Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven Drosophila Gewebe In-situ
14. August 2014
Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Gewebe in C zwei mittels Fluoreszenzmikroskopie nach Ultraschall sichtbar zu machen oder zu sättigen. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonal- und Larvenproben entnommen und dann mit Formaldehyd, Heptan und Methanol fixiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die fixierte Probe zu beschallen, um die Kutikula zu entfernen und das Eindringen von Antikörpern zu ermöglichen.
Als nächstes wird die Probe mit primären und fluoreszierenden Sekundärantikörpern immungefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, die Probe in eine Antifa-Lösung auf Glycerinbasis einzubetten. Letztendlich wird die konfokale oder epi-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um das sich entwickelnde Gewebe sowie die Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der Gewebedissektion besteht darin, dass sie die Visualisierung einer Vielzahl von sich entwickelnden Geweben ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da der Beschallungsschritt von einer Reihe von Faktoren abhängt, um eine maximale Effizienz zu erreichen, einschließlich der richtigen Positionierung der Sonica-Sonde. Ashley Fiddler und Lauren Bole, zwei talentierte Forscher aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen.
Um das Experiment zu beginnen, entfernen Sie vorsichtig Embryonen, die auf einer Agarplatte gesammelt wurden, mit einem kleinen Pinsel, der mit Phosphatpuffer Triton X 100 oder PBTX-Lösung verbunden ist. Wischen Sie anschließend mit der Probe beladenen Pinsel gegen den nach innen gerichteten Grat eines Zellensiebs. Legen Sie eine Petrischalenabdeckung unter das Zellsieb.
Spülen Sie dann den Pinsel und die Wände des Zellsiebs mit einer Spritzflasche aus, die PBTX enthält. Nachdem die Probe in das Sieb überführt wurde, gießen Sie genügend PBTX in das Sieb, um die Probe vom Netz abzuheben. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, um Hefe- und Fliegenabfälle zu entfernen, entfernen Sie PBTX.
Gießen Sie dann 50%ige Bleichlösung in das Sieb und lassen Sie die Larven fünf Minuten in der Lösung sitzen. Entfernen Sie anschließend die Lösung. Waschen Sie dann die Probe mit PBTX und lassen Sie die Probe drei Minuten in der Lösung ruhen.
Wiederholen Sie den Schritt fünfmal, trocknen Sie den Boden des Zellsiebs. Verwenden Sie dann einen mit PBTX verheirateten Pinsel, um die Probe in ein Szintillationsfläschchen mit 1,75 Millilitern Pems zu überführen. Geben Sie in einen Abzug 250 Mikroliter 37 % Formaldehyd und acht Milliliter Reagenzqualität.
Heptan in das Szintillationsfläschchen geben und das Fläschchen 20 Minuten lang bei 200 U/min schütteln. Geben Sie dann 10 Milliliter Methanol in das Szintillationsfläschchen, ohne die wässrige Phase zu entfernen, und schütteln Sie es kräftig bei 500 U/min. Gießen Sie den Inhalt nach dem Schütteln sofort in ein Zellsieb über einem Behälter für flüssige Abfälle.
Geben Sie zusätzliches Methanol in das Fläschchen und lassen Sie den Inhalt durch das Zellsieb laufen. Um sicherzustellen, dass die gesamte Probe entnommen wurde. Probieren Sie den Boden des Zellsiebs mit Laborgewebe aus.
Übertragen Sie dann die Probe mit einem Pinsel aus dem Sieb in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,5 Millilitern Methanol. Warten Sie, bis sich die Probe abgesetzt hat. Entfernen Sie dann das Methanol mit einer Pipette und ersetzen Sie es durch ein frisches 0,5 Milliliter Aliquot Methanol.
Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und geben Sie letzte 0,5 Milliliter Methanol in das Röhrchen, bevor Sie es bei minus 20 Grad Celsius lagern. Für später können Sie die gelagerte Probe aus dem Gefrierschrank nehmen und das Methanol mit einer Pipette entfernen. Geben Sie dann einen Milliliter eines 50%igen Methanolphosphatpuffers oder einer PBTW-Lösung in das Röhrchen und wiegen Sie das Röhrchen drei Minuten lang.
Spülen Sie anschließend die Probe zweimal mit einem Milliliter PBTW ab, damit sich die Probe absetzen kann, bevor Sie das PBTW mit einer Pipette abziehen, geben Sie 1,0 Milliliter Rinderserumalbuminphosphat-gepuffertes Tween oder BBTW in das Fläschchen und schütteln Sie es drei Minuten lang. Lassen Sie die Probe absetzen und entfernen Sie den BBTW mit einer Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
Achten Sie darauf, so viel BBTW wie möglich zu entfernen, ohne dass etwas von der Probe verloren geht. Gib dann 0,5 Milliliter BBTW in die Tube und lege sie auf Eis. Als nächstes stellen Sie das Ultraschallat auf 10 % maximale Amplitude und eine Laufzeit von zwei Sekunden mit konstanter Amplitude ein, reinigen Sie die atorsonde, indem Sie die Sondenspitze in ein konisches 50-Milliliter-Rohr legen, das mit deionisiertem Wasser gefüllt ist, und lassen Sie das Ultraschallat laufen.
Trocknen Sie dann die Ultraschallsonde mit einem Laborgewebe ab. Tauchen Sie die Sonde drei bis vier Millimeter über der Probe in das Röhrchen ein und starten Sie die Beschallung. Nehmen Sie dann das Röhrchen heraus und legen Sie es 30 Sekunden lang auf Eis, um eine Überhitzung durch die Beschallung zu verhindern und damit sich die Probe am Boden des Röhrchens absetzen kann.
Wiederholen Sie diesen Schritt je nach Alter der Probe nach Abschluss der Beschallung. Spülen Sie die Probe zweimal mit einem Milliliter BBTW. Lassen Sie die Probe nach jedem Spülen absetzen, bevor Sie das BBTW abtrocknen. Geben Sie mit einer Pipette einen Milliliter BBTW in das Fläschchen und stellen Sie es auf eine Wippe
.Lassen Sie die Probe nach drei Minuten absetzen und entfernen Sie den BBTW mit einer Pipette. Wiederholen Sie dies dann. Blockieren Sie die Probe in zwei Schritten mit 0,5 Millilitern 5 % normalem Serum, verdünnt in BBTW, in das Röhrchen und legen Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf eine Wippe.
Fügen Sie anschließend 0,5 Milliliter Primärantikörperlösung hinzu und schütteln Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius, damit sich die Probe auf dem Boden des Röhrchens absetzen kann. Anschließend werden mit einer Pipette Primärantikörper entnommen und zweimal mit einem Milliliter BBTW gespült. Geben Sie einen Milliliter BBTW in das Fläschchen und stellen Sie es dann drei Minuten lang auf eine Wippe.
Entfernen Sie dann den BBTW mit einer Pipette und wiederholen Sie diesen Vorgang. Fünfmal Schritt vor, blockieren Sie die Probe mit 5% normaler Serum-BBTW-Lösung und schütteln Sie sie 30 Minuten lang. Entfernen Sie dann die Lösung.
Fügen Sie einen Sekundärantikörper hinzu, der mit 5% normaler Serum-BBTW-Lösung verdünnt ist, und wickeln Sie das Röhrchen in Aluminiumfolie ein. Schütteln Sie die Probe dann über Nacht bei vier Grad Celsius. Entnehmen Sie Sekundärantikörper mit einer Pipette und spülen Sie die Probe zweimal mit einem Milliliter PBTW aus.
Geben Sie anschließend einen Milliliter PBTW in das Fläschchen und legen Sie es fünf Minuten lang auf eine Wippe. Lassen Sie dann die Probe absetzen und entfernen Sie das PBTW mit einer Pipette. Wiederholen Sie dies.
Treten Sie dreimal vor. Geben Sie 80 bis 100 Mikroliter DAB-Co-Lösung in das Röhrchen und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Zum Schluss verwenden Sie zur Montage der Probe fünf bis 10 Mikroliter DAB BCO p lene diamin oder PPD anti fade.
Betrachten Sie es dann mit der Fluoreszenzmikroskopie. Diese Z-Projektionen von vier konfokalen Schnitten zeigen die Wirksamkeit des Protokolls zur Visualisierung morphologischer Merkmale sowie einzelner Zellen in C zwei während der spätembryonalen bis frühen und mittleren L-3-Stadien der Drosophila-Entwicklung. Die Hodenentwicklung ist ein besonders gutes System zur Veranschaulichung der Wirksamkeit des Protokolls, da die Hodenreifung während der gesamten Larvenentwicklung dynamisch ist.
Diese Bilder zeigen Keimzellen in roten und Nabenzellen sowie FU-Zonen in grünen, einzelnen konfokalen Schnitten des mittleren L-Gehirns. Immunfärbung für Ganglien-Mutterzellen, undifferenzierte Neuronen in grünen und unreifen und primären Neuronen. In Rot zeigen sich starke Färbungen mit deutlichen Expressionsmustern in den Hirnlappen und im ventralen Nervenstrang, je nach Montageausrichtung, die Bildgebung ermöglicht die Visualisierung des Hirngewebes von der dorsalen Oberfläche, der ventralen Oberfläche oder im sagittalen Querschnitt.
Diese In-situ-Zwei-Technik ermöglicht es Biologen, die Organentwicklung bei der Gewebemorphogenese in Organismen zu untersuchen, bei denen eine schützende Kutikula das Eindringen von Antikörpern verhindert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man embryonale und larvale Speiseröhrenproben im späten Stadium beschallt und immunfärbt, um die Entwicklung von Geweben in C zwei sichtbar zu machen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd, Heptan und Methanol äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug.
Das Tragen geeigneter Handschuhe und eines Laborkittels sollte bei der Durchführung dieses Verfahrens immer beachtet werden.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Immunfärbung von Geweben von Drosophila melanogaster unter Verwendung von Beschallung vor. Die Methode ermöglicht die Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine, ohne dass eine Dissektion erforderlich ist, und steigert so die Effizienz bei der Untersuchung sich entwickelnder Gewebe.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Die Immunfärbung ist entscheidend, um Proteine in Geweben sichtbar zu machen.
- Herkömmliche Methoden erfordern häufig eine Dissektion, was zeitaufwendig sein kann.
- Die Beschallung kann den Antikörperzugang erleichtern, indem sie die Cuticula entfernt.
- Mittels Fluoreszenzmikroskopie wird die Lokalisation von Proteinen beobachtet.
Zweck der Studie
- Eine effiziente Immunfärbungsmethode für ganze Larven präsentieren.
- Die Proteinausprägung in Drosophila-Geweben sichtbar machen.
- Die Zugänglichkeit für Antikörperinfiltration in fixierten Proben verbessern.
Verwendete Methoden
- Sammlung von embryonalen und larvalen Proben.
- Fixierung mit Formaldehyd, Heptan und Methanol.
- Sonikation zur Entfernung der Cuticula.
- Immunfärbung mit primären und fluoreszierenden sekundären Antikörpern.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung sich entwickelnder Gewebe mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Effektiver Antikörpereindring durch Beschallung erreicht.
- Deutliche Lokalisation von Proteinen innerhalb der Proben.
- Das Protokoll verbessert die Effizienz von Immunfärbungsverfahren.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode vereinfacht den Immunfärbungsprozess.
- Sonorisation ist eine wertvolle Technik zur Vorbereitung von Drosophila-Geweben.
- Dieses Protokoll kann weitgehend für ähnliche Studien in der Entwicklungsbiologie übernommen werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese durch Sonikation unterstützte Immunfluoreszenzmethode behebt einen zentralen Engpass in der Entwicklungsbiologie-Forschung: die undurchlässige Cuticula in späten Stadien von Drosophila-Embryonen und -Larven, die den Antikörpern den Durchtritt erschwert. Indem die Methode die Immunfärbung von Ganzpräparaten ohne Dissektion ermöglicht, verbessert sie die Durchsatzkapazität und erhält die Gewebemorphologie, wodurch eine zuverlässige Zielvalidierung in genetischen und phänotypischen Screens unterstützt wird. Der Ansatz steigert die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er quantitative, räumlich aufgelöste Daten zur Proteinausprägung liefert, die für die mechanistische Absicherung therapeutischer Hypothesen entscheidend sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Visualisierung der Proteinlokalisation in intakten Geweben und verringert damit mechanistische Unschärfen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Hochdurchsatzverarbeitung großer Probenmengen und verbessert die Effizienz bei der Zielvalidierung.
- Strategischer Wert: Erleichtert die phänotypische Bildschirmung, indem gleichzeitige Analysen mehrerer Gewebetypen (z. B. Hoden, Eierstöcke, Nervengewebe) über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg ermöglicht werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Fluoreszenzsignale, die eine standardisierte Beurteilung der Antigenexpressionsniveaus ermöglichen.
- Operativer Wert: Erhält die in-situ-Gewebearchitektur, gewährleistet die Reproduzierbarkeit des Assays und verringert die Variabilität durch Artefakte der Dissektion.
- Strategischer Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening-Phase vor, indem die Zielinteraktion und Expressionsmuster bestätigt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet krankheitsrelevante zelluläre Auflösung in Drosophila-Modellen und unterstützt so die translationale Entdeckung von Biomarkern für neurodevelopmentelle und reproduktive Signalwege.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem konsistente Protokolle für die Gewebepräparation und Färbung beibehalten werden.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung durch zuverlässige, räumlich aufgelöste Daten zur Proteinlokalisation.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zur Leitstruktur-Identifizierung, insbesondere wenn für das phänotypische Screening die Analyse intakter Gewebe und die quantitative Lokalisierung von Proteinen erforderlich ist.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem spezifische Zelltypen und die Proteinausprägung in sich entwickelnden Geweben sichtbar gemacht werden.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, reproduzierbare Immunfärbungen mit quantitativen Fluoreszenzausgaben, die für die Bewertung von Verbindungen geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt messbare Ergebnisse (Fluoreszenzintensität, Lokalisierungsmuster), die es Teams ermöglichen, experimentelle Bedingungen zu vergleichen und die Zielmodulation zu bewerten.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem gewebeebene Daten bereitgestellt werden, die mit entwicklungsbedingten Phänotypen in Bezug auf menschliche Krankheitsmodelle übereinstimmen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Probenvorbereitungskapazität, die auf mehrere Projekte in der Entwicklungsbiologie und genetischen Analyse übertragen werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem falsch-negative Ergebnisse aufgrund mangelhafter Antikörperpenetration verringert und die Genauigkeit der Zielstrukturvalidierung verbessert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit durch einen optimierten, aufwandsarmen Protokollablauf ohne Präparationsschritte, der mit der Verarbeitung großer Probenvolumina kompatibel ist.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung von Zielstrukturen, indem zuverlässige mechanistische Erkenntnisse bereitgestellt werden und das biologische Risiko in späteren Entwicklungsstadien reduziert wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten Expressionsmustern und funktioneller Relevanz in krankheitsrelevanten Systemen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse bei der Optimierung der Sonikationsparameter (Sondenposition, Amplitude, Dauer), um Probenbeschädigungen zu vermeiden und gleichzeitig eine vollständige Entfernung der Cuticula sicherzustellen.
- Setzt den Zugang zu einer Sonikationsausrüstung mit präzisen Amplituden- und Zeitsteuerungen sowie zu Standardreagenzien für Immunfluoreszenz und Fluoreszenzmikroskopie voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei Sonikations- und Färbeprotokollen, um die Reproduzierbarkeit zwischen Anwendern und Laboren zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungen für verschiedene Drosophila-Gewebetypen und Entwicklungsstadien, da die Effizienz der Sonikation je nach Probenalter und Dicke der Cuticula variieren kann.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit, Inkubationszeiten von Antikörpern für schwach exprimierte Zielstrukturen zu optimieren, sowie die sorgfältige Handhabung gefährlicher Reagenzien (Formaldehyd, Heptan, Methanol).
