Name: Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven Drosophila Gewebe In-situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Immunfluoreszenzfärbung für Drosophila melanogaster-Gewebe mittels Beschallung. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinen in embryonalen und larvalen Stadien ohne Dissektion.

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Wir sind dankbar, dass Ruth Lehman und Dorothe Godt, die freundlicherweise Vasa und Stau-Antikörper. Wir möchten die Bloomington Stock Center an der Indiana University für die Aufrechterhaltung der vorgesehenen Aktien und die Entwicklungsstudien Hybridoma Bank im Rahmen der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und von der Universität von Iowa gehalten anzuerkennen. Wir danken allen Mitgliedern der Wawersik Labor für ihre Beratung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Monroe-Scholars Program Grant (AF und LB) und NSF gewähren IOS0823151 (MW) finanziert.

1. Herstellung einer Sammlung Cage <ol><li> Betäuben junge, fruchtbare Fliegen mit CO 2. Übertragen betäubten Fliegen auf einen Käfig. Um eine optimale Ausbeute zu erhalten, verwenden Sie 100-120 erwachsenen Fliegen von 2-7 Tagen des Alters bei einem 4: 1-Verhältnis von Frauen zu Männern. Fliegen ermöglichen eine angemessene Eingewöhnungszeit, ~ 24 Stunden vor der Probe für den Erhalt Fixierung. Wenn der Käfig wurde mit jungfräulichen Weibchen gesetzt gepaart, um Männer, eine Verwendung einer 36 - 48 h Akklimatisierung. </li><li> Am offenen Ende des Käfigs, legen Sie einen vorbereiteten Apfelsaft-Agar-Platte mit einer Dime-Größe Tropfen Hefe-Paste in der Mitte über der Öffnung des Käfigs. Dann sichern Sie sie mit Klebeband. Verschließen Sie den Übergang zwischen der Apfelsaft-Agar-Platte und der Käfig mit Parafilm. </li><li> Platzieren Sie den Käfig in einem zweiten Behälter mit Apfelsaft Agarplatte als Base und ermöglichen die Fliegen bei einer bestimmten Temperatur für eine geeignete Zeitperiode zu reproduzieren, wie durch das Experiment bestimmt. Hinweis: Musterkollektion mal will variieren. Wenn zum Beispiel das Sammeln spät Embryonen / frühe L1-Larven (17. - 24. Stunde), ermöglichen Fliegen Eier auf Apfelsaft Agarplatten für 7 h bei 25 ° C vor dem Altern der Probe für 17 Stunden bei 25 ° C lag. Ähnlich, für eine Sammlung von mittleren bis späten ersten Larvenstadium (36 - 48 h) entfernt, um zu ermöglichen Eier 12 Stunden bei 25 ° C vor der Alterung der Probe für 36 Stunden bei 25 ° C lag. </li><li> Sobald der Zeitraum abgeschlossen ist, tippen Sie auf den Käfig auf einen Tisch, so dass Fliegen fallen weg von der Apfelsaft-Agar-Platte ohne Narkose. Ersetzen schnell die verwendete Platte durch eine neue, die einen Rückgang von Hefe-Paste. Sichern Sie die frische Platte mit Klebeband und Parafilm und bewahren Sie den Käfig mit Apfelsaft-Agar-Platte als Basis. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Hefe-Drop aus der gebrauchten Teller mit einem Metallspachtel. Deckel auf Platte verwendet Apfelsaft und legte ermöglichen Embryonen nach Alter, wenn experimentell notwendig. Anmerkung: Während Alterungs Proben können die Platten bei 25 ° C gelagert werden, wenn höhere Temperaturen Experimentally erforderlich. Beispiele, wie man Embryonen für die Sammlung sind oben beschrieben altern (siehe Hinweis für Schritt 1.3). Entfernung von Hefe-Paste vor dem Altern zu probieren durchgeführt, um Larven von kriechen in die Hefe und das Aufbrechen der Agar unter verhindern. Die restlichen Apfelsaft-Agar und Hefe-Paste Rest liefern die Nährstoffe für das Larvenwachstum. Während Embryonen direkt in der Hefe Paste gelegt werden durch Entfernen der Hefe-Paste verloren geht, ist dieser Verlust vorzuziehen, Hefe und Agar-Rückstand in der Probe, die Färbungseffizienz verringern kann. Sollte man sich entscheiden, die Hefe-Paste zu entfernen, kann Hefe mit Phosphatpuffer Triton X-100 (PBTx) verflüssigt werden, mit einem Pinsel vermischt und dann aus der Probe mit einer Zelle Sieb vor der Fixierung entfernt wird. </li></ol> 2. Fixation <ol><li> Sobald Embryonen auf die Apfelsaft-Agar-Platte gelegt haben, um die gewünschten Zeitpunkt im Alter, mit einem kleinen Pinsel mit Phosphatpuffer Triton X-100 (PBTx) Lösung benetzt, um Probe vorsichtig aus th entfernenE Platte. Hinweis: Ältere Larven sind mobil und können auf der Innenseite des Deckels zu kriechen. Diese Probe kann in ähnlicher Weise von der Entfernung mit einem Pinsel gesammelt werden. </li><li> Wischen Sie die Probe beladenen Pinsel gegen den nach innen gerichteten Grat einer Zelle Sieb. Dann spülen Sie die Wände des Sieb und den Pinsel mit einer Spritzflasche enthält PBTx Lösung. Legen Sie eine Petrischale unter dem Deckel Sieb, um die PBTx Lösung zu erfassen. </li><li> Nachdem alle die Probe auf das Sieb übertragen worden ist, gießen Sie genug PBTx in das Sieb, um die Probe aus dem Netz zu erhöhen. Dann heben Sie den Sieb und gießen Sie den Inhalt der Petrischale in eine flüssige Abfallbehälter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.3 dreimal, um Hefe zu entfernen und fliegen Abfälle, die zusammen mit der Probe übertragen worden sein können. </li><li> Gießen Sie genug 50% Bleichmittel (NaOCl) / Wasser (ddH 2 O)-Lösung in das Sieb, um die Larven des Netzes zu erhöhen aus. Dass die Larven in Lösung für 5 min sitzen. Dann heben Sie das Sieb und gießen Sie ter Inhalt der Petrischale in einem Abfallbehälter. Hinweis: - 22 Stunden, um den Chorion-Membran zu entfernen Bleach ist nur in embryonalen Proben im Alter von 0 erforderlich. Die Anwendung von Bleich ältere Proben weggelassen werden kann, aber seine Aufnahme nicht schädlich ist. Wenn Unterlassung gewünscht wird, ersetzen Sie das Bleichmittel in diesem Schritt mit PBTx. Verdünnt Bleich sollte innerhalb von 24 h Herstellung der Lösung verwendet werden. </li><li> Waschen Probe in das Sieb mit PBTx durch Gießen genug PBTx in das Sieb, um die Probe aus dem Netz zu erhöhen. Erlauben Probe in Lösung für 3 min zu sitzen. Dann heben Sie den Sieb und gießen Sie den Inhalt der Petrischale in eine flüssige Abfallbehälter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.6 fünfmal. </li><li> Tupfen Sie den Boden der Zelle Sieb trocknen, dann in einen Probentransfer Szintillationsfläschchen, die 1,75 ml PEMS Lösung mit einem Pinsel. </li><li> Die Arbeit in einem belüfteten Laborabzug, fügen Sie 250 ul 37% Formaldehyd und 8 ml Reagenz Heptan auf die Szintillationsfläschchen. <br/&gt; Hinweis: Formaldehyd und Heptan sind gefährlich. Für Sicherheitszwecke, weiterhin in einem belüfteten Abzug arbeiten und tragen Sie geeignete Handschuhe für Schritte 2,9-3,3. </li><li> Lassen Sie die Flasche bei 200 Umdrehungen pro Minute oder einer ähnlichen mäßiger Geschwindigkeit für 20 min schütteln. </li><li> 10 ml Methanol in Szintillationsfläschchen, ohne die frühere wässrigen Phase und damit die Ampulle kräftig bei 500 Upm für 1 min schütteln. Hinweis: Methanol ist gefährlich. Weiterhin in einem belüfteten Abzug arbeiten und tragen Sie geeignete Handschuhe. </li><li> Entfernen Fläschchen aus Shaker und gießen Sie sofort Inhalte in eine Zelle Sieb über einem Abfallbehälter in der Kapuze. Fügen Sie Zusatz Methanol in das Fläschchen und führen durch die Zelle Sieb wie nötig, um sicherzustellen, dass alle Proben wurde entfernt. Hinweis: Zellsiebe kann langsam abfließen. Um dies zu vermeiden, berühren ein Labor Gewebes am Boden der Zelle Sieb, um die Lösung durch den Filter schneller zu ziehen. Methanol, Formaldehyd und Heptan solltein geeigneten Abfallbehälter bis zur ordnungsgemäßen Entsorgung nach den Richtlinien des Instituts gespeichert. </li><li> Trockenen Boden der Zelle Sieb mit einer Labor Gewebe, dann verwenden Sie einen Pinsel, um Probe in das Sieb eingefangen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Methanol zu übertragen. Hinweis: Wenn mehrere Szintillationsgefäße im Einsatz sind, führen Sie die Schritte 2.12 und 2.13 ein Fläschchen zu einer Zeit, zu Probe von Trocknen auf Zellsiebe verhindern. </li><li> Sobald die Probe auf den Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt, entfernt Methanol mit einer Pipette. Sicherzustellen Probe auf den Boden des Rohres abgewickelt. </li><li> Spülen Probe im Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von ungefähr 0,5 ml Methanol zu Rohr. Warten Sie dann begleichen Probe zu entfernen Methanol mit einer Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 15 dreimal. </li><li> 0,5 ml Methanol zu dem Rohr, und speichern Sie dann in eine -20 ° C-Gefrierschrank für die spätere Verwendung. </li></ol> 3. Rehydrierung und Herstellung der Probe für Immunfärbung <ol><li> Entfernen von Methanol aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipette, so dass die Probe in der Röhre. Shop Methanol Abfälle in die entsprechenden Abfallbehälter bis zum Zeitpunkt der ordnungsgemäßen Beseitigung. Hinweis: Um Beschallung Effizienz zu steigern, verwenden Sie nicht mehr als 3 mm von Probe an der Unterseite des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen abgerechnet. Überschüssige Probe kann in ein separates Röhrchen mit einer Pipette vor dem Beginn der Rehydration über Schritt übertragen werden. Schneiden der Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge verwendet werden, um ein Verstopfen der Pipettenspitze zu verhindern. </li><li> 1,0 ml einer 50% Methanol / Phosphatpuffer Tween (PBTw) Lösung in das Röhrchen und Rock für 3 min. </li><li> Methanol-Lösung zu entfernen, um die ordnungsgemäße Abfallbehälter und spülen mit 1,0 ul PBTw zweimal. Nach jedem Auswaschen damit die Probe vor dem Abziehen des PBTw mit einer Pipette zu begleichen. </li><li> 1,0 ml Rinderserumalbumin / Phosphat-gepufferte Tween (BBTw) zu mischen, um das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf einer Wippe, ermöglichen die sample, um sich niederzulassen und entfernen Sie die BBTw mit Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.4 zwei Mal darauf achten, dass so viel wie möglich zu entfernen BBTw ohne Probe nach dem letzten Waschen verlieren. </li><li> 0,5 ml BBTw auf das Rohr und den Schlauch auf Eis. </li></ol> 4. Die Beschallung der Probe <ol><li> Stellen Sie die Beschallungs zu 10% maximale Amplitude und Benennung einer Laufzeit von 2 sec konstant Beschallung. Hinweis: Diese Einstellungen sind spezifisch für die in den Materialien und Geräte Tabelle angegeben Ultraschallgerät und kann Optimierung für verschiedene Beschaller verlangen. </li><li> Vor der Beschallung von Proben, reinigen Sie die Sonde Ultraschallgerät, indem Sie die Sondenspitze in einem 50 ml konischen Röhrchen mit VE-Wasser und führen Ultraschallgerät zur Reinigung der Sonde gefüllt. Trockenbeschallungssonde mit Labor Gewebe nach der Flucht. </li><li> Tauchen Sie die Sonde in die Mikrozentrifugenröhrchen enthaltenden Probe, so dass es etwa 3 bis 4 mm über der Probe positioniert und starten Beschallung. </li><li> Entfernen Sie die microcentrifuge Rohr und legen Sie es auf Eis für mindestens 30 Sekunden, um Wärme von der Beschallung zu zerstreuen und lassen Probe am Boden des Mikrozentrifugenröhrchen zu begleichen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.3 und 4.4 nach Bedarf auf das Alter der Probe verarbeitet werden. Hinweis: Für eine optimale Beschallung Probenvolumen, Embryonen jünger als 17 Stunden nicht Beschallung benötigen, aber diejenigen zwischen 17 und 24 h (Stufe 17 / Früh L1) benötigen zwei sonications. Larven zwischen 24 - 36 (Anfang / Mitte L1), 36 - 48 (Mitte / Ende-L1), 48 - 60 (Anfang / Mitte-L2), 60-72 (Mitte / Ende-L2), 72-84 ( Früh L3), 84-96 (Anfang / Mitte-L3), 96-108 (Mitte / Ende-L3) hr verlangen 5, 9, 11, 13, 15, 18 und 22 jeweils sonications. Siehe Diskussion zur weiteren Ausarbeitung an Beschallung Zeiten. </li><li> Spülen BBTw zweimal mit 1,0 ml. Nach jeder Spülung damit die Probe vor dem Bezug von BBTw mit einer Pipette zu begleichen. </li><li> 1,0 ml BBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf der Wippe, damit die Probe absetzen und entfernen Sie die BBTw mit Pipette. &lt;/ Li&gt; <li> Wiederholen Sie Schritt 4.7 zwei Mal. </li></ol> 5. Immunfärbung <ol><li> Blockieren Probe durch Zugabe von 5% Normalserum in BBTw auf die Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt. Entfernen Block nach Schaukel 1 Stunde. Hinweis: Verwenden Sie normale Serum von den Arten, bei denen die Sekundärantikörper erzeugt werden. </li><li> Verdünnen primären Antikörpern anzueignen Arbeitskonzentration in 5% Normalserum / BBTw Lösung. </li><li> Gesteinsprobe in primäre Antikörperlösung A / N bei 4 ° C oder für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 22 ° C beträgt. Hinweis: Antikörper Inkubationszeiten und Temperaturen können variieren. O / N-Inkubation bei 4 ° C oder 3 Stunden bei Raumtemperatur ist in der Regel ausreichend. Jedoch kann ein zweitägiger Inkubationszeit Färbung Qualität zu verbessern, vor allem mit älteren Proben oder bei niedriger Affinität primäre Antikörper verwendet werden. Längere Inkubationen werden typischerweise bei 4 ° C durchgeführt. Ähnliche Überlegungen sind bei der Verwendung Sekundärantikörper (siehe 5.10) vorgenommen werden. </li><li> Erlauben Probe absetzenBoden des Mikrozentrifugenröhrchen. Abziehen primären Antikörper mit Pipette. Antikörper für die Wiederverwendung zu speichern, falls gewünscht. </li><li> Gründlich zweimal mit 1,0 ml BBTw. Nach jeder Spülung ermöglichen Probe vor Abziehen BBTw mit einer Pipette zu begleichen. </li><li> 1,0 ml BBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf der Wippe, erlauben Probe sich niederzulassen und zu entfernen BBTw mit Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.6 fünfmal. </li><li> Block Probe durch Zugabe von 5% normalem Serum / BBTw Lösung des Reaktionsgefäß. Entfernen Block nach Schaukel für 30 min bis 1 Stunde. Hinweis: Diese zusätzliche Sperr Schritt ist nicht erforderlich, kann aber Qualität der Färbung auf spezifische Antikörper zu verbessern. </li><li> Verdünnen Sekundärantikörper, um angemessene Arbeitskonzentration in 5% normalem Serum / BBTw Lösung. </li><li> Wickeln Mikrozentrifugenröhrchen in Aluminiumfolie zu reduzieren Ausbleichen durch Lichteinstrahlung. Gesteinsprobe in sekundären Antikörperlösung für 12 bis 48 h bei 4 ° C oder für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 22 ° C beträgt. </li><li> Erlauben Probe zur Unterseite der Mikrozentrifugenröhrchen zu begleichen. Abziehen Sekundärantikörper mit Pipette. </li><li> Gründlich zweimal mit 1,0 ml PBTw. Nach jeder Spülung ermöglichen Probe vor dem Abziehen des PBTw mit einer Pipette zu begleichen. </li><li> 1,0 ml PBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 5 min auf der Wippe, damit die Probe absetzen und entfernen Sie die PBTw mit Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.13 dreimal. </li><li> Optional: Fügen DAPI verdünnt 1: 1000 in PBTw. Gesteinsprobe in Aluminiumfolie eingewickelt für 3 min; entfernen Sie dann DAPI-Lösung mit einer Pipette. Spülen Sie fünfmal mit 1,0 ml PBTw, so dass Probe, bevor Sie PBTw mit Pipette zu begleichen. </li><li> Fügen 80-100 ul 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) Lösung für Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. Hinweis: Eine weitere Glycerin-basierte Anti-Fade Mittel kann ersetzt werden. </li></ol> 6. Analyse <ol><li> Vor der Montage Probe auf Objektträger, einen zusätzlichen 5 - 10 ul DABCO / p-phenylenediamine (PPD) Antifade Lösung für Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Probe kann auf Objektträger ohne Dissektion hinzugefügt werden. Probenvolumen zu einer Folie hinzugefügt variiert mit Deckglas Größe. Beim Pipettieren Probe auf Objektträger kann die Pipettenspitze aus mit einer Rasierklinge auf Probe Scher verhindern geschnitten werden. Es ist oft nützlich, um Probe in Reihen für die einfache Analyse säumen. Die Zugabe von PPD als zusätzlicher Antibleichmittel nicht erforderlich, kann aber die Photobleichung zu verhindern, wenn die Proben langfristig gespeichert. </li><li> Stellen sanft Deckglas über Probe. Dann sichere Deckglas an Ort und Stelle mit Nagellack. </li><li> Ansicht montiert Probe mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol>

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<li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li>
<li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+identity%2C+morphology%2C+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14(2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll liefert ein Verfahren zur Immunfärbung erfolgreich in situ gezielt Drosophila embryonalen und larvalen Geweben, wodurch die Notwendigkeit für die Präparation. Nach vor-Protokolle für die Färbung frühen Embryonen 1,2,3 ist der Chorion-Membran mit 50% Bleichmittel (NaOCl) entfernt. Proben werden in Formaldehyd und Methanol fixiert. Weil die Larvencuticula verursacht älteren Probe zu schweben, wird die gesamte Probe dann durch eine Zell-Sieb geleitet, um Larven Retention zu gew...

Drosophila-Embryonen und Larven bieten ein hervorragendes Modell, um Entwicklungsprozesse in vielen Organen und Geweben zu untersuchen. Imaging von einzelnen Zellen ist notwendig, um die komplexen Umgebungen, in denen Zellen entwickeln oft festzustellen, die in diesen Studien notwendig. Visualisierung von Zellen im Gewebe durch Immunfärbung erreicht werden. Gut beschriebene Immunfärbung Protokolle für embryonale Gewebe Drosophila &lt;17 Stunden nach der Eiablage (AEL) 1-3 existieren. Jedoch kann eine Schutz Kutikula Formen gegen Ende der Embryogenese und verhindert wirksam Antikörper Permeation. Somit sind diese Immunfärbung Protokolle ineffizient bei der Analyse von Gewebe in der späten Phase Embryonen und in nachfolgenden Stufen der Larvenentwicklung (1. Larvenstadium (L1), 2. Larvenstadium (L2), und 3. Larvenstadium (L3)). Diese Ineffizienz erlegt eine Barriere, um unser Verständnis der dynamischen Prozesse, die während dieser erweiterten Entwicklungsphase 4 auftreten. Tissue Dissektion ist eine weit verwendete Technik, um diese Barriere zu umgehen 5-7. Allerdings kann Dissektion beweisen ineffizient. Die Extraktion kann durch Schwierigkeiten bei der Lokalisierung oder Isolieren embryonalen und Larvengewebe belastet werden. Darüber hinaus kann die physische Entfernung von Zielgeweben Schäden durch Zerreißen oder sie verstoßen, sie in ihrer Gesamtheit zu extrahieren verursachen. Ultraschallbehandlung ist ein Verfahren, das die Schallwellen verwendet, um intermolekulare Wechselwirkungen stören. Es wurde verwendet, um die Integrität des Drosophila Larvencuticula um Immunfärbung entwickeln neuronalen Zelltypen 6 zu stören. Dieses Protokoll wurde angepasst, um im Spätstadium der embryonalen und Larven Gonaden, die so klein wie 50 um im Durchmesser 8-10 sein können Immunfärbung. Durch solche Studien hat der Prozess der männlichen Keimbahn-Stammzellen (GSC) Nischenbildung im späten Stadium charakterisiert Drosophila-Embryos 8-10 und Mechanismen, die der Stammzellentwicklung und difzierung im späten Stadium der embryonalen Keimdrüsen und Larven sind aufgeklärt worden 9-12. So stellt Beschallung eine effiziente Alternative zu Gewebedissektion die schwierig sein kann, weil der Gewebegröße. Darüber hinaus ermöglicht es die Immunfärbung von Drosophila Gewebe in situ, so dass Zellen im Kontext des Gesamtorganismus und die Aufrechterhaltung in situ Morphologie. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Fluoreszenz-Immunfärbung von Spätstadium der embryonalen bis Anfang / Mitte L3 Gewebe in situ. Analyse von Drosophila Gonaden und Nervengewebe in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, um die Wirksamkeit dieses Protokoll zu demonstrieren. Weiterhin kann diese Immunofärbungsprotokoll angepasst anderen Drosophila-Gewebe sowie Gewebe in anderen Organismen mit einem äußeren Nagelhaut zu analysieren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabelle 1: Reagenzien und Puffer</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Triton X-100 (PBTx)</td><td></td><td></td><td>Für 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 l ddH2O, 50 ml Triton 10%. Bei RT lagern.</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Für 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Fügen Sie Komponenten hinzu und füllen Sie sie auf das entsprechende Volumen. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Triton 10%</td><td></td><td></td><td>Für 50 ml: 5 ml Triton, 5 ml PBS 10X, 45 ml ddH2O. Gestein zum Mischen. Bei RT lagern.</td></tr><tr><td>PEMS</td><td></td><td></td><td>0,1 M Rohre (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Bei RT lagern.</td></tr><tr><td>Röhrchen</td><td></td><td></td><td>Für 400 ml einer 0,25 M Lösung (pH 6,9): 30,24 g Röhrchen dH20 NaOH. Lösen Sie die Pipes in 300 ml dH2O auf und stellen Sie sie dann mit NaOH auf pH 6,9 ein. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit dH2O auf 400 ml und autoklavieren Sie es. Bei RT lagern.</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td></td><td></td><td>37 % Formaldehyd in Methanol. Bei RT lagern. Lagern Sie das Gemisch aus Formaldehyd-, Heptan- und Methanolabfällen in einem dicht verschlossenen Behälter im Abzug, bevor Sie es gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen.</td></tr><tr><td>Heptan</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>n-Heptan. Bei RT lagern. Lagern Sie das Gemisch aus Formaldehyd-, Heptan- und Methanolabfällen in einem dicht verschlossenen Behälter im Abzug, bevor Sie es gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>Bei RT lagern. Formaldehyd-, Heptan- und Methanolabfallgemische vor der Entsorgung gemäß den institutionellen Richtlinien in einem dicht verschlossenen Behälter im Abzug lagern.</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Tween (PBTw)</td><td></td><td></td><td>Zur Herstellung von 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilisieren nach Zugabe aller Komponenten. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>Für 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml PBS 10X, 40 ml ddH2O. Gestein zum Mischen. Bei RT lagern.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin/Phosphatpuffer Tween (BBTw)</td><td></td><td></td><td>Zur Herstellung von 1 l: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Rinderserumalbumin (BSA). Fügen Sie BSA hinzu und sterilisieren Sie es mit einem 0,2 &mu; M Vakuum-Filteranlage. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum (NGS)</td><td>ackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Zur Herstellung von 10 ml: Normales Ziegenserum 10 ml ddH2O. ddH2O in das Fläschchen mit NGS geben und mit einem 0,2 μ; m syrninge Filter. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO)</td><td></td><td>CAS: 281-57-9</td><td>Zur Herstellung von 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g DABCO fest, 3,5 ml 6N HCl, 250 &mu; l 10N NaOH, 70 ml Glycerin. In einen 250 ml Becher mit Rührstab ddH2O, Tris HCl und DABCO geben. Rühren Sie um und fügen Sie dann 6N HCl, 10 N NaOH und Glycerin hinzu. Fügen Sie dann tropfenweise 10N NaOH hinzu, bis die Lösung einen pH-Wert von 7,5 erreicht. Aliquot. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.</td></tr><tr><td>DABCO + p-Phenylendiamin (PPD) Lösung</td><td></td><td></td><td>1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). PPD in NaHCO3 und NaCO3Lösung auflösen. Addieren Sie 60 &mu; l PPD-Lösung auf 500 μm; l von DABCO. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Für <td>~200 Platten: 45 g Agar (CAS#9002-18-0), 45 g Kristallzucker (im Laden gekauft), 500 ml Apfelsaft (im Laden gekauft), 15 ml Tegosept 10%, 1,5 ml ddH2O. Agar zu ddH2O in einem 4-Liter-Kolben geben und 30 Minuten lang autoklavieren. Apfelsaft und Zucker auf einer erhitzten Rührplatte mischen. Fügen Sie nach und nach die Apfelsaftmischung zum autoklavierten Agar hinzu. Auf einer erhitzten Rührplatte mischen, dann 10 ml Volumen in 35 mm Petrischalen aliquotieren und bei RT erstarren lassen. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Tegosept 10%</td><td></td><td></td><td>Für 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml Ethanol. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Hefepaste</td><td></td><td></td><td>~50 g aktive Trockenhefe. ddH2O nach und nach in ein hefehaltiges Becherglas geben und dabei unter Rühren so lange auffüllen, bis eine pastöse Konsistenz erreicht ist. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 2: Färbematerialien</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000, vorrätig bei 5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Vasa</td><td></td><td></td><td>1:250, ein Geschenk von Ruth Lehmann.</td></tr><tr><td>Maus anti-fasciclin III</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>7G10</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Maus anti-1B1</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td>1:4</td></tr><tr><td>Guniea Schwein anti-Traffic Jam</td><td></td><td></td><td>1:2500, ein Geschenk von Dorthea Godt (Li et al., 2003).</td></tr><tr><td>Maus anti-Prospero</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Prospero MR1A</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ratte anti-Elav</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>7EBA10</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Maus anti-Repo</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>8D12</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ziege anti-kaninchen Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziege anti-maus Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Guniea Schwein Alexa633</td><td>Invitrogen</td><td>A21105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Ratte Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>1:500<</td></tr><tr>td colspan="4">Tabelle 3: Materialien und Ausrüstung</td></tr><tr><td>Fliegenkäfige</td><td>Handgemacht; Genesee Scientific Corporation</td><td>Nicht zutreffend; Flaschen: 32-130; Vorgefertigter Käfig: 59-101</td><td>Hergestellt durch Schneiden von durchsichtigen gegossenen Acrylrohren (1 3/4 Zoll Durchmesser) in 4 Zoll hohe Segmente mit einer Mehrweggehrungssäge bei 400 U/min. Ultrafeines Edelstahlsieb (wurde an einem Ende der Wanne mit Acrylkleber befestigt. Eine alternative Methode mit einer leeren Fliegenfutterflasche findet sich in Drosophila Protokolle ISBN 0-87969-584-4. Käfige können auch von der Genesee Scientific Corporation erworben werden.</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät: Branson 250 Digitaler Sonifikator</td><td>Branson</td><td>Modell: Branson Digital Sonifier 250</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallsonde</td><td>Branson</td><td>Modell #: 102C (CE)</td><td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter</td><td>Nalgene</td><td>190-25-20</td><td>0,2 &mu; m Zellulose, Acetat-Membranfilter</td></tr><tr><td>Bildgebungssystem: Konfokales Spinning-Disc-Mikroskop mit multichromatischer Lichtquelle, digitaler CCD-Kamera und Bildgebungssoftware</td><td>Mikroskop: Olympus, Lichtquelle: Lumen Dynamics, Kamera: Q-Imaging, Bildgebungssoftware: Intelligent Imaging Inc.</td><td></td><td>Mikroskop: BX51 ausgestattet mit DSU-Spinnscheibe, Lichtquelle: X-Cite 120Q, Kamera: RETIGA-SRV, Imaging-Software: Diabook 5.0</td></tr><tr><td>Vakuumfiltereinheit</td><td>Nalgene</td><td>450-0020</td><td>0,2 &mu; M Zellulosenitrat-Membranfilter</td></tr></tbody></table>

beschallung-erleichtert immunfluoreszenzfärbungen der late-stage embryonalen und larven<em&gt; drosophila</em&gt; gewebe<em&gt; in-situ</em

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studien in Drosophila melanogaster Embryonen durchgeführt und Larven stellen eine wichtige Einblicke in Entwicklungsprozesse wie Zell Schicksal Spezifikation und Organogenese. Immunfärbung ermöglicht die Visualisierung von sich entwickelnden Geweben und Organen. Eine Schutz Kutikula, die am Ende der Embryogenese bildet Jedoch verhindert die Permeation von Antikörpern in der späten Phase Embryonen und Larven. Während Dissektion vor der Immunfärbung wird regelmäßig verwendet werden, um Drosophila Larven Gewebe zu analysieren, erweist es sich als ineffizient für einige Analysen, weil kleine Gewebe kann schwierig sein, zu lokalisieren und zu isolieren. Beschallung stellt eine Alternative zur Dissektion in Larven von Drosophila-Immunfärbung Protokolle. Es ermöglicht die schnelle, gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Late-Stage-Embryonen und Larven und pflegt in situ Morphologie. Nach Fixierung in Formaldehyd wird eine Probe beschallt. Probe wird dann auf die Immunfärbung mit Antigen-spezifischen primären ant unteribodies und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper zur Zielzelltypen und bestimmte Proteine ​​über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Während des Prozesses der Ultraschallbehandlung ist die richtige Plazierung einer Beschallungssonde über der Probe, sowie die Dauer und die Intensität der Beschallung, kritisch. Für hohe Qualität Flecken können Zusätzliche kleinere Änderungen zur Standard-Immunfärbung Protokolle erforderlich. Antikörper mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis, in der Regel längere Inkubationszeiten erforderlich. Als Beweis für dieses Konzept Beschallung-Protokoll erleichtert, zeigen wir Immunfärbungen der drei Gewebetypen (Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe) mit einer Reihe von Entwicklungsstufen.

Um die Wirksamkeit von Ultraschall-basierten Immunfärbung in der Analyse von Spätstadium der embryonalen und Larvengewebe in situ zu zeigen, wurden Wildtyp-Embryonen und Larven für Immunfärbung von Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe verarbeitet. Proben wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet und repräsentative Ergebnisse sind dargestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Protokoll ist während der späten embryonalen bis Anfang / M...

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gewebe in C zwei mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie nach einer Beschallung sichtbar zu machen oder zu sättigen. Dies wird erreicht, indem zuerst embryonale und larvale Proben gesammelt und anschließend mit Formaldehyd, Heptan und Methanol fixiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die fixierten Proben zu beschallen, um das Cuticula zu entfernen und so das Eindringen von Antikörpern zu ermöglichen.Anschließend wird die Probe mit primären und fluoreszierenden sekundären Antikörpern immunhistochemisch gefärbt. Im letzten Schritt wird die Probe in einer auf Glycerin basierenden Antifade-Lösung eingebettet. Abschließend erfolgt die Visualisierung des sich entwickelnden Gewebes sowie der Proteinausprägung und -lokalisation mittels konfokaler oder epifluoreszenzmikroskopischer Verfahren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der Gewebedissektion liegt darin, dass sie die Visualisierung einer Vielzahl sich entwickelnder Gewebe ermöglicht. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da der Beschallungsschritt von mehreren Faktoren abhängt, um maximale Effizienz zu erreichen, einschließlich der korrekten Positionierung der Beschallungssonde. Die Durchführung des Verfahrens werden Ashley Fiddler und Lauren Bole demonstrieren, zwei talentierte Studierende aus meinem Labor. Um das Experiment zu beginnen, entfernen Sie die auf einer Agarplatte gesammelten Embryonen vorsichtig mit einem kleinen Pinsel, der mit Phosphatpuffer-Triton-X-100 oder PBTX-Lösung benetzt ist. Wischen Sie anschließend den mit Proben beladenen Pinsel an der innenliegenden Kante eines Zellsiebs ab. Legen Sie eine Petrischalenunterlage unter den Zellsieb.Danach die Pinsel und die Wände des Zellfilters mit einer Sprühflasche, die PBTX enthält, ausspülen. Sobald die Probe in den Filter überführt wurde, so viel PBTX in den Filter gießen, dass die Probe von dem Netz gelöst wird. Diesen Schritt dreimal wiederholen, um Hefe und Fliegenabfälle zu entfernen, anschließend PBTX entfernen.Danach 50 %ige Bleichlösung in das Sieb gießen und die Larven fünf Minuten lang in der Lösung belassen. Anschließend die Lösung entfernen. Danach die Probe mit PBTX waschen und drei Minuten lang in der Lösung belassen.Wiederholen Sie den Schritt fünfmal und trocknen Sie die Unterseite des Zellsiebs. Überführen Sie dann die Probe mit einem Pinsel, der mit PBTX befeuchtet ist, in ein Szintillationsfläschchen, das 1,75 Milliliter Pems enthält. Geben Sie in einer Abzugshaube 250 Mikroliter 37 % Formaldehyd und acht Milliliter reagenzgradige Flüssigkeit hinzu.Heptan in das Szintillationsfläschchen geben und das Fläschchen 20 Minuten lang bei 200 U/min schütteln. Dann 10 Milliliter Methanol zum Szintillationsfläschchen hinzufügen, ohne die wässrige Phase zu entfernen, und kräftig bei 500 U/min schütteln. Unmittelbar nach dem Schütteln den Inhalt in ein Zellfilter über einem Behälter für flüssige Abfälle gießen.Fügen Sie zusätzliches Methanol in das Gefäß hinzu und lassen Sie die Inhalte durch den Zellfilter laufen. Um sicherzustellen, dass die gesamte Probe entfernt wurde, tupfen Sie den Boden des Zellfilters mit Laborpapier ab.Tragen Sie dann mit einem Pinsel die Probe vom Sieb in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 0,5 Milliliter Methanol enthält. Warten Sie, bis sich die Probe abgesetzt hat. Entfernen Sie anschließend das Methanol mit einer Pipette und ersetzen Sie es durch ein frisches Aliquot von 0,5 Milliliter Methanol.Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und geben Sie abschließend 0,5 Milliliter Methanol in das Röhrchen, bevor Sie es bei minus 20 Grad Celsius lagern. Für die spätere Verwendung entnehmen Sie die Probe aus dem Gefrierschrank und entfernen das Methanol mit einer Pipette. Geben Sie dann 1 Milliliter einer 50 %igen Methanol-Phosphatpuffer-Tween- oder PBTW-Lösung in das Röhrchen und schwenken Sie das Röhrchen drei Minuten lang.Anschließend wird die Probe zweimal mit je einem Milliliter PBTW gespült, wobei die Probe vor dem Absaugen des PBTW mit einer Pipette jeweils absacken darf; danach werden 1,0 Milliliter bovines Serumalbumin-Phosphatpuffer-Tween, kurz BBTW, in das Gefäß gegeben und drei Minuten lang geschwenkt. Die Probe absacken lassen und das BBTW mit einer Pipette entfernen. Dieser Schritt wird zwei Mal wiederholt.Dabei darauf achten, so viel BBTW wie möglich zu entfernen, ohne Probenmaterial zu verlieren. Anschließend 0,5 Milliliter BBTW zum Röhrchen hinzufügen und auf Eis stellen. Danach den Sonifikator auf 10 % maximale Amplitude und eine Laufzeit von zwei Sekunden mit konstantem Betrieb einstellen, den Sondeprobenhalter reinigen, indem die Sondenspitze in ein 50-Milliliter-Kegelröhrchen mit entionisiertem Wasser getaucht wird, und den Sonifikator betätigen.Trocknen Sie die Ultraschallsonde anschließend mit einem Laborpapier ab. Tauchen Sie die Sonde in das Reaktionsgefäß, drei bis vier Millimeter über der Probe, und beginnen Sie die Beschallung. Entfernen Sie danach das Reaktionsgefäß und stellen Sie es 30 Sekunden lang auf Eis, um eine Überhitzung durch die Beschallung zu verhindern, und lassen Sie die Probe am Boden des Gefäßes absetzen.Wiederholen Sie diesen Schritt je nach Alter der Probe, nachdem die Beschallung abgeschlossen ist. Spülen Sie die Probe zwei Mal mit einem Milliliter BBTW aus. Lassen Sie nach jedem Spülvorgang die Probe absetzen, bevor Sie das BBTW mit einer Pipette abziehen. Geben Sie anschließend einen Milliliter BBTW in das Gefäß und stellen Sie es auf einen Schüttler.Nach drei Minuten das Ansiedeln der Probe ermöglichen und das BBTW mit einer Pipette entfernen. Danach dies zweimal wiederholen. Im zweiten Schritt die Probe mit 0,5 Milliliter 5 % normalem Serum, das in BBTW verdünnt ist, blockieren und die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einen Schüttler stellen.Fügen Sie anschließend 0,5 Milliliter Primärantikörperlösung hinzu und schwenken Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius; lassen Sie die Probe am Boden des Röhrchens absetzen. Danach entfernen Sie die Primärantikörper mit einer Pipette und waschen die Probe zweimal mit je einem Milliliter BBTW. Geben Sie einen Milliliter BBTW in das Röhrchen und stellen Sie es dann für drei Minuten auf einen Schüttler.Entfernen Sie dann das BBTW mit einer Pipette und wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal. Blockieren Sie die Probe anschließend mit einer 5 %igen normalen Serum-BBTW-Lösung und schwenken Sie sie 30 Minuten lang. Entfernen Sie danach die Lösung.Fügen Sie sekundären Antikörper, der in 5 % normalem Serum BBTW-Lösung verdünnt wurde, hinzu und wickeln Sie das Röhrchen in Aluminiumfolie ein. Inkubieren Sie die Probe dann über Nacht bei vier Grad Celsius unter Schütteln. Entfernen Sie die sekundären Antikörper mit einer Pipette und waschen Sie die Probe zweimal mit einem Milliliter PBTW. Fügen Sie anschließend ein Milliliter PBTW zu dem Vial hinzu und stellen Sie es fünf Minuten lang auf einen Schüttler. Lassen Sie die Probe dann absetzen und entfernen Sie das PBTW mit einer Pipette. Wiederholen Sie dies.Dreimal wiederholen. Fügen Sie 80 bis 100 Mikroliter DAB-Ko-Lösung zum Röhrchen hinzu und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Zum Schluss verwenden Sie zum Aufbringen der Probe fünf bis 10 Mikroliter DAB BCO P-Len-Diamin oder PPD-Antifade.Danach mit Fluoreszenzmikroskopie untersuchen. Diese Z-Projektionen von vier konfokalen Schnitten demonstrieren die Wirksamkeit des Protokolls zur Visualisierung morphologischer Merkmale sowie einzelner Zellen in C zwei während der späten embryonalen bis frühen und mittleren L-drei-Stadien der Drosophila-Entwicklung. Die Hodenentwicklung ist ein besonders geeignetes System, um die Wirksamkeit des Protokolls zu veranschaulichen, da die Hodenreifung während der larvalen Entwicklung dynamisch verläuft.Diese Bilder zeigen Keimzellen in Rot sowie Hub-Zellen und FU-Zonen in Grün – einzelne konfokale Schnitte von mittleren L3-Gehirnen. Immunfärbung für Ganglienmutterzellen, undifferenzierte Neuronen in Grün sowie unreife und primäre Neuronen. In Rot erscheinen starke Färbungen mit charakteristischen Expressionsmustern in den Gehirnlappen und der ventralen Nervenstrang, abhängig von der Montageorientierung. Die Bildgebung ermöglicht die Visualisierung des Gehirngewebes von der dorsalen Oberfläche, der ventralen Oberfläche oder in sagittalen Querschnitten.Diese in-situ-Zwei-Technik ermöglicht es Biologen, die Organentwicklung während der Gewebemorphogenese bei Organismen zu untersuchen, bei denen eine schützende Cuticula das Eindringen von Antikörpern verhindert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man späte Embryonal- und Larvenproben der Speiseröhre sonifiziert und immunfärbt, um entstehende Gewebe in C zwei sichtbar zu machen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Formaldehyd, Heptan und Methanol äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem Abzug.Es sollte stets das Tragen geeigneter Handschuhe und eines Laborkittels beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie arbeitet darüber hinaus das Eindringen Grenzen der Gewebe-Schnitte Fluoreszenzmikroskopie. Die Technik basiert auf Multi-Projektion Beleuchtung und ein Photon Transport Beschreibung basiert. Wir zeigen in-vivo Ganzkörper-3D-Visualisierung der Morphogenese von GFP-exprimierenden Flügel Imaginalscheiben...

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

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Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

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Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven

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