Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige RNA aus Serumproben zu isolieren. Mithilfe unserer optimierten Version des gängigen MRC-try-Reagenz-RTLS-Protokolls wird dies erreicht, indem das Serum zunächst im Verhältnis 1:5 mit nukleasefreiem Wasser verdünnt wird, um eine Proteinkontamination zu verringern.

Der zweite Schritt besteht darin, zwei Milliliter Phase-Lock-Röhrchen für den ersten Zentrifugationsschritt einzuführen. Dadurch werden die meisten Kontaminanten, wie Phenol und Proteine, in der organischen Phase festgehalten. Als nächster und letzter Optimierungsschritt folgt ein Kurzzentrifugationsschritt bei 12.000 ×g, bei dem jegliche Restkontamination aus dem RNA-Pellet vor den Ethanolaufreinigungen entfernt wird.

Der letzte Schritt besteht darin, zwei modifizierte RNA-Präparationen desselben Patienten zu vereinen, wenn eine höhere Gesamt-RNA-Ausbeute erforderlich ist. Letztendlich zeigen wir durch die Anwendung dieser modifizierten Methode, bei der Serum in nukleasefreiem Wasser solubilisiert wird, eine Phasentrennröhre verwendet wird, um die Hauptkontaminanten einzufangen, und eine kurze Zentrifugation eingeführt wird, dass es möglich ist, die Rückgewinnung kleiner nicht-kodierender RNAs aus einer RNA-Isolierung aus Serum zu maximieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie dem Standard-Triol-RNA-Isolierungsprotokoll liegt darin, dass sich durch einfache Modifikationen die Ausbeute an RNA aus Serum maximieren lässt. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da kleine RNAs im Serum nur in geringen Mengen vorkommen. Die optimierte Methode und die Veranschaulichung dieser Schritte werden die Rückgewinnung dieser RNAs verbessern und Einsteiger erfolgreich bei der Isolierung unterstützen.

Um zu beginnen, tauen Sie die zuvor vorbereitete gefrorene Serumprobe auf Eis auf und überführen Sie anschließend 400 Mikroliter des frisch aufgetauten Serums in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen. Verdünnen Sie danach das Serum mit 100 Mikrolitern RNase-freiem Wasser und geben Sie 50 Mikroliter Proteinase K mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie dann das verdünnte Serum 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um eine ausreichende Proteindigestion zu ermöglichen, um eine vollständige Solubilisierung bei 1,5 Milliliter Tri-Reagenz RTLS und 100 Mikrolitern Vier-Promolanol sicherzustellen.

Den Homogenat kurz umschwenken und fünf Sekunden lang wiederholt pipettieren. Anschließend die Mischung in eine beschriftete 2-Milliliter-Heavy-Phase-Lock-Röhrchen überführen. Das Homogenat bei vier Grad Celsius 20 Minuten lang bei 12.000 ×g zentrifugieren.

Anschließend vorsichtig ein Milliliter der resultierenden wässrigen Lösung in ein neues DNA-Low-Bind-Gefäß dekanteren. Die organische Phase und die Grenzfläche sollten unterhalb des weißen Gels der Phasentrennröhre eingeschlossen sein. Danach fünf Mikroliter Glykogen und 500 Mikroliter 100%igen Isopropanol zur wässrigen Lösung hinzufügen.

Mischen Sie die Lösung durch Umstülpen und inkubieren Sie sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Nach der Übernacht-Inkubation zentrifugieren Sie die Probe 20 Minuten bei 12.000 ×g in einer Zentrifuge bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie anschließend den klaren Überstand und führen Sie eine Kurzzentrifugation für zwei Minuten bei 16.000 ×g in einer Zentrifuge bei vier Grad Celsius durch.

Entfernen Sie mit einer Pipette vorsichtig die klare Lösung, die das Pellet umgibt. Waschen Sie anschließend das Pellet mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol und zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 ×g für 10 Minuten. Um das Pellet sichtbar zu machen, kippen Sie das Röhrchen vor einem dunklen Hintergrund und entfernen Sie die Waschlösung.

Wiederholen Sie die Waschung. Fahren Sie fort. Wir resuspendieren das Pellet in 10 µL RNA-freiem Wasser.

Stellen Sie sicher, dass das Pellet vollständig gelöst ist, indem Sie die Probe bei 55 Grad Celsius für fünf Minuten erhitzen. Mischen Sie die Probe währenddessen durch wiederholtes Pipettieren, um eine höhere Gesamt-RNA-Ausbeute zu erzielen, zwei RNA-Präparationen vom selben Patienten. Bestimmen Sie die Konzentration der resuspendierten RNA mittels UV im Vergleich zu.

Spektrophotometer und beurteilen Sie die RNA-Qualität mithilfe eines 2100 Bioanalyzer. Anschließend lagern Sie die gepoolten RNA-Proben bei minus 80 Grad Celsius für die Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen ein. Spektrophotometrische Profile von RNA aus menschlichem Serum zeigen die verbesserte Ausbeute an RNA aufgrund der Hinzunahme mehrerer Schritte zur traditionellen Chum-Chomsky-Methode.

Ein typisches UV-Profil von RNA, isoliert aus menserlichem Serum, unterscheidet sich von denen, bei denen Optimierungsschritte verwendet wurden, einschließlich der Zugabe von Glykogen und zusätzlichen Zentrifugationsschritten, sowie der Kombination all dieser Methoden, was jeweils zu einer Verringerung von Kontaminationen und einer erhöhten Gesamt-RNA-Ausbeute führt. Die Reinheit der RNA-Probe wurde weiter verbessert durch die Verwendung eines Phasen-Trenngels, das Phenol und Proteine zurückhält. Zusätzlich hat die Erhöhung des Serumvolumens einen bemerkenswerten Einfluss auf die RNA-Ausbeute.

Ein Bioanalyzer-Trace wurde durchgeführt, um die Qualität der Probe weiter zu analysieren. Ein einzelner Peak bei etwa 21 Nukleotiden stellt die microRNA-Fraktion dar. Array-Profiling und QPCR wurden gemäß dem Verfahren durchgeführt. Dieses Array-Profil aus drei Kopf-Hals-Tumoren und einer normalen Probe S zeigt die Expression von microRNAs, die mittels hierarchischem Clustering analysiert und als Wärmekarte dargestellt wurden, wobei die Hochregulation und Herunterregulation der microRNAs erkennbar ist.

Nachfolgende QPCR-Amplifikationskurven wurden für spezifische microRNAs generiert. Diese Daten wurden anschließend verwendet, um die rohen CT-Werte für das normale Serum aufzutragen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie bei einer beliebigen Anzahl von Patienten durchgeführt werden und liefert hochwertige RNA, sofern sie ordnungsgemäß nach dem Verfahren durchgeführt wird. Andere Methoden wie die quantitative PCR oder die Sequenzierung der nächsten Generation können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen wie die Entdeckung und Validierung von Biomarkern zu beantworten.