Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen

Die Ziele dieser ELISA-basierten Methode sind erstens, die Bindungsaffinität eines Zytokins zu seinem Rezeptor zu bestimmen und zweitens, die blockierende Wirkung von inhibitorischen Peptiden der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie z.B. der Zytokin-Rezeptor-Bindung, zu beantworten. Bindungsaffinitäten und deren Blockade können das allgemeine Verständnis von Interaktionsdynamiken erhöhen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen ist, Markierungsrezeptoren erzeugt und aufgrund des einfachen Zugangs zu leicht verfügbaren wie ELISA-Readern relativ billig ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die Interaktion von Zytokinrezeptoren geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. allgemeine Protein-Protein-Wechselwirkungen und das Design von blockierenden Verbindungen, um die spezifischen Wechselwirkungen zu hemmen. Bereiten Sie die Lösungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Stellen Sie sicher, dass der Karbonatbeschichtungspuffer mit einer 0,22-Mikron-PES-Membran gefiltert wird. Verwenden Sie ein Vakuum. Stellen Sie außerdem 10 verschiedene Konzentrationen jedes Liganden oder Peptids her.

In diesem Video werden zwei Assays beschrieben, der erste ist die direkte Ligandenrezeptor-Interaktion, ELISA. Es kann verwendet werden, um die Rezeptor-Liganden-Dissoziationskonstante zu messen, die die Rezeptor-Liganden-Bindungsaffinität darstellt. Der zweite Assay ist ein kürzlich optimierter Wettbewerbsliganden-Rezeptor-Interaktions-ELISA.

Dies ermöglicht das Screening von Peptiden und anderen blockierenden Verbindungen, die die Rezeptor-Liganden-Interaktion stören. Bereiten Sie sich aus Effizienzgründen auf die Verwendung von Mehrkanalpipetten für 96-Well-Platten vor und kippen Sie beim Dekantieren den Inhalt einfach aus. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Platte mit einem rekombinanten Rezeptor beschichten.

Verdünnen Sie zunächst den Rezeptor in Karbonatpuffer auf 100 Nanogramm pro Mikroliter. Beladen Sie dann die Plattenvertiefungen mit 100 Mikrolitern Rezeptorlösung. Schließen Sie die Außenwände aus, um das Artefakt der Plattenkante zu vermeiden.

Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius. Führen Sie alle Platteninkubationen mit leichtem Schwenken durch. Entfernen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung und waschen Sie die Platte dreimal mit der Waschlösung, PBS mit einem Hauch von Tween 20.

Blockieren Sie als Nächstes die freien Rezeptorbindungsstellen, indem Sie 200 Mikroliter 5% PSA hinzufügen. Lassen Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren, um den Block zu vervollständigen. Später die Vertiefungen leeren und den Teller wie zuvor waschen.

Beladen Sie nun die Vertiefungen mit 100 Mikrolitern der verschiedenen Verdünnungen des rekombinanten His-Tag-Liganden. Laden Sie jede Konzentration in doppelter Ausführung. Laden Sie die Blindvertiefungen nur mit PBS.

Inkubieren Sie die Platte dann zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation mit den Liganden waschen Sie die Platte dreimal mit Waschlösung. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter Aliquots des primären monoklonalen Anti-his-Antikörpers der Maus in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Nach dem Auswaschen des Antikörpers werden in jede Vertiefung 100 Mikroliter HRP-gekoppelte Ziegen-Anti-Maus-IGG-Sekundärantikörperlösung gegeben. Wickeln Sie die Platte mit Alufolie ein, um das Licht zu vermeiden. Inkubieren Sie die Platte dann 45 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie die Standardwaschtechnik, um den Sekundärantikörper zu entfernen. Geben Sie nun in jede Vertiefung 100 Mikroliter frisch zubereitetes TMB, das aus gleichen Mengen der Stammsubstratlösungen A und B hergestellt wurde. Halten Sie die Platte dann 15 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann, nach ausreichender Farbentwicklung, 50 Mikroliter Stammlösung in jede Vertiefung

Das Protokoll basiert auf der Annahme, dass das gesendete Signal von einer bestimmten Bindung ausgelöst wird. Es kann notwendig sein, den Beitrag der unspezifischen Bindung zum Signal abzuschätzen. Lesen Sie dann die Absorptionswerte der Platte bei 450 Nanometern ab und fahren Sie mit der Berechnung des KD-Wertes fort.

Das Verfahren der LRA-Wettbewerbsverfahren erfolgt nach denselben Schritten wie das direkte LRA-Verfahren, mit Ausnahme einiger wichtiger Änderungen. Nachdem Sie die überschüssigen Beschichtungsliganden von der Platte gewaschen haben, blockieren Sie die Plattenvertiefungen. Geben Sie 200 Mikroliter 5%ige BSA-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Während der Inkubation werden die rekombinanten His-Tag-Liganden in einer festen Konzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter in PBS hergestellt. Bereiten Sie dann das blockierende Peptid in verschiedenen Konzentrationen in PBS vor, die von 10 Nanomolaren bis 100 Mikromolaren reichen, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu gewährleisten. So kann der IC50-Wert für das blockierende Peptid gefunden werden.

Laden Sie in den Kontrollvertiefungen die feste Ligandenkonzentration ohne Peptid, um die maximale Bindung abzuleiten. Fügen Sie in den leeren Vertiefungen nur PBS ohne Ligand oder Peptid hinzu. In die anderen Vertiefungen fügen Sie 50 Mikroliter der Liganden und 50 Mikroliter jeder Peptidkonzentration hinzu.

Inkubieren Sie die Platte dann zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und fahren Sie wie gewohnt fort. Die Dissoziationskonstanten zwischen drei verschiedenen Interferon-Ligandenpeptiden und der Rezeptor-alpha-Untereinheit IL28R-a wurden mit Hilfe der direkten LRA bestimmt, wobei der Anteil der besetzten Bindungsstellen gegen den Logarithmus der jeweiligen Interferonkonzentration aufgetragen wird. Diese Ergebnisse veranschaulichen eine Bindungskurve, die analysiert werden kann, um den KD-Wert zu schätzen, indem die Daten an die Hill-Gleichung angepasst werden.

Ein Scatchard-Diagramm veranschaulicht die Kooperativität bei der Ligandenbindung, wobei Interferon-Ligand 1 die höchste Bindungsaffinität aufweist, gefolgt von Interferon-Ligand 2 und Interferon-Ligand 3. Der Hill-Koeffizientenwert von mehr als 1 deutet auf eine erhöhte Affinität für zusätzliche Liganden nach der anfänglichen Ligandenrezeptor-Interaktion hin. Als nächstes wurde kompetitives LRA verwendet, um den Einfluss eines blockierenden Peptids auf die Interaktion zwischen den Interferon-Ligandenpeptiden und der Rezeptoruntereinheit zu quantifizieren.

Der Anteil der besetzten Bindungsstellen für ein Interferon-Ligandenpeptid bei 10 Nanogramm pro Milliliter wird gegen den Logarithmus der Konzentration des Interferonpeptids aufgetragen. Aus diesen Daten wurden die IC50-Werte geschätzt. Den berechneten Werten zufolge hemmte das blockierende Peptid die Interaktion zwischen Interferon-Ligand 3 und IL28R-a weitestgehend.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden durchgeführt werden. Wenn es richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jede Sättigungskonzentration der Ligandenrezeptorbindung nach diesem Verfahren die anderen Methoden wie durchgeführt werden können, um detailliertere KD-Werte zu erhalten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen, um hemmende Substanzen zu erforschen, um diese Wechselwirkungen zu blockieren.