die Hälfte der Rezeptorbindungsstellen besetzt sind , und K d = K D. Dieses Modell geht davon aus Massenaktion unter Gleichgewichtsbedingungen verbindlich, sowie, dass nur ein kleiner Bruchteildie zugegebene Liganden an den Rezeptor gebunden, das heißt, [L] &gt;&gt; [RL]. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig1.jpg" /> Abbildung 1. Direkte Ligand-Rezeptor-Interaktion Assay (direkte LRA). Schritt- für -Schritt - Protokoll für die direkte LRA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li> Wettbewerb Ligand-Rezeptor-Interaktion Assay (Wettbewerbs LRA) HINWEIS:. Für eine Darstellung des Workflows siehe Abbildung 2 Der Wettbewerb LRA Verfahren folgt die gleichen Schritte wie die direkte LRA (Beschichtung der Platte, Antikörperinkubation, Entwicklung Platte) , mit Ausnahme wichtige Veränderungen in den Liganden und Peptiden Additionsschritt. Die richtige Negativkontrollen sind für diesen Test von wesentlicher Bedeutung. In einer früheren Screening-Studie &lt;sup&gt; 4, das verschlüsselte Blockierung Peptid zeigte keine antagonistische Wirkungen. <ol><li> Blocking - Zusatz von Liganden und Blocking Peptide <ol><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie die Beschichtungslösung und waschen Sie die Platte (siehe 2.1.2.1). </li><li> Blockieren Sie die beschichtete Platte durch Zugabe von 200 ul 5% BSA-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei RT. </li><li> Bereiten Sie die rekombinante His-markierte Liganden (IFNL1-3) bei einer festen Konzentration (2x-20 ng / ml) in PBS. </li><li> Bereiten Sie die blockierende Peptid (siehe Tabelle 3) mit unterschiedlichen Konzentrationen von 10 nM bis 100 uM in PBS Bereich eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu gewährleisten. ANMERKUNG: Dies ermöglicht die anschließende Bestimmung des IC 50 -Wertes für das Blockierungspeptid. In Kontrollvertiefungen, fügen Sie nur feste Ligand-Konzentration ohne Peptid das Maximum (100%) Bindung abzuleiten. In dem leeren, fügen Sie nur PBS ohne Ligand oder Peptid. </li><li> Je 50 ul der Liganden (IFNL1-3) und 50 ul jeder peptide Konzentration auf die Vertiefungen in Duplikaten. </li><li> Inkubieren der Platte für 2 h bei RT. </li></ol></li><li> Das Lesen der Platte und Datenanalyse HINWEIS: Die beschriebene Protokoll wird auf der Annahme basiert, dass das gemessene Signal von spezifischen Bindungs ​​ansteigt. Es könnte erforderlich sein, den Beitrag der unspezifischen Bindung an das Signal zu schätzen, aber dies ist aus dem Geltungsbereich dieses Protokolls. <ol><li> Die Absorption (optische Dichte, OD) direkt bei 450 nm. </li><li> Ziehen Sie das Hintergrundsignal aus den gemessenen OD-Werte und normalisieren. Wandeln Sie alle Werte der Peptidkonzentration auf logarithmische Skala (Basis 10, log 10). </li><li> Plot der normierten und Hintergrund korrigierten OD - Werte (Y-Achse entspricht dem Anteil der besetzten Rezeptor - Bindungsstellen) gegen den Logarithmus der Ligandenkonzentration (X-Achse, 10 Skala log). </li><li> Um die IC - 50 - Wert zu schätzen, passen die Daten an die folgende Gleichung: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575eq2.jpg" /> HINWEIS: Hier [P] ist die Peptidkonzentration und der Hill-Anstieg. Der Hügel Steigung beschreibt die Steilheit der Dosis-Wirkungs-Kurve. Der IC 50 entspricht der Inhibitorkonzentration , bei der 50% Inhibierung der Bindung zwischen Ligand und Rezeptor beobachtet wird. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig2.jpg" /> Abbildung 2. Wettbewerb Ligand-Rezeptor-Interaktion Test (Wettbewerb LRA). Schritt- für -Schritt - Protokoll für den Wettbewerb LRA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<ol><li>Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+study+ligand-receptor+interactions+and+receptor+activation+by+TNF+superfamily+members%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members.</a> Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+analysis+of+anti-citrullinated+protein%2Fpeptide+antibody+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity.</a> Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell-adhesion+molecule+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance.</a> Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).</li>
<li>Egli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-28B+is+a+key+regulator+of+B-+and+T-cell+vaccine+responses+against+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza.</a> PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).</li>
<li>Rosenbluh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positively+charged+peptides+can+interact+with+each+other%2C+as+revealed+by+solid+phase+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays.</a> Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).</li>
<li>Goutelle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hill+equation%3A+a+review+of+its+capabilities+in+pharmacological+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+clinical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling.</a> Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).</li>
<li>Levin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+derived+from+HIV-1+integrase+that+bind+Rev+stimulate+viral+genome+integration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration.</a> PLoS One. 4, e4155(2009).</li>
<li>Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+interferon-lambda+family+on+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections.</a> Emerging infectious diseases. , e51(2014).</li>
<li>Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+human+interferon+lambda+and+what+it+has+taught+us%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The structure of human interferon lambda and what it has taught us.</a> J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).</li>
<li>Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostability+of+salt+bridges+versus+hydrophobic+interactions+in+proteins+probed+by+statistical+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+information+and+modeling%22%5BJournal%5D)">Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials.</a> Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).</li>
<li>Yuzlenko, O., Lazaridis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+ionizable+amino+acid+side+chains+at+a+lipid+bilayer-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+physical+chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface.</a> The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).</li>
<li>Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+two+buried+salt+bridges+in+the+stability+and+folding+pathway+of+barnase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase.</a> Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).</li>
</ol>

A.E. wurde durch Forschungsstipendien des Programms „SNSF Ambizione Score“ (PZ00P3_154709), „Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte“ der Universität Basel, der Stiftung Infektionskrankheiten Basel und der Bangeter Rhyner Stiftung unterstützt. J.L. dankt für die Unterstützung durch ein iPhD-Stipendium der SystemsX.ch-Initiative im Systemsbiologie-Programm (9. Ausschreibung).

ELISA ist ein Standard und gut etablierte Methode für viele Laboratorien. Wir haben weiter modifiziert und verbessert eine zuvor Methode 5,7 veröffentlicht. Die aufgezeigte Schritt- für -Schritt - Protokoll zeigt , wie es in einfacher Weise verwendet werden können , um die K d -Werte von Ligand-Rezeptor - Wechselwirkungen zu bestimmen. Darüber hinaus ist die IC50 eines Blockierungspeptid, das bestimmt werden kann, mit dem Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung stört. Wesentli...

Ein umfassendes Verständnis der Signalwege erfordert detailliertes Wissen über die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung. Die meisten Methoden zur Beurteilung der Wechselwirkung eines bestimmten Liganden mit seinem spezifischen Rezeptor sind teuer, zeitaufwendig, arbeitsintensiv und erfordern eine spezielle Ausrüstung und Know - how 1. Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und zuverlässige Punkt-für-Punkt-Protokolle den Liganden-Rezeptor-Interaktion an ein Enzym linked immunosorbent assay (ELISA) basieren, zu untersuchen: den direkten Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung-Assay (LRA) und den Wettbewerb LRA. ELISA ist ein sehr empfindlich, spezifisch und leicht verfügbare Technik routinemäßig in fast jedem Labor eingesetzt. ELISA kann in verschiedener Weise durchgeführt und angepasst werden. Die vorgestellten Protokolle werden für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen verschiedenen lambda Interferone (INFLs) und deren Rezeptor optimiert. Die direkte LRA ermöglicht eine quantificatiauf der Ligand-Rezeptor in Bezug auf Ligandenkonzentration Bindung und somit eine Bindungskurve ergibt. Verwendung eines geeigneten Modells für den Liganden-Rezeptor - Interaktion können die Daten analysiert werden , weiter die Dissoziationskonstante (K D) zu schätzen. In dem vorgestellten Protokoll wird die allgemein verwendete Hill-Gleichung, die Ligand-Rezeptor-Bindung an Modell angewendet. Obwohl andere Verfahren wie beispielsweise die Oberflächenplasmonresonanz - Technologie 2,3 die Bestimmung der Bindungsaffinitäten zwischen zwei Proteinen zu ermöglichen, ist diese Technik oft arbeitsintensiv, teuer und erfordert eine spezielle Laborausrüstung. Der Wettbewerb LRA ermöglicht das Screening von inhibitorischen Peptide: Die Ligand-Rezeptor-Bindung wird in Bezug auf Peptidkonzentration quantifiziert. Dies ergibt eine Dosis-Wirkungs-Kurve, die die hemmende Wirkung des Peptids beschreibt. Die Daten können weitere 50 die Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC abzuschätzen analysiert werden </sub&gt;) des Blockierungspeptids. Beide ELISA-Protokolle sind einfach zu bedienen und kann auf ein breites Spektrum an Forschungsfragen angepasst werden. Rekombinante Proteine ​​jeglicher Art verwendet werden, um zuverlässig und schnell die Wechselwirkungsteile bestimmen. Darüber hinaus kann der Wettbewerb LRA verwendet werden, um kritische Interaktionsstellen von Liganden und Rezeptoren zu bestimmen durch Verwendung von blockierenden Peptiden, die ausgelegt sind, entweder den Liganden oder den Rezeptor zu imitieren. Wenn das Blockierungspeptid effiziente und spezifische Hemmung zeigt, nimmt das Peptid eine kritische Interaktionsstelle des Liganden (wenn das Peptid-Mimetika der Rezeptor) oder des Liganden (wenn das Peptid-Mimetika der Ligand). Das erste Protokoll der K D -Wert Bestimmung verschiedener INFLs beschreibt und die alpha - Untereinheit von ihrer Rezeptor, dh der Interleukin-28 - Rezeptor (IL28RA) die direkte LRA verwenden. Als nächstes zeigt das zweite Protokoll, wie die Fähigkeit eines langen Peptid 20 Aminosäuren zu bestimmen,die INFL-IL28RA Wechselwirkungen hemmen. Das Peptid wurde entwickelt mit IFNLs an ihren Rezeptor-Bindungsstelle konkurrieren, und ermöglicht somit ein Molekular Verständnis der Wechselwirkung. Darüber hinaus kann dieses Peptid verwendet werden IL28RA in in vitro - Experimenten zu blockieren , die Auswirkungen auf nachgeschalteten Signaleffekte 4 zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>ELISA-Platte</td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>Merck</td><td>497-19-8</td><td>Für ELISA-Platten-Beschichtungspuffer</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonat(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>144-55-8</td><td>Für ELISA-Platten-Beschichtungspuffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td>5% BSA in PBS zum Blockieren</td></tr><tr><td>rhIL-28R&alpha;/IFN&lambda;R1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5260-MR</td><td>Rekombinanter humaner Interleukin-28-Rezeptor alpha</td></tr><tr><td>rhIL-29/IFN&lambda;1</td><td>R&amp;D systems</td><td>1598-IL/CF</td><td>Rekombinantes humanes Interleukin-29/Trägerfrei/C-terminal 10-His-Tag</td></tr><tr><td>rhIL-28A/IFN&lambda;2</td><td>R&amp;D systems</td><td>1587-IL/CF</td><td>Rekombinantes humanes Interleukin-28A/Trägerfrei/C-terminal 6-His-Tag</td></tr><tr><td>rhIL-28B/IFN&lambda;3</td><td>R&amp;D systems</td><td>5259-IL/CF</td><td>Rekombinantes humanes Interleukin-28B/Trägerfrei/C-terminal 6-His-Tag</td></tr><tr><td>6x His Monoklonaler Antikörper (Maus)</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td>Primärantikörper zum Erfassen von His-markierten Liganden</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse igG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-035-166</td><td>Pferde-Radieschen-Peroxidase-konjugiertes Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>BDoptEIA TMB-Reagenz-Set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>ELISA-TMB-Substratlösung</td></tr><tr><td>Schwefelsäure (H2SO4)</td><td>Fulka</td><td>84720</td><td>5 N H2SO4 (Enzymreaktionsstopplösung)</td></tr><tr><td>Synergy/H1 - Mikroplatten-Reader</td><td>BioTeK</td><td></td><td>ELISA-Platten-Reader</td></tr></tbody></table>

ein elisa-basierte bindung und wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, ligand-rezeptor-wechselwirkungen

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

Ein umfassendes Verständnis von Signalwegen erfordert detailliertes Wissen über die Ligand-Rezeptor-Interaktion. Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und zuverlässige punktuelle Protokolle von enzymgekoppelten Immunadsorptionstests (ELISAs) zur Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen: den direkten Ligand-Rezeptor-Interaktionstest (LRA) und den kompetitiven LRA. Als Fallstudie wird die ELISA-basierte Analyse der Interaktion zwischen verschiedenen Lambda-Interferonen (IFNLs) und der Alpha-Untereinheit ihres Rezeptors (IL28RA) vorgestellt: Der direkte LRA wird zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten (KD-Werte) zwischen Rezeptor und IFN-Liganden verwendet, und der kompetitive LRA zur Bestimmung der inhibitorischen Kapazität eines Oligopeptids, das entwickelt wurde, um mit den IFNLs an ihrer Rezeptorbindungsstelle zu konkurrieren. Analytische Schritte zur Schätzung von KD- und halbmaximaler inhibitorischer Konzentration (IC50)-Werten werden beschrieben. Schließlich hebt die Diskussion die Vor- und Nachteile der vorgestellten Methode hervor und erläutert, wie die Ergebnisse ein besseres molekulares Verständnis von Ligand-Rezeptor-Interaktionen ermöglichen.

Die Dissoziationskonstanten zwischen INFL1-3 und deren Rezeptor alpha-Untereinheit IL28RA wurden unter Verwendung des direkten LRA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3: Der Anteil an besetzten Bindungsstellen aufgetragen gegen den Logarithmus der jeweiligen IFN - Konzentration. Die Scatchard-Plot der Daten wird in der rechten unteren Ecke des Bildschirms angezeigt. Die Ergebnisse zeigen , dass die direkte LRA eine Bindungskurve ergibt, was die K D -Wer...

Die vorgestellten Protokolle beschreiben zwei enzymgekoppelte Immunsorbentassays (ELISA) basierende Techniken zur schnellen Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen: Der erste Assay ermöglicht die Bestimmung der Dissoziationskonstante zwischen Ligand und Rezeptor. Der zweite Assay ermöglicht eine schnelle Überprüfung von blockierenden Peptiden für Ligand-Rezeptor-Interaktionen.

Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Die Ziele dieser ELISA-basierten Methode sind erstens, die Bindungsaffinität eines Zytokins an seinen Rezeptor zu bestimmen und zweitens, die Blockierungseffekte inhibitorischer Peptide der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Protein-Protein-Interaktionen zu beantworten, wie beispielsweise die Zytokin-Rezeptor-Bindung. Bindungsaffinitäten und deren Blockade können das allgemeine Verständnis der Interaktionsdynamik verbessern.Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach durchzuführen ist, markierte Rezeptoren erzeugt und relativ günstig ist, aufgrund des einfachen Zugangs zu leicht verfügbaren Geräten wie einem ELISA-Reader. Obwohl diese Methode Einblicke in die Zytokin-Rezeptor-Interaktion geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie allgemeine Protein-Protein-Interaktionen und die Entwicklung von Blockierungsverbindungen zur Hemmung spezifischer Interaktionen angewendet werden. Bereiten Sie die Lösungen wie im Textprotokoll beschrieben vor.Stellen Sie sicher, dass Sie den Karbonat-Beschichtungspuffer mit einer 0,22-Mikron-PES-Membran filtern. Verwenden Sie ein Vakuum. Bereiten Sie auch 10 verschiedene Konzentrationen jedes Liganden oder Peptids vor.In diesem Video werden zwei Assays beschrieben, der erste ist die direkte Ligand-Rezeptor-Interaktion, ELISA. Sie kann verwendet werden, um die Dissociation-Konstante Rezeptor-Ligand zu messen, die die Bindungsaffinität von Rezeptor-Ligand repräsentiert. Der zweite Assay ist ein kürzlich optimierter kompetitiver Ligand-Rezeptor-Interaktions-ELISA.Dies ermöglicht das Screening von Peptiden und anderen Blockierungsverbindungen, die die Rezeptor-Ligand-Interaktion stören. Bereiten Sie für Effizienz Multichannel-Pipetten für 96-Well-Platten vor und gießen Sie beim Entleeren deren Inhalt einfach aus. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Platte mit einem rekombinanten Rezeptor beschichten.Verdünnen Sie zuerst den Rezeptor in Karbonatpufferin 100 Nanogramm pro Mikroliter. Beladen Sie dann die Plattenbrunnen mit 100 Mikroliter Rezeptorlösung. Schließen Sie die äußeren Wände aus, um den Plattenrand-Artefakt zu vermeiden.Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius. Führen Sie alle Platteninkubationen mit sanftem Schwenken durch. Am nächsten Tag entfernen Sie die Beschichtungslösung und waschen Sie die Platte dreimal mit der Waschlösung, PBS mit einem Hauch von Tween 20.Blockieren Sie als Nächstes die freien Rezeptor-Bindungsstellen, indem Sie 200 Mikroliter 5% PSA hinzufügen. Lassen Sie die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um den Block abzuschließen. Leeren Sie später die Brunnen und waschen Sie die Platte wie zuvor.Laden Sie nun die Brunnen mit 100 Mikroliter der verschiedenen Verdünnungen des rekombinanten His-Tag-Liganden. Laden Sie jede Konzentration im Duplikat. Beladen Sie die Leerbrunnen mit PBS allein.Inkubieren Sie dann die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation mit den Liganden waschen Sie die Platte dreimal mit Waschlösung. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter Aliquote des primären Anti-His-Maus-Monoklonal-Antikörpers in jedes Brunnen und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur.Nach dem Auswaschen des Antikörpers fügen Sie zu jedem Brunnen 100 Mikroliter der frisch zubereiteten TMB-Lösung aus gleichen Mengen der Stammsubstratlösungen A und B hinzu. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um das Licht zu vermeiden. Inkubieren Sie dann die Platte 45 Minuten bei Raumtemperatur.Verwenden Sie die Standardwaschtechnik, um den Sekundärantikörper zu entfernen. Fügen Sie nun zu jedem Brunnen 100 Mikroliter frisch zubereiteter TMB aus gleichen Mengen der Stammsubstratlösungen A und B hinzu. Bewahren Sie die Platte dann 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur auf. Fügen Sie dann nach ausreichender Farbentwicklung 50 Mikroliter Stammlösung zu jedem Brunnen hinzu.Das Protokoll basiert auf der Annahme, dass das gemessene Signal aus spezifischer Bindung resultiert. Es kann notwendig sein, den Beitrag der unspezifischen Bindung zum Signal abzuschätzen. Lesen Sie dann die Plattenabsorptionswerte bei 450 Nanometern ab und fahren Sie mit der Berechnung des KD-Wertes fort.Das kompetitive LRA-Verfahren folgt den gleichen Schritten wie das direkte LRA-Verfahren, außer einigen wichtigen Änderungen. Nach dem Waschen der überschüssigen Beschichtungsliganden von der Platte blockieren Sie die Plattenbrunnen. Fügen Sie 200 Mikroliter 5% BSA-Lösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur.Während der Inkubation bereiten Sie die rekombinanten His-Tag-Liganden in einer festen Konzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter in PBS vor. Bereiten Sie dann das Blockierungspeptid in verschiedenen Konzentrationen in PBS vor, von 10 Nanomolar bis 100 Mikromolar, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu garantieren. So kann der IC50-Wert für das Blockierungspeptid gefunden werden.In den Kontrollbrunnen laden Sie die feste Ligandenkonzentration ohne Peptid, um die maximale Bindung abzuleiten. In den Leerbrunnen fügen Sie nur PBS ohne Ligand oder Peptid hinzu. In den anderen Brunnen fügen Sie 50 Mikroliter der Liganden und 50 Mikroliter jeder Peptidkonzentration hinzu.Inkubieren Sie dann die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur und fahren Sie wie gewohnt fort. Die Dissociation-Konstanten zwischen drei verschiedenen Interferon-Ligand-Peptiden und der Rezeptor-Alpha-Untereinheit IL28R-a wurden mit dem direkten LRA bestimmt, wobei der Anteil der besetzten Bindungsstellen gegen den Logarithmus der jeweiligen Interferon-Konzentration aufgetragen wurde. Diese Ergebnisse veranschaulichen eine Bindungskurve, die analysiert werden kann, um den KD-Wert zu schätzen, indem die Daten an die Hill-Gleichung angepasst werden.Ein Scatchard-Plot veranschaulicht die Kooperativität der Ligandbindung, letztendlich hat Interferon-Ligand 1 die höchste Bindungsaffinität, gefolgt von Interferon-Ligand 2 und Interferon-Ligand 3. Der Hill-Koeffizientenwert von mehr als 1 deutet auf eine erhöhte Affinität für zusätzliche Liganden nach der anfänglichen Ligand-Rezeptor-Interaktion hin. Als Nächstes wurde kompetitiver LRA verwendet, um den Einfluss eines Blockierungspeptids auf die Interaktion zwischen den Interferon-Ligand-Peptiden und der Rezeptoruntereinheit zu quantifizieren.Der Anteil der besetzten Bindungsstellen für ein Interferon-Ligand-Peptid bei 10 Nanogramm pro Milliliter wird gegen den Logarithmus der Interferon-Peptid-Konzentration aufgetragen. Aus diesen Daten wurden die IC50-Werte geschätzt. Den berechneten Werten zufolge hemmte das Blockierungspeptid die Interaktion zwischen Interferon-Ligand 3 und IL28R-a am stärksten.Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden durchgeführt werden. Wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei dem Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass jede Sättigungskonzentration der Ligand-Rezeptor-Bindung, nach diesem Verfahren, die anderen Methoden wie durchgeführt werden können, um genauere KD-Werte zu erhalten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Ligand-Rezeptor-Interaktionen, inhibitorische Substanzen zu erforschen, um diese Interaktionen zu blockieren.

an-elisa-based-binding-competition-method-to-rapidly-determine-ligand

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

In diesem Video demonstrieren wir die Biolayer-Interferometrie (BLI)-Technologie, um die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Liganden und Zielanalyten in Echtzeit zu detektieren. BLI misst Veränderungen im Interferenzmuster von weißem Licht, das von einer Schicht immobilisierter Liganden auf einer Biosensoroberfläche reflektiert wird, wenn sie mit Analyten in Lösung interagieren.

Biolayer-Interferometrie-Technologie zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Ligand und Analyt

In diesem Video beschreiben wir einen auf Durchflusszytometrie basierenden kompetitiven Bindungsassay, um die Wechselwirkungen zwischen dem CXC-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) und seinem fluoreszenzmarkierten natürlichen Liganden CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) in Gegenwart eines auf CXCR4 abzielenden kleinen Moleküls nachzuweisen. Die Inkubation von CXCR4-exprimierenden Zellen mit niedrigeren Konzentrationen kleiner Moleküle ermöglicht bis zu einem gewissen Grad die Bindung von CXCR4-CXCL12, die...

Kompetitiver Bindungsassay zur Identifizierung von Verbindungen, die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen stören

Dieses Video zeigt die auf Reporter-Assays basierende Detektion der Rezeptor-Liganden-Interaktion. Die erfolgreiche Rezeptor-Liganden-Interaktion aktiviert den nachgeschalteten Signalweg und bewirkt die Bildung und Freisetzung von Zytokinen als sekretorische Reportermoleküle in der Lösung, was mit ELISA bestätigt wird.

ELISA-basierter Reporter-Assay zur Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Interaktion in BW-Zellen

In diesem Video werden Biomembran-Kraftsonden (BFPs) verwendet, um die Kräfte zwischen Rezeptoren und Liganden zu messen. Diese Technik kann Wechselwirkungen erkennen, indem der Druck überwacht wird, der erforderlich ist, um die Bindungen zwischen dem pMHC, das auf den Sondenkügelchen konjugiert ist, und den TCRs auf den Zielzellen aufzubrechen.

Biomembran-Kraftsonde zur Quantifizierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik.

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Ein Protokoll für das Screening kleiner molekularer Wirkstoffe, das auf der In-situ-Synthese von ultrakleinen fluoreszierenden Gold-Nanoclustern (Au-NCs) unter Verwendung von wirkstoffbeladenen Proteinen als Template basiert, wird vorgestellt. Diese Methode ist einfach, um die Bindungsaffinität von Wirkstoffen an ein Zielprotein durch ein sichtbares Fluoreszenzsignal zu bestimmen, das von den Protein-Template-Au-NCs emittiert wird.

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Ein detailliertes Protokoll, eine Titrierung ELISA durchzuführen wird beschrieben. Darüber hinaus wird ein neuartiger Algorithmus, Titration ELISAs zu bewerten und zu einer Dissoziationskonstante Bindung eines lösliche Liganden an einen Mikrotiter Platte immobilisiert Rezeptor präsentiert.

Titration ELISA als eine Methode zur Bestimmung der Dissoziationskonstante Rezeptor Liganden Interaktion

Eis Bindungsproteine ​​(IBPs), auch als Frostschutzmittel Proteine ​​bekannt, hemmen Eiswachstum und sind eine vielversprechende Additiv zur Verwendung bei der Kryokonservierung von Gewebe. Das wichtigste Instrument zur IBPs zu untersuchen ist die Nanoliter Osmometer. Wir haben ein Haus entworfen Kühlstufe auf einem optischen Mikroskop montiert und kontrolliert über eine custom-built LabVIEW Routine. Die Nanoliter Osmometer hier beschriebenen manipulierten die Temperatur der Probe in einem...

LabVIEW-betriebenen Novel Nanoliter Osmometer für Ice Binding Protein Untersuchungen

Frostschutzproteine (AFPs) binden an bestimmte Eisebenen, um das Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. Die Fluoreszenzbasierte Eisebene (FIPA)-Analyse ist eine Modifikation der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. AFPs werden fluoreszierend beschriftet, in makroskopische Einzeleiskristalle integriert und unter UV-Licht visualisiert.

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Erfahren Sie ELISA-basierte Bindungs- und Wettbewerbsassays zur Bestimmung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht die Messung von Bindungsaffinitäten und die Identifizierung wirksamer blockierender Peptide.

Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen

Weitere Videos entdecken