Name: Die Beurteilung artspezifische Um Beiträge Craniofacial Entwicklung mit Wachtel-Ente Chimären (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung von Wachtel-Enten-Chimären zur Untersuchung artspezifischer Beiträge neuraler Kammzellen zur kraniofazialen Entwicklung. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Entwicklungsbiologie und Evolution.

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Diese Arbeit wurde durch ein National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung (NIDCR) F32-Stipendium (DE021929), um JLF und NIDCR R01 Zuschuss DE016402 RAS finanziert

1. Bereiten Tungsten Nadeln <ol><li> Schneiden Sie ein Wolframstab in die Hälfte mit Drahtschneider, so dass die Stange nicht verbiegt. </li><li> Fädeln Sie den Stab durch die sich verjüngende Ende einer 5 3/4 in Borosilikatglas Pasteur Pipette. </li><li> Wobei ungefähr 3/4 in der Stange ragte aus dem Glas haften die Stange in die Pipettenspitze mit einem kleinen Wulst &quot;Heißschmelzkleber&quot; (HMA), die für eine Klebepistole verwendet Klebestift ist. Die HMA sollte sich schnell in einem Alkohol-Flamme geschmolzen werden, kümmert sich nicht um den Kleber zu verbrennen und schwarzen Rauch erzeugen. </li><li> Mit einer Zange, biegen Sie die Spitze der Wolframstab (ca. 1/4 in der oberen Ende), bis ein Winkel von 45 ° erreicht wird. </li><li> Halten des Pasteur-Pipette, stellen etwa 1/8 in der Spitze des Wolframstabes in die Flamme eines Propanbrenners. Halten Sie die Spitze stabil und exakt senkrecht zur Flamme. </li><li> Ziehen Sie die Nadel aus der Flamme der Moment, eine winzige Spur von Orange tungszehn Fliegen von der Nadel. </li></ol> 2. Bereiten Spemann Pipetten <ol><li> Mit einem Bunsenbrenner erhitzen, das schmale Ende einer Pasteur-Pipette, bis das Glas kurz über die Verjüngung zu schmelzen beginnt. Vom Herd nehmen und ziehen Sie die Spitze, bis die Pipette wird abgedichtet. Achten Sie darauf, dass es bleibt ein Teil des konischen Teil, der einen Außendurchmesser von ca. 0,7 bis 1,0 mm aufweist. Brechen Sie das verschlossene Ende aus etwa 4 cm von der Verjüngung. </li><li> Befestigen etwa 2 Fuß (60 cm) Gummischlauch der breiten (offene) Ende der Pipette. Schlag auf das andere Ende des Gummischlauchs, um sicherzustellen, daß keine Luft durch den konischen Teil des Pasteur-Pipette passieren. </li><li> Verwendung eines Propanbrennstoffzylinder mit einem daran befestigten Stift Flammenbrenner, Wärme eine ovale Fläche auf einer Seite der Pipette gerade unterhalb dem Beginn der Verjüngung. Blasen Luft sehr leicht und ständig durch den Gummischlauch mit einem leichten Druck (ungefähr die Menge an Druck benötigt, um den Beginn der Lette sagenr &quot;P&quot; am Gespräch Ebene). Wenn das Glas weich wird auf der einen Seite und beginnt, nach außen wölben, die Pipette schnell zu entfernen, von der Flamme und blasen hart und stabil durch den Gummischlauch. Dadurch wird der beheizte Teil des Glases, eine wurstförmige Blase, die Pop-, das ist gut zu bilden. Wenn die Blase zu klein ist, versuchen Schmelzen und bläst das Glas wieder. Die endgültige offenen Fenster in dem Glas sollte etwa 0,25 in (6,35 mm) breit und 0,5 Zoll (12,7 mm) lang sein. </li><li> Zeige das verjüngte Ende nach oben, kratzen die Blase in eine Glasabfallbehälter während sanft weht durch den Schlauch zum Glasfragmente in die Pipette zu verhindern. </li><li> Mit der Propanflamme, verbrennen die übrigen Kanten der Blase und Feuerpolitur die Seiten der offenen Fenster. Achten Sie darauf, um die Welle der Pipette zu schmelzen. </li><li> Mit einer Diamantspitze Bleistift, punkten die verjüngte Ende der Pipette etwa 1,25 in (30 mm) aus dem Fenster und brechen Sie die Spitzemit einer Pinzette, so dass der Pipettenöffnung ist sauber geschnitten (Ablage Pipetten mit gebrochenen oder unebenen Spitzen). </li><li> Mit einer Pinzette und dem Rand einer Flamme aus einem Brenner Alkohol, beugen der schmale Abschnitt der Pipetten 0,375 in (9,5 mm) von der Spitze bis zu einem Winkel von etwa 60 °, so dass der gebogene Abschnitt in einer vertikalen Ebene, wenn die Fensteröffnung ist am 01.00 Position für Rechtshänder Nutzung und 11:00 Uhr für Linkshänder Nutzung. Dieser Schritt wird am besten in einem zugfreien Gehäuse durchgeführt. </li><li> Brandlack die Spitze mit der Alkoholflamme unter einem Binokular. Achten Sie darauf, nicht zu schließen, von der Spitze zu halten, sondern um die Öffnung und glatt, ohne Verengung. </li><li> Schneiden Sie eine 1 in (25 mm) Stück Gummischlauch, Spray der Schlauchstück mit 70% Ethanol, und schieben Sie den Schlauch über den Schaft der Pipette, bis die Fensteröffnung vollständig bedeckt ist. Dieser fungiert als &quot;Membran&quot; der Spemann-Pipette. </li><li> Legen Sie eine Latex-Gummi-Birne 2 mlüber den offenen Boden der Pipette. Die Lampe behält Unterdruck im Spemann Pipette. </li><li> Um der Praxis mit einem Spemann Pipette Chromatographie Perlen von rund 100 bis 200 um im Durchmesser von einer markierten Stelle in eine Petrischale zu einer markierten Stelle in einem anderen unter dem Mikroskop. </li><li> Zur Reinigung des Spemann-Pipette, entfernen Sie den Gummiball und Ort Pipette, Spitze nach unten, in ein hohes Becherglas mit Baumwolle oder Gaze am Boden ausgekleidet und mit destilliertem Wasser und Glasreinigungsmittel gefüllt. </li></ol> 3. Sterilisieren und Eier inkubieren <ol><li> Wischen Eier mit 70% Ethanol und die Eier auf Kunststoffeierablagen. </li><li> Stellen Sie Eier in einem Wärmeschrank bei 37,5 ° C und 85-87%. </li><li> Eier auszubrüten, bis sie HH9.5, ca. 26 h für Wachteln und 48 Stunden für die Ente zu erreichen. </li></ol> 4. Fenster Eier <ol><li> Entfernen Sie ein kleines Stück der Außenhülle von der Spitze des Eies mit einer Pinzette, kümmert sich nicht um die Innenschale m Punktionembrane. </li><li> Unter Verwendung einer Spritze mit einer 18 G um 1-Zoll-Nadel, stoßen ein Loch an der engsten Spitze des Ei-und zurücktreten etwa 1-2 ml Albumin. </li><li> Zeigen transparenten Klebeband über das Loch und Einstichstelle in der Schale. </li><li> Schneiden ein &quot;Fenster&quot; auf der oberen Oberfläche des Eies (durch das durchsichtige Band) mit einer gebogenen Schere. </li></ol> 5. Visualisieren Embryonen und Vorbereitung für Chirurgie <ol><li> Mit einem Glasstab, Pinsel vorsichtig eine kleine Menge von Neutral Rot (0,02 g / ml in Hanks BSS) über den Embryo. </li><li> Schneiden Sie die Dotterhaut und ziehen ihn über den Embryo mit einem flamm geschärft Wolfram-Nadel. </li><li> Neu abdichten das Ei, indem transparente Klebeband über dem Fenster. </li></ol> 6. Trennen Sie das Spendergewebe aus dem Spender Embryo <ol><li> Entfernen Band aus dem Fenster auf dem Ei des Spenderembryo. </li><li> Um die neuronalen Stall aus dem angrenzenden Ektoderm des Spenders Embryo abgeschnitten sind, müssen Schlitze auf beiden sidn des Neuralrohrs, mit einem Flamm geschärft Wolfram Nadel (hergestellt wie oben beschrieben). </li><li> Dann wird über das Neuralrohr Schnitt an der gewünschten vorderen und hinteren Stufen des Transplantats und trennen das Transplantat von dem Rest des Neuralrohrs. </li><li> Entfernen des neuronalen Falte vom Spender Embryo unter Verwendung entweder eines Spemann Pipette oder eine andere Art von Mikropipette. </li><li> Dann entfernen Sie das Klebeband aus dem Fenster auf dem Host-Ei und verwenden Sie den Spemann-Pipette, um die Spender neuronalen Falte neben dem Wirtsembryo angrenzend an den Bereich des Neuralrohrs, die die Transplantation erhalten, werden zu platzieren. </li></ol> 7. Trennen Sie den Host-Gewebetransplantation und das Spendergewebe <ol><li> Trenne die neuronale fache des Neuralrohrs der Wirtsembryo, wie bei dem Spender durchgeführt. Achten Sie auf ein Transplantat von gleicher Größe wie das Spendergewebe zu entfernen. </li><li> Schieben Sie dieses Wirtsgewebe weit weg von den Embryo. </li><li> Dann, mit einem stumpfen Wolfram-Nadel oder der abgerundeten Spitze eines micropipette, sanft bewegen die Geber neuronalen in die Wirts Neuralrohr falten, die Aufrechterhaltung der richtigen anterior-posterioren und dorso-ventralen Orientierungen. Stellen Sie sicher, das Transplantat in an den Seiten versteckt, aber sicher sein, nicht zu stoßen oder Schäden an den darunter liegenden Gewebe. Um den Überblick über die ursprüngliche Ausrichtung Vermerk jeder Asymmetrie in der Spendergewebe oder Differential-Färbung aus der Neutral Red. Wir photo Dokument der Spender Embryo mit den beigefügten geschnittene Gewebe sowie der Chimäre unmittelbar nach der Operation. </li><li> Sterile Kochsalzlösung ist zum Ei gegeben werden, wenn die Wirtsembryo Anzeichen von Austrocknung. </li><li> Nun wieder vorsichtig Dichtung und beschriften Sie das Ei, und sanft schicken Sie es an einer hohen Feuchtigkeit Inkubator (70-80%), wo die chimären Embryo kann auf die gewünschte Stufe für die Analyse zu entwickeln. </li></ol> 8. Sammlung von Chimären <ol><li> Achten Sie darauf, chimären Embryonen in frisch zubereitete kalte Serras Fixiermittel zu sammeln und sofort legen sie auf ein Ro-cker bei 4 ° C für eine O / N-Fixierung. Dies wird für mehr empfindlichen Nachweis von Wachtel-Zellen mit dem anti-Wachtel-Antikörper zu ermöglichen. </li><li> Für Genexpressionsanalysen mittels RT-qPCR, gefrier Embryonen in flüssigem Stickstoff direkt vor der RNA-Extraktion. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Neuralleiste ist eine vorübergehende embryonalen Zellpopulation, die ausgiebig wandert den ganzen Embryo und differenziert in verschiedene Zelltypen, einschließlich Chondrozyten und Osteoblasten, die auf der kraniofazialen Skeletts beitragen. Umpflanzen Neuralleiste in der Wachtel-Ente chimären System hat wesentlich zu unserem Verständnis der Gewebe-Wechselwirkungen und Signalwege, die Entwicklung des Schädel-Gesichtsskeletts regulieren beigetragen. , Angesichts der riesigen Potenzial der Neuralleiste zu erzeugen auch glatte Muskelzellen, Fettzellen, Melanozyten, Schwann-Zellen und Neuronen, die ein enormes Potenzial für zukünftige Anwendungen, insbesondere in Verbindung mit der schnellen Weiterentwicklung der Stammzellbiologie jedoch die Wachtel-Ente Chimärensystem und der regenerativen Medizin. Da Wachteln und Enten sind beide kommerziell gezüchtete Arten, ist ein Vorrat an relativ preiswert befruchteten Eier aus einer Vielzahl von landwirtschaftlichen Betrieben zur Verfügung. Daher sollte diese Technik zugänglich sein researcihr Betrieb in einem weiten Bereich von Budgets und Anlage Raum. Obwohl diese Technik ist sehr leistungsfähig, gibt es weiterhin einige Einschränkungen. Wie andere chirurgische Techniken, die Qualität und die Lebensfähigkeit der Wachtel-Ente Chimären setzen auf die chirurgischen Fähigkeiten des Forschers, und deshalb wird es mehr inter-und intraindividuelle Unterschiede zwischen den Experimenten im Vergleich zu anderen Modellen, wie diejenigen, die Verwendung der Maus sein Genetik. Darüber hinaus gibt es auch Variationen in den Entwicklungsgeschwindigkeiten und Phasen der einzelnen Embryonen, die sich auf die Reproduzierbarkeit und den Erfolg jedes Transplantat trägt. Vogelembryonen sind auch sehr anfällig für Austrocknung und damit wichtige Schritte während der Operation gehören die Einhaltung der Lichtspiegel niedrig, die Zeit unter dem Mikroskop auf ein Minimum, die Eier mit Klebeband so viel wie möglich versiegelt und hoher Luftfeuchtigkeit in der postoperativen Inkubator Austrocknung zu vermeiden. In Bezug auf die Lebensfähigkeit der Chimären, usually zwischen 50-75% überleben, obwohl diese Prozentsätze können je älter die Sammelphase zu verringern. In einem typischen 4-6 h Sitzung der Operation kann ein erfahrener Chirurg 10-15 Chimären zu erzeugen. Der Erfolg der Transplantation hängt auch stark von der Qualität der Werkzeuge. Gute Werkzeuge führen zu konsistenten, reproduzierbaren Ergebnissen. Mit einem Propangasbrenner Wolfram Nadeln machen können extrem scharfen Nadeln gemacht werden. Die Art der Fackel verwendet, macht einen großen Unterschied, weil es die Größe der Flamme kontrolliert. Elektrolyt Schärfen kann auch verwendet werden, aber dieser Ansatz noch nicht einmal nahe kommen Herstellung Nadeln scharf. Verwenden Wolframstäben statt gespult Draht, so daß die Nadeln gerade werden. Die Spemann Mikropipette, während zeitaufwendig und schwierig zu machen, ist ein ideales Instrument für die Gewebetransfer. Die Pipette kann mit verschieden großen Öffnungen angepasst werden, und kann wiederholt verwendet werden. Ein kritischer Faktor für usinga Spemann Mikropipette ist, etwas Flüssigkeit in die Pipette, bevor Sie mit der Spitze an der Oberfläche des Embryos haben. Ein Teil des Fluids immer fließen, wenn der Kontakt mit dem Meniskus über dem Embryo gemacht. Durch Drücken auf die Membran ermöglicht Fluid-und Transplantatgewebe sehr genau ausgestoßen werden, während leicht lassen sich auf der Membran saugt sanft das Spendertransplantat Gewebe in die Pipette. Aufrechterhalten etwas positiver Druck auf die Membran hält das Spendertransplantat Gewebe an der Pipettenspitze während der Übertragung, und ein wenig zusätzlichen Druck auf die Membran erlaubt dem Spendertransplantat Gewebe gezielt in den Host abgegeben werden. Zum Schutz der Spemann-Pipette während der Lagerung und Sterilisation, entfernen Sie die Lampe aus dem breiten Ende und sorgfältig legen Sie die konische Spitze in der Birne. Setzen Sie den Spemann-Pipette in einem Reagenzglas, decken Sie die Oberseite mit Aluminiumfolie und Autoklavieren vor der Operation. Nach mehreren Pipetten sind ready wieder für die Operation sterilisiert werden, kehren die Pipetten, erwärmen sie fast zum Kochen in der gleichen Lösung aus destilliertem Wasser und Glasreinigungsmittel, und dann wiederholt mit destilliertem Wasser spülen. Autoklav Pipetten in ihre einzelnen Rohre. Der Schlauch, der die Membran und Gummidichtung bildet sollte nach mehreren Sterilisationen ersetzt werden, oder wenn sie abgedunkelten und steif werden. Viele der Komponenten dieses Protokoll beinhalten gefährlichen Geräten. Zum Beispiel das Verfahren zur Herstellung einer Mikropipette Spemann beinhaltet drei Arten von Flammen sowie Heizung, Ziehen, Blasen, Biegen, Schneiden und Polieren von Glas. Daher tragen richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA), die die Sicherheit erhöht, wie Schutzbrille und Laborkittel ist kritisch. Darüber hinaus, da viele Menschen leiden, oder haben das Potenzial, sich zu entwickeln, Ei Allergien, immer Handschuhe beim Umgang mit Eiern. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen beachten, die Wachtel-Ente chimären System isa sichere, effiziente und relativ zugängliche Methode, die viele zukünftige Anwendungen hat.

Der Gesichtsschädel entwickelt sich aus dem Wachstum und der Fusion von mehreren Gesichts Prozesse, die der Neuralleiste und mesodermalen Mesenchym von ektodermalen und endodermalen Epithelschichten 1-11 umgeben zusammengesetzt sind. Morphogenetischen Ereignisse innerhalb jedes Prozesses werden durch unterschiedliche Signal Wechselwirkungen zwischen dem Mesenchym und Umgebung Epithelien 12-16 geregelt. Änderungen dieser Signal Wechselwirkungen und / oder ihre Effektoren beitragen, Krankheitsphänotypen und kann auch relevant Entwicklung des kraniofazialen Skeletts 17, 18 sein. Daher Aufklärung der Zeitpunkt und die Art von Gewebe-Wechselwirkungen hat großes Potenzial, unser Verständnis von der Entwicklungs-und Evolutionsbiologie des Gesichtsschädels zu erhöhen. Die Verwendung von chimären Embryonen, Gewebe-Wechselwirkungen hat eine lange Geschichte in der Entwicklungsbiologie. Dieser Ansatz wurde von Hans Spemann und sein Labor Pionierdie embryonalen &quot;Organisatoren&quot; entdeckt durch die Transplantation von Gewebe zwischen Embryonen verschiedener Amphibienarten. Spemann war ein Meister der mikrochirurgischen Techniken, dessen Hand-Fähigkeiten wurden durch seine Entwicklung von Spezialwerkzeugen, insbesondere des Spemann-Pipette ergänzt. Viktor Hamburger war ein Doktorand im Labor von Hans Spemann in Freiburg in den 1920er Jahren, die, wenn die ursprünglichen Transplantation Experimente, die zu Spemann Nobelpreis geführt wurden durchgeführt ist. Beim Hamburger zog nach Washington University in St. Louis im Jahr 1935 detailliert er den Prozess der Herstellung eines Mikropipette Spemann in seinem Handbuch für Experimentelle Embryologie 19. Drew Noden war ein Student der Hamburger Labor an der Washington University, bis 1972. Nachdem er an die University of Massachusetts, Amherst und dann an der Cornell University, Noden weiterhin die Herstellung und Verwendung von Spemann Mikropipetten für seine chirurgische Transplantationen mit Wachtel-Küken Chimären. &amp;# 160;. Während ein Student, einer der Autoren (Rich Schneider) mit Drew Noden 1995-1998 Ausbildung an der Cornell Das folgende Protokoll für die Herstellung einer Mikropipette Spemann auf Beschreibungen von Hamburger und Noden geschrieben wurde, und schließt spätere Änderungen vorgenommen von Schneider. Die Verwendung von Wachtel-Küken Chimären für die Untersuchung der kraniofazialen Entwicklung und vor allem für das Verständnis der Beiträge der Neuralleistenzellen wurde von Noden und Le Douarin in den frühen 1970er Jahren Pionierarbeit geleistet, in Le Douarin et al 20 prüft. Dieser Ansatz wurde im Großen und Ganzen in vielen Studien und von zahlreichen anderen Forschern 1, 4, 5, 21-38 angenommen. Die entsprechenden Wachstumsraten und Morphologie von der Wachtel und Küken machen Transplantationen innerhalb sie ideal für die Untersuchung von Zellschicksals und Abstammung Verfolgung. Wegen der Ähnlichkeiten zwischen Wachtel und Küken, ind jedoch morphologische Veränderungenvon Spenderzellen uced sind schwer zu entziffern. Im Gegensatz dazu haben andere Vogel chimären Systeme Hausente als eine Möglichkeit, Mechanismen, die Embryonen anatomisch unterschiedliche 39-50 zu studieren enthalten. Genauer gesagt, bietet die Wachtel-Ente chimären System mehrere Vorteile für gehobene Ansprüche, die Auswirkungen des Spenders auf dem Host, und umgekehrt. Erstens sind die Wachtel und Entenembryonen in unterschiedlichen Körpergröße und-form, die einen direkten Weg, um Donor-oder Host-spezifische Mechanismen der Musterbildung durch Testen auf Differenz Domänen der Genexpression (Fig. 1 A und B) zu erkunden bietet. Zweitens, Wachtel-und Entenembryonen haben deutlich unterschiedliche Raten der Reifung mit Wachtelbrut in 17 Tagen und Entenbrut in 28 Tagen. Transplantierte Neuralleiste behält seine innere Reifung Rate innerhalb der Host-Umgebung, und somit ist die Identifikation der zeitlichen Veränderungen in der Genexpression, Gewebe-Wechselwirkungen, Histogenese und Morphogenese möglich51-57. Schließlich erlaubt die anti-Wachtelkern Antikörper (Q ¢ PN) Donor und zellulären Wirts Beiträge dauerhaft unterschieden werden voneinander durch Erkennen eines Proteins, die ubiquitär in Wachtel-Zellen exprimiert wird, aber außerhalb des Entenzellen.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s BSS ohne Phenolrot</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Neutralrot</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0,22 &micro; m filtersterilisierte</td></tr><tr><td>18 G Nadeln</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 5 Dumont Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Spemann Pipette</td><td></td><td></td><td>Handgefertigt im Labor</td></tr><tr><td>Eierhalter</td><td></td><td></td><td>Glasaschenbecher und Modelliermasse</td></tr><tr><td>Alkoholbrenner</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>Transparentes Klebeband</td><td>3M Scotch</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Glas Rührstab</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td><td>Spitze wird mit einer Flamme verengt und abgerundet</td></tr><tr><td>Wolframdraht (0,004 x 3 Zoll)</td><td>A-M Systems</td><td>7190</td><td>Spitze ist in einem Propanbrenner flammgeschärft</td></tr><tr><td>Bunsun Brenner</td><td>Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9 Zoll (229 mm)</td></tr><tr><td>Gummischlauch</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>bernsteinfarbener, dünnwandiger Naturkautschuk; Wandstärke: 0,0625 Zoll/1,6 mm; Außendurchmesser: 0,375 Zoll/9,5 mm; ID: 0,25 Zoll/6,4 mm</td></tr><tr><td>Propan-Kraftstoffzylinder</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 mit Brenner "A" mit anschraubbarem Messingbrenner "Bleistiftflamme" Diamond</td></tr><tr><td>Point Bleistift</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>Gummibirnen</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

die beurteilung artspezifische um beiträge craniofacial entwicklung mit wachtel-ente chimären

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Die Erzeugung von Chimären-Embryonen ist eine weit verbreitete und leistungsfähige Ansatz zur Zellschicksale, Gewebe-Wechselwirkungen und Spezies-spezifische Beiträge zur histologischen und morphologischen Entwicklung von Wirbeltierembryonen zu studieren. Insbesondere ist die Verwendung von chimären Embryonen die Bedeutung Neuralleiste in die Leitung der artspezifischen Morphologie des kraniofazialen Komplex hergestellt. Das hier beschriebene Verfahren nutzt zwei Vogelarten, Enten und Wachteln, mit bemerkenswert unterschiedlichen Gesichtsschädelmorphologie. Dieses Verfahren erleichtert die Untersuchung von molekularen und zellulären Regulation der Spezies-spezifische Muster in der kraniofazialen Komplexes. Experimente in der Wachtel-und Enten chimären Embryonen bereits Neuralleiste-vermittelte Wechselwirkungen Gewebe und Zell-autonome Verhaltensweisen, die Spezies-spezifische Muster in der kraniofazialen Skelett, Muskulatur und Hautdecke regulieren enthüllt. Die große Vielfalt der Neuralleiste Derivate schlägt erhebliches Potenzialfür zukünftige Anwendungen der Wachtel-Ente chimären System zum Verständnis der Wirbeltierentwicklung, Krankheit und Evolution.

Vor der weiteren Auswertung muss die Effizienz der Transplantation untersucht werden. Für histologische Analysen morphologische, oder Gen-Expression auf Gewebeproben sollten Wachtelzellen durch Immunhistochemie mit Q ¢ PN Antikörper wie beschrieben 36 erkannt werden. Für die RNA-Analyse kann artspezifischen Beiträge Gewebe von Interesse unter Verwendung einer PCR-basierten Strategie 58 berechnet werden. Nachdem die Wirksamkeit der Transplantation bestätigt wurde, können weitere morphologische oder molekulare Endpunkte in Chimären ausgewertet werden. Wechselwirkungen zwischen den Geber Neuralleistenzellen und Umgebung Wirt stamm Gewebe, die richtige Histogenese und Morphogenese des kraniofazialen Komplex zugrunde liegen zuvor eingehend untersucht worden. Insbesondere Neuralleiste Mesenchym leitet Spezies-spezifische Morphologie des Gesichts 7, 13, 51, 59, 52 Feder-Muster-, Muskel-Muster 56 </s<html> bis&gt; und Knorpel 53, 57 durch die Regulierung der Genexpression Host. Zum Beispiel schreibt Neuralleiste Mesenchym wenn die Knochenformen im Unterkiefer durch zeitliche Regulierung Bmp4 Ausdruck 55. Kürzlich haben Untersuchungen an Gewebe-Wechselwirkungen sehr früh in der Entwicklung auftritt craniofacial zentriert. In diesem Zusammenhang Experimente nutzen Wachtel-Ente Chimären haben gezeigt, Host-Embryonen beeinflussen Neuralleiste Migration durch die Bestimmung morphologische Grenzen. Das heißt, in chimären quck Embryonen, in die Wirtsentenunterkiefer in eine Ente artiges Muster (Abbildung 1D) migrieren Spender Wachtel Neuralleistenzellen. Trotz dieser Host-Beitrag auf die Größe der Neuralleiste Bevölkerung, setzt der Spender Neuralleiste, eine Unterkiefer Skelett, Wachtel-wie in Größe und Form (1E) ist zu generieren. e 1 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Wachtel, Ente Chimäre-System. (A) und Wachtel (B) Ente Schädel zeigen erhebliche Unterschiede in Größe und Form, und somit ideal für die Verwendung eines chimären System kraniofazialen Entwicklung zu studieren geeignet (von Tokia et al. 56 modifiziert). (C) Experimentelles Design zur Erzeugung einseitige chimären quck Embryonen von Stufe abgestimmt HH9.5 Wachtel-und Entenembryonen. Das neuronale Falte von einer Seite der Wachtelembryos entnommen und in Entenembryonen transplantiert nach einem gleichwertigen Teil des neuronalen Falte entfernt wurde. (D) Quail Spenderzellen (grün) in Chimären unter Verwendung eines Anti-Antikörpers Wachtel (Q folgen ¢ PN), wie in der Bauchansicht HH12 chimären Embryo gezeigt. (F) In quck Mandibeln an HH38, die Wachtel Spender abgeleiteten Meckel7, s Knorpel kürzer und gerader als die kontralaterale Ente Wirt stamm Meckel-Knorpel, der größer und gekrümmte beobachtet. Nachdruck Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) mit Genehmigung von Elsevier.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Chimären-Embryonen, die entworfen sind, um die Spezies-spezifische Beiträge der Neuralleiste und / oder anderen Geweben zu testen kraniofazialen Entwicklung zu generieren.

Die Beurteilung artspezifische Um Beiträge Craniofacial Entwicklung mit Wachtel-Ente Chimären

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Kiemenchimären von Wachteln als Mittel zur Untersuchung der Mechanismen zu nutzen, durch die Neuralrohrezellen artspezifische Muster während der kraniofazialen Entwicklung erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Streifen des Neuralrohrs aus dem mittleren und vorderen Bereich des Hinterhirns eines Wachtel-Embryos im Stadium 9,5 präpariert und entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Neuralrohr von der Wachtel-Spendereinheit auf den Enten-Wirteinheit zu übertragen. Der dritte Schritt besteht darin, den entsprechenden Bereich eines Enten-Wirbeltierembryos im Stadium 9,5 zu dissezieren und zu entfernen. Der letzte Schritt ist das Einsetzen der gewundenen Neuralfalte in den mittleren und vorderen Bereich des Nachhirns der Ente. Letztendlich können die resultierenden chimären Embryonen neuralkammvermittelte Veränderungen in der Genexpression mittels in-situ-Hybridisierung identifizieren und auch morphologische Veränderungen durch histologische Analysen aufdecken.Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals, als ich beobachtete, wie Braunpelikane über Ocean Beach in San Francisco flogen. Mir wurde klar, dass die Neuralleiste die Quelle artenspezifischer Muster sein muss, da sie zu den Knochen und Knorpeln ihres langen Schnabelskeletts beiträgt. Obwohl ich keine Eier von Braunpelikanen finden konnte, gelang es mir, Eier von weißen Pekingenten zu beschaffen.Da San Francisco das größte Chinatown außerhalb von Asien hat. Durch die Nutzung der Unterschiede in den Reifungsraten und der Morphologie zwischen Wachteln und Enten. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie zum Beispiel das Verständnis der Ursprünge artspezifischer Muster. Die Operation wird Dr. Jennifer Fish durchführen, eine Postdoktorandin in meinem Labor. Assistiert wird sie von Kate Ovitz, einer Doktorandin. Erhitzen Sie mit einem Bunsenbrenner das schmale Ende einer Pasteurpipette, bis das Glas an der konischen Stelle zu schmelzen beginnt. Entfernen Sie sie aus der Flamme und ziehen Sie die Spitze, bis die Pipette verschlossen ist.Stellen Sie sicher, dass ein Abschnitt des konischen Teils einen Außendurchmesser zwischen 0,7 und einem Millimeter aufweist. Brechen Sie danach das verschlossene Ende etwa vier Zentimeter vom Konus entfernt ab. Befestigen Sie anschließend etwa sechzig Zentimeter Gummischlauch an dem offenen Ende der Pipette und blasen Sie auf das andere Ende. Während des vorsichtigen Aufbringens von Druck durch Anblasen des Schlauchs sollte keine Luft durch die Verbindung oder das andere Ende der Pipette strömen. Verwenden Sie einen Propan-Griffelbrenner, um einen ovalen Bereich auf einer Seite der Pipette direkt unterhalb des Beginns der Verjüngung zu erhitzen. Sobald das Glas sich nach außen zu wellen beginnt, nehmen Sie die Pipette aus der Flamme und blasen vorsichtig durch den Gummischlauch.Dadurch bildet sich im erhitzten Bereich des Glases eine wurstförmige Blase. Zu hoher Druck führt dazu, dass die Glasblase platzt, was vermieden werden sollte. Das resultierende Fenster in der Pipette sollte etwa einen Zentimeter breit und eineinhalb bis zwei Zentimeter lang sein.Richten Sie nun das konische Ende nach oben und kratzen Sie die Blase in einen Glasabfallbehälter, während Sie vorsichtig durch das Schlauchstück blasen, um zu verhindern, dass Glassplitter in die Pipette gelangen. Verbrennen Sie anschließend mit der Propanflamme vorsichtig die verbleibenden Kanten der Blase und glätten Sie die Seiten des offenen Fensters durch Aufflammen. Halten Sie danach den Diamantschneiderlot in vertikaler Position und ritzen Sie mit dem Diamantschneiderlot das konische Ende der Pipette einen Zentimeter vom Beginn der Konizität entfernt ein.Mit einer Pinzette vorsichtig die Pipette an der Markierungslinie abbrechen. Um die Spitze zu entfernen, unter einem Stereomikroskop überprüfen, ob der Bruch sauber und nicht gezackt ist. Die Pipette so halten, wie man einen Bleistift hält, mit dem Zeigefinger über dem offenen Fenster in einem Abstand von etwa 9,5 Millimetern von der Spitze.Weichen Sie das Glas der Pipette auf, indem Sie es neben die Flamme eines Alkoholbrenners halten. Üben Sie mit einer Pinzette Druck auf die Spitze aus, um das schmale Ende der Pipette unter einem Stereomikroskop um 60 Grad nach unten zu biegen. Polieren Sie die Spitze anschließend schnell und vorsichtig mit dem Alkoholbrenner. Die fertige Öffnung sollte abgerundet und frei von Hindernissen sein. Beachten Sie, dass die Spitze verengt und unbrauchbar wird, wenn sie zu lange in die Flamme gehalten wird. Schmieren Sie nun ein 2,5 cm langes Stück Gummischlauch mit 70 % Ethanol ein.Schieben Sie ihn von unten nach oben über den Schaft der Pipette, um das offene Fenster abzudecken. Anschließend setzen Sie eine zwei Milliliter fassende Latexbirne auf das offene Ende der Pipette. Um den Innendruck aufrechtzuerhalten, bereiten Sie zuerst das Wirtsei vor.Schneiden Sie die Vitale-Membran mit einer an der Flamme geschärften Wolframenadel und ziehen Sie die Membran über das Embryo. Versiegeln Sie das Ei anschließend mit Klebeband, wie zuvor beim Spender-Ei. Entfernen Sie das Klebeband vom Fenster des Spender-Eis, um die Neuralfalte aus dem Spenderembryo zu schneiden.Erstellen Sie Einschnitte auf beiden Seiten des Neuralrohrs mit einer an der Flamme geschärften Wolframnadel. Schneiden Sie dann an den gewünschten anterioren und posterioren Ebenen des Transplantats quer durch das Neuralrohr und lösen Sie das Transplantat vorsichtig vom übrigen Neuralrohr. Achten Sie dabei auf besondere anatomische Merkmale wie die Form des Transplantats an der vorderen im Vergleich zur hinteren Seite, um das Spendergewebe korrekt auszurichten.Wenn die Probe im Wirt platziert wird, sicherstellen, dass die Wolframnadel äußerst scharf ist. Schnelle und gezielte Bewegungen verwenden, um das Gewebe vollständig und in einem Stück zu entfernen. Den Neuralwalt aus dem Donorembryo mit einer Schaman-Pipette entfernen. So wenig Flüssigkeit wie möglich ansaugen, da das Gewebe sonst beim Übertragen davonschwimmen könnte.Entfernen Sie nun das Klebeband vom Fenster am Wirtseiblättchen und verwenden Sie die Shaman-Pipette, um den Spender-Neuralwulst neben dem Wirtsembryo in der Nähe des Bereichs des Neuralrohrs zu platzieren, der die Transplantation empfangen soll. Trennen Sie nun den Neuralwulst vom Neuralrohr des Wirtsembryos, wie zuvor beim Spender durchgeführt. Achten Sie darauf, ein Transplantat gleicher Größe wie das Spendertissue zu entnehmen.Schieben Sie das Wirtsgewebe vorsichtig weit vom Embryo weg. Bewegen Sie dann mit einer stumpfen Wolframenadel oder der abgerundeten Spitze einer Mikropipette die Spender-Neuralfalte vorsichtig in den Wirts-Neuralrohr hinein, wobei die korrekte anteriore-posteriore und dorsale-ventrale Ausrichtung beibehalten werden muss. Achten Sie darauf, dass die Transplantat entlang der Seiten eingefügt wird, ohne jedoch die darunterliegenden Gewebe zu verletzen oder zu beschädigen.Steriles Salin soll vorsichtig und sanft auf das Wirtsembryo aufgetragen werden. Falls Anzeichen einer Austrocknung vorliegen, verschließen und beschriften Sie das Ei nun sorgfältig und kehren es sanft in einen Inkubator mit hoher Luftfeuchtigkeit zurück, in dem sich das chimäre Embryo bis zum gewünschten Entwicklungsstadium weiterentwickeln kann. Zur Analyse.Sammeln Sie die chimären Embryonen zur Analyse in frisch hergestelltem kaltem Sarahs Fixansatz. Anschließend sofort über Nacht auf einem Rüttler bei vier Grad Celsius zur Fixierung aufbewahren. Dies ermöglicht einen empfindlicheren Nachweis von Wachtel-Eiern mit dem Anti-Wachtel-Antikörper.Ein weiterer wichtiger Schritt bei Genexpressionsanalysen mittels Echtzeit-quantitativer PCR ist das Einfrieren der Embryonen in flüssigem Stickstoff vor der RNA-Extraktion. Coil- und Entenembryonen weisen erhebliche Unterschiede in Größe und Form auf und eignen sich daher ideal für die Erstellung eines chimären Systems. Um die Entwicklung des kraniofazialen Bereichs bei C zu untersuchen.Insbesondere eignet sich das System zur Untersuchung der Rolle neuraler Krüstzellen. Bei der Musterbildung des Gesichtsskeletts wandern in chimären Quail-Embryonen spendende Quail-neurale Krüstzellen in den mandibulären Bogen des Wirtes Ente. Quail-Spenderzellen in grün sind im ventralen Blick unter Verwendung eines Anti-Quail-Antikörpers in einem Ente-ähnlichen Muster sichtbar.In einem chimären Embryo des Stadiums 12 erzeugt das donorale Neuralleistengewebe ein mandibuläres Skelett, das in Größe und Form wachtähnlich ist. Sobald die Technik beherrscht ist, kann jede Transplantation in etwa fünf Minuten durchgeführt werden. Wird sie länger durchgeführt, als angemessen, setzt man den Embryo einer Austrocknungsgefahr aus, und die Überlebensrate nimmt ab.Während Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, auf Ihre Körperhaltung zu achten, die Schultern zu entspannen und eine gute Handposition beizubehalten. Entwickeln Sie außerdem eine Routine und legen Sie Ihre chirurgischen Instrumente und Reagenzien jedes Mal an denselben Ort, damit Sie Ihre Augen am Mikroskop lassen und Ihre Hände automatisiert bewegen können.

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Biologie

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