Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, qualitativ hochwertige RNA aus Serumproben zu isolieren. Probieren Sie mit unserer optimierten Version der gängigen MRC das RTLS-Protokoll des Reagenzes aus. Dies wird erreicht, indem das Serum zunächst im Verhältnis eins zu fünf mit nukleasefreiem Wasser verdünnt wird, um die Proteinkontamination zu verringern.

Der zweite Schritt besteht darin, zwei Milliliter Phase-Lock-Röhrchen für den ersten Zentrifugationsschritt einzuführen. Dadurch wird der Großteil der Schadstoffe wie Phenol und Proteine in der organischen Phase eingeschlossen. Der dritte und letzte Optimierungsschritt ist die Flash-Zentrifugationsschleuder bei 12.000 Käse, die vor den Ethanolwäschen alle Restverunreinigungen aus dem RNA-Pellet entfernt.

Der letzte Schritt besteht darin, zwei modifizierte RNA-Präparate desselben Patienten zu poolen, wenn eine höhere Gesamt-RNA-Ausbeute erforderlich ist. Durch die Verwendung dieser modifizierten Methode, bei der das Serum in nukleasefreiem Wasser aufbereitet wird, wird ein Phasensperrrohr verwendet, um die wichtigsten Verunreinigungen einzufangen und eine Blitzdrehung einzuführen. Wir zeigen, dass es möglich ist, die Rückgewinnung von kleinen nicht-hüllenden RNAs aus einer RNA-Isolierung aus dem Serum zu maximieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Standard-Triol-RNA-Isolierungsprotokoll besteht darin, dass wir durch einfache Modifikationen die Ausbeute an RNA aus dem Serum maximieren können. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da kleine RNAs in geringen Mengen im Serum enthalten sind. Die optimierte Methode und Visualisierung dieser Schritte wird die Rückgewinnung dieser RNAs verbessern und Anfänger zu einer erfolgreichen Isolierung führen. Tip.

Um mit dem Auftauen der zuvor vorbereiteten gefrorenen Serumprobe auf Eis zu beginnen, geben Sie dann 400 Mikroliter des frisch aufgetauten Serums in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen. Als nächstes verdünnen Sie das Serum mit 100 Mikrolitern R nase freiem Wasser und fügen Sie 50 Mikroliter Proteinase K in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie dann das verdünnte Serum 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um eine ausreichende Proteinverdauung zu ermöglichen und eine vollständige Solubilisierung bei 1,5 Millilitern Tri-Reagenz RTLS und 100 Mikrolitern Four Promo Anol zu gewährleisten.

Drehen Sie das Homogenat kurz um und führen Sie ein wiederholtes Pipettieren für fünf Sekunden durch. Füllen Sie dann die Mischung in ein beschriftetes zwei Milliliter schweres Phasensperrröhrchen um. Schleudern Sie das Homogenat bei 12.000 GS für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Dekantieren Sie anschließend vorsichtig einen Milliliter der resultierenden wässrigen Lösung in ein frisches DNA-Röhrchen mit geringer Bindung. Das organische Gehör und die Grenzfläche sollten unter dem weißen Gel der Phasensperrröhre eingeschlossen werden. Geben Sie dann fünf Mikroliter Glykogen und 500 Mikroliter 100%iges Isopropanol in die wässrige Lösung.

Mischen Sie die Lösung durch Inversion und inkubieren Sie sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Nach der Inkubation über Nacht zentrifugieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei 12.000 GS in einer Zentrifuge mit vier Grad Celsius. Als nächstes entsorgen Sie den klaren Überstand und führen zwei Minuten lang eine Blitzdrehung bei 16.000 GS in einer Zentrifuge von vier Grad Celsius durch.

Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette die klare Lösung, die das Pellet umgibt. Waschen Sie dann das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 GS für 10 Minuten. Um das Pellet sichtbar zu machen, kippen Sie das Rohr vor einen dunklen Hintergrund und lagern Sie die Waschlösung ab.

Wiederholen Sie den Waschvorgang. Steigern. Wir suspendieren das Pellet in 10 Mikrolitern RNA-freiem Wasser.

Stellen Sie sicher, dass sich das Pellet vollständig aufgelöst hat, indem Sie die Probe fünf Minuten lang auf 55 Grad Celsius erhitzen. Mischen Sie die Probe während dieser Zeit mit wiederholtem Pipettieren, um eine höhere Gesamt-RNA-Ausbeute zu erhalten, zwei RNA-Präparate vom selben Patienten. Quantifizieren Sie die resuspendierte RNA mit einem UV- vs.

Spektralphotometer und beurteilen Sie die RNA-Qualität mit einem 2100 Bioanalysator. Lagern Sie dann die gepoolten RNA-Proben bei minus 80 Grad Celsius für den Einsatz in Downstream-Anwendungen. Photometrische Spectra-Profile von RNA aus humanem Serum zeigen die verbesserte RNA-Ausbeute aufgrund der Hinzufügung mehrerer Schritte zum traditionellen Chum-Chomsky-Ansatz.

Ein typisches UV-Profil von RNA, die aus menschlichem Serum isoliert wurde, steht im Gegensatz zu denen, die Optimierungsschritte verwenden, einschließlich der Zugabe von Glykogen und zusätzlichem Spin, und jedes dieser Werkzeuge kombiniert führt zu einer Reduzierung von Verunreinigungen und einer erhöhten Gesamt-RNA-Ausbeute. Die Reinheit der RNA-Probe wurde durch die Verwendung eines Phasen-Lock-Gels, das Phenol und Proteine einfängt, weiter erhöht. Darüber hinaus hat die Erhöhung des Serumvolumens einen bemerkenswerten Einfluss auf die RNA-Ausbeute

Es wurde ein Bioanalyse-Trace durchgeführt, um die Qualität der Probe weiter zu analysieren. Ein einzelner Spike bei etwa 21 Nukleotiden stellt das Micro-RNA-Fraktions-Array-Profiling dar und die QPCR wurden nach dem Verfahren durchgeführt. Dieses Array-Profil von drei Kopf- und Halskrebs und einem normalen S zeigt die Expression von microRNAs, die mit hierarchischem Clustering analysiert und als Heatmap dargestellt werden, in der die Hoch- und Herunterregulierung der microRNAs zu sehen ist.

Im Folgenden wurden QPCR-Amplifikationskurven für spezifische microRNAs erstellt. Diese Daten wurden dann verwendet, um rohe CT-Werte für das normale Serum aufzuzeichnen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie bei einer beliebigen Anzahl von Patienten durchgeführt werden, die im heutigen Maximum qualitativ hochwertige RNA produzieren, wenn sie richtig durchgeführt wird. Andere Methoden wie quantitative PCR oder Next Generation Sequencing können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Entdeckung und Validierung von Biomarkern zu beantworten.