Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre endometriale Stromazellkulturen aus resezierten Hysterektomien zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gebärmutterschichten unterschieden und getrennt werden, um einen Abschnitt des Endometriumgewebes zu isolieren. Der zweite Schritt besteht darin, bei der Anwendung der Schabemethode eine Zellisolationstechnik zwischen der Schabe- und der Tryin-Methode zu wählen.

Mechanische Kraft und Schaben werden verwendet, um endometriale Stromazellen zu trennen und zu dissoziieren. Alternativ wird bei der Anwendung der Trypsin-Methode die enzymatische Aktivität von Trypsin genutzt, um endometriale Stromazellen zu trennen und zu dissoziieren. Letztendlich wird die Mikroskopie verwendet, um das Zellwachstum und die Morphologie zu beobachten, während andere Techniken, die im Manuskript besprochen werden, zur Überprüfung von endometrialen Stromakulturen verwendet werden.

Diese Methode kann helfen, wichtige physiologische Fragen im reproduktiven Bereich zu beantworten, Phänomene wie den Fortpflanzungszyklus und die Menstruation. Die in diesem Manuskript verwendeten Hysterektomie-Proben wurden in Übereinstimmung mit einem vom IRB genehmigten Ethikprotokoll der Universität mit der Nummer I-R-B-H-S-R, Nummer 1, 4, 4, 2, 4 gesammelt. Bewahren Sie vom Patienten stammendes Gewebe in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das RPMI oder DMEM enthält, mit hohem Glukosegehalt bei vier Grad Celsius für nicht länger als 24 Stunden auf, bevor die Probe verarbeitet wird. Wenn Sie bereit sind, zu beginnen, waschen Sie die Gewebeprobe dreimal mit einem XPBS und entsorgen Sie die Lösung zwischen jedem Waschgang.

Geben Sie dann vier bis 10 Milliliter Wachstumsmedien, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin in die Gewebeprobe. Fügen Sie außerdem eine Pilzzone mit einer Endkonzentration von 0,25 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Entsorgen Sie anschließend das Wachstumsmedium und waschen Sie das Tuch zweimal mit einem XPBS.

Legen Sie das Gewebe auf eine sechs Zentimeter große Zellkulturplatte und identifizieren Sie die Gebärmutterschleimhautschicht anhand dieser Bilder. Trennen Sie dann das Endometrium und bewahren Sie die anderen Gewebeschichten für die zukünftige Verwendung auf. Verwenden Sie ein Skalpell oder eine Rasierklinge, um das Gewebe in kleine Stücke zu schneiden, während Sie es auf die Zellkulturschale kratzen.

Die Kratzer erleichtern die Anheftung der entstehenden primären endometrialen Stromazellen. Geben Sie dann vorsichtig zwei Milliliter Wachstumsmedium in die zerkratzte Schale. In diesem Stadium sind Gewebefragmente sichtbar und durch die Kratzbewegung immobilisiert.

Stellen Sie die Schale in einen dafür vorgesehenen Zellkultur-Inkubator, getrennt von anderen Zelllinien, um eine Kontamination zu vermeiden. Überwachen Sie die Zellen täglich mit einem Lichtmikroskop. Suchen Sie nach kleinen Zellpopulationen, die am zweiten oder dritten Tag alle drei Tage aus dem geschnittenen Gewebe hervorgehen.

Entfernen Sie vorsichtig die alten Medienwaschkulturen mit einem XPBS und fügen Sie dann zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium hinzu. Beginnen Sie mit der Zugabe von vier Millilitern Wachstumsmedium. Sobald die Proliferationsrate während der Waschschritte zunimmt, werden die verbleibenden Gewebestücke abgesaugt.

Es ist unwahrscheinlich, dass neue Kolonien aus dem Gewebe entstehen. Nach einer Woche Wachstumspassage verwenden die Zellen 0,05% Trypsin. Wenn die Zellen zwischen 75 und 80% Co-Flüssigkeit erreichen, frieren Sie eine Zellplatte ein.

Sobald zwei oder drei Platten erhalten sind, können Primärzellen nicht unbegrenzt passageiert werden. Um mit der tripsinvermittelten Isolierung zu beginnen, legen Sie ein kleines Stück Endometriumgewebe in ein konisches Röhrchen mit zwei Millilitern 0,25% Trypsin, ergänzt mit 0,03 Milligramm pro Milliliter. Kann Mycin das Gewebe dann auf einer rotierenden Plattform bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren.

Anschließend das Gewebe kurz vortexen und dann zwei Minuten lang bei 200 bis 400 mal G zentrifugieren, den Überstand verwerfen und frisches Trypsin hinzufügen. Und kann Mycin das Gewebe dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, während es rotiert. Nach der Inkubation wirbeln Sie das Gewebe fünf bis 10 Sekunden lang ein.

Fügen Sie dann zwei Milliliter Wachstumsmedien hinzu, die 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthalten. Um das Trypsin zu deaktivieren, zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 bis 400 Mal G für zwei bis drei Minuten. Entsorgen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut.

In zwei Millilitern Wachstumsmedium wird die Zellsuspension auf eine sechs Zentimeter große Zellkulturschale aufgetragen und die Platte abgeschabt, um die Anheftung der Primärzellen zu verbessern. Überwachen Sie das Zellwachstum täglich mit einem Lichtmikroskop und wechseln Sie das Wachstumsmedium alle zwei bis drei Tage. Sobald die Zellen eine Kofluenz von 75 bis 80 % erreicht haben, verwenden Sie 0,05 % oder 0,25 % Trypsin, um sie zu passieren und endometriale Stromazellen zu isolieren.

Mit der Scraping-Methode werden Cluster von früh entstehenden Zellen erzeugt. Entlang der durch das Skalpell induzierten Kratzer können die endometrialen Stromazellen anhand ihrer Fibroblastenmorphologie identifiziert werden. Die Trypsin-Methode hat eine längere Vorbereitungszeit als die Schabemethode, aber lebensfähige Zellen werden früher beobachtet.

Die Tryin-Methode erzeugt auch Zellen mit sowohl geclusterten als auch verteilten Wachstumsmustern. Ein gewebespezifischer Marker für endometriale Stromazellen wurde bisher nicht entdeckt. Eine Möglichkeit, endometriale Stromazellen zu identifizieren, besteht darin, den Verlust eines Markers zu messen.

Für Epithelzellen wie Cytokeratin. Ein Mangel an Cytokeratin zeigt das Fehlen von Endometriumepithelzellen. Der Verlust der Cytokeratin-Färbung, der in Passage fünf im Vergleich zu Passage zwei beobachtet wurde, bestätigt das Fehlen von Epithelzellen.

Der funktionelle Nachweis des Vorhandenseins von endometrialen Stromazellen kann mit Hilfe eines Dezellularisierungsassays erbracht werden. Der Anstieg von Prolaktin und insulinähnlichem Wachstumsfaktor-Bindungsprotein eins als Reaktion auf die Behandlung mit CAMP und Hydroxy-Progesteronacetat deutet auf eine erfolgreiche Etablierung einer endometrialen Stromakultur hin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre endometriale Stromazellkulturen aus resezierten Hysterektomien etabliert.