Die Beurteilung artspezifische Um Beiträge Craniofacial Entwicklung mit Wachtel-Ente Chimären

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe von Wachtelgang-Chimären die Mechanismen zu untersuchen, durch die neurale Krustenzellen während der kranialen Gesichtsentwicklung speziesspezifische Muster erzeugen. Dazu wird zunächst ein Streifen der Neuralfalte aus der mittleren und vorderen Hinterhirnregion eines Wachtelembryos im Stadium 9,5 präpariert und entfernt. Der zweite Schritt besteht darin, die Neuralfalte des Wachtelspenders auf den Embryo des Entenwirts zu übertragen.

Der dritte Schritt besteht darin, die äquivalente Region eines Entenwirtsembryos im Stadium 9,5 zu präparieren und zu entfernen. Der letzte Schritt besteht darin, die Neuralfalte der Spirale in die Enten-, Mittel- und vordere Hinterhirnregion zu platzieren. Letztendlich können die resultierenden chimären Embryonen durch die Neuralleiste vermittelte Veränderungen der Genexpression durch die C-2-Hybridisierung lokalisieren und auch morphologische Veränderungen durch histologische Analysen aufdecken.

Die Idee zu dieser Methode hatte ich zum ersten Mal, als ich Braune Pelikane über den Ocean Beach in San Francisco fliegen sah. Ich erkannte, dass Neuralleistenzellen die Quelle artspezifischer Muster sein müssen, da sie die Knochen und Knorpel ihres langen Schnabelskeletts hervorbringen. Obwohl ich keine braunen Pelikan-Eier ausfindig machen konnte, konnte ich eine weiße Pekingente finden.

Angesichts der Tatsache, dass San Francisco die größte Chinatown außerhalb Asiens hat, indem die Unterschiede in der Reiferate und Morphologie zwischen Wachteln und Enten ausgenutzt werden. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. das Verständnis der Ursprünge artspezifischer Muster, Die Operation wird von Dr. Jennifer Fish, einer Postdoktorandin, durchgeführt. In meinem Labor wird Kate Ovitz, eine Doktorandin, assistieren. Mit einem Brötchen und einem Brenner erhitzen Sie das schmale Ende einer Pastenpipette, bis das Glas entlang der Verjüngung zu schmelzen beginnt. Nehmen Sie es von der Flamme und ziehen Sie an der Spitze, bis die Pipette verschlossen ist.

Achten Sie darauf, dass ein Teil des konischen Teils einen Außendurchmesser zwischen 0,7 und einem Millimeter hat. Brechen Sie dann das versiegelte Ende etwa vier Zentimeter von der Verjüngung entfernt ab. Befestigen Sie als Nächstes etwa einen Meter Gummischlauch an dem offenen Ende des Pipettenblasens am anderen Ende.

Es sollte keine Luft durch den Anschluss oder das andere Ende der Pipette strömen, während durch Blasen auf den Schlauch sanfter Druck ausgeübt wird. Verwenden Sie einen Propanstift und einen Flammenbrenner, um einen ovalen Bereich auf einer Seite der Pipette direkt unter dem Anfang des Kegels zu erhitzen. Sobald das Glas anfängt, sich nach außen zu knicken, nehmen Sie die Pipette von der Flamme und blasen Sie vorsichtig durch den Gummischlauch

Dies führt dazu, dass der erhitzte Teil des Glases eine wurstförmige Blase bildet. Zu viel Druck führt dazu, dass die Glasblase platzt, was vermieden werden sollte. Das resultierende Fenster in der Pipette sollte etwa einen Zentimeter breit und eineinhalb bis zwei Zentimeter lang sein.

Richten Sie nun das spitz zulaufende Ende nach oben und kratzen Sie die Blase in einen Glasabfallbehälter, während Sie vorsichtig durch den Schlauch blasen, um zu verhindern, dass Glassplitter in die Pipette gelangen. Brennen Sie dann mit der Propanflamme vorsichtig die restlichen Ränder der Blase ab und polieren Sie die Seiten des offenen Fensters. Halten Sie als Nächstes den Diamantstift in einer vertikalen Position und ritzen Sie mit einem Diamantstift das sich verjüngende Ende der Pipette einen Zentimeter vom Anfang des Kegels entfernt ein.

Brechen Sie die Pipette vorsichtig mit einer Pinzette an der eingekerbten Linie. Um die Spitze zu entfernen, überprüfen Sie unter einem Präpariermikroskop, ob der Bruch sauber und nicht gezackt ist. Halten Sie die Pipette so, als würde man einen Bleistift mit dem Zeigefinger in einem Abstand von etwa 9,5 Millimetern von der Spitze über das offene Fenster halten.

Halten Sie das Glas an der Pipette weich, indem Sie es an den Rand der Flamme eines Alkoholbrenners halten. Üben Sie mit einer Pinzette Druck auf die Spitze aus, um das schmale Ende der Pipette in einem 60-Grad-Winkel unter einem Präparierfernrohr nach unten zu biegen. Schnell und vorsichtig die Spitze mit dem Alkoholbrenner feuerpoliert.

Die fertige Öffnung sollte abgerundet und frei sein. Beachten Sie, dass die Spitze eingeengt und unbrauchbar wird, wenn sie zu lange in der Flamme gehalten wird. Schmieren Sie nun einen 2,5 Zentimeter langen Gummischlauch mit 70% Ethanol.

Schieben Sie es von unten nach oben über den Schaft der Pipette, um das offene Fenster abzudecken. Setze dann eine zwei Milliliter Latexbirne auf das offene Ende der Pipette. Um den internen Luftdruck aufrechtzuerhalten, bereiten Sie zuerst das Wirtseih vor.

Schneiden Sie die Vitale-Membran mit einer flammgeschärften Wolframnadel ab und ziehen Sie die Membran über den Embryo. Verschließen Sie dann die Eizelle wieder mit Klebeband, wie es bei der Spendereizelle der Fall war. Entfernen Sie das Klebeband vom Fenster an der Spenderei, um die Neuralfalte vom Spenderembryo abzuschneiden.

Machen Sie mit einer flammengeschärften Wolframnadel Schlitze auf beiden Seiten des Neuralrohrs. Schneiden Sie dann das Neuralrohr auf der gewünschten vorderen und hinteren Ebene des Transplantats durch und toupieren Sie das Transplantat vom Rest des Neuralrohrs getrennt. Achten Sie auf besondere anatomische Details wie die vordere und hintere Form des Transplantats, die das Spendergewebe richtig ausrichten sollen.

Wenn Sie sie in den Host einsetzen, stellen Sie sicher, dass die Wolframnadel extrem scharf ist. Verwenden Sie schnelle und bewusste Striche, um das Gewebe vollständig und in einem Stück zu entfernen. Entfernen Sie die Neuralfalte mit einer Schamanenpipette vom Spenderembryo. Ziehen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich auf, sonst könnte das Gewebe beim Transfer wegschwimmen.

Entfernen Sie nun das Klebeband aus dem Fenster an der Wirteizelle und platzieren Sie mit der Schamanenpipette die gespendete Neuralfalte neben dem Wirtsembryo neben der Region des Neuralrohrs, die das Transplantat erhalten wird. Trennen Sie nun die Neuralfalte vom Neuralrohr des Wirtsembryos, wie es bei der Spenderin gemacht wurde. Achten Sie darauf, ein Transplantat zu entfernen, das genauso groß ist wie das Spendergewebe.

Schieben Sie dieses Wirtsgewebe vorsichtig weit vom Embryo weg. Bewegen Sie dann mit einer stumpfen Wolframnadel oder der abgerundeten Spitze einer Mikropipette die Donor-Neuralfalte vorsichtig in das Neuralrohr des Wirts, wobei Sie die richtige vordere posteriore und dorsale ventrale Ausrichtung beibehalten. Achte darauf, dass das Transplantat an den Seiten eingesteckt ist, aber achte darauf, dass du nicht in das darunter liegende Gewebe stichst oder es beschädigst.

Sterile Kochsalzlösung sollte vorsichtig und sanft auf den Wirtsembryo aufgetragen werden. Wenn es Anzeichen von Austrocknung gibt, verschließen und etikettieren Sie das Ei nun vorsichtig wieder und legen Sie es vorsichtig in einen Inkubator mit hoher Luftfeuchtigkeit, wo sich der chimäre Embryo bis zum gewünschten Stadium entwickeln kann. Zur Analyse.

Sammeln Sie für die Analyse die chimären Embryonen in frisch hergestelltem kaltem Sarah-Fixiermittel. Legen Sie sie dann sofort bei vier Grad Celsius auf eine Wippe für eine Fixierung über Nacht. Dies ermöglicht einen empfindlicheren Nachweis von Wachteleiern mit dem Anti-Wachtel-Antikörper.

Ein weiterer wichtiger Schritt für Genexpressionsanalysen mittels quantitativer Echtzeit-PCR ist das Einfrieren der Embryonen und des flüssigen Stickstoffs vor der RNA. Extraktionsspiralen und Enten weisen erhebliche Unterschiede in Größe und Form auf, so dass ihre Embryonen ideal für die Herstellung eines chimären Systems geeignet sind. Zur Untersuchung der kraniofazialen Entwicklung von C.

Insbesondere ist das System nützlich, um die Rolle von Neuralleistenzellen zu untersuchen. Bei der Musterung des Gesichtsskeletts in der chimären qua Embryo-Spenderwachtel wandern Neuralleistenzellen in den Unterkieferbogen der Wirtente. In einem entenartigen Muster sind Wachtelspenderzellen in grün mit einem Anti-Wachtel-Antikörper aus der ventralen Ansicht betrachtet.

In einem chimären Embryo im Stadium 12 erzeugt die Donor-Neuralleiste ein Unterkieferskelett, das in Größe und Form wachtelartig ist. Einmal gemeistert, kann jede Transplantation in etwa fünf Minuten durchgeführt werden. Wenn es länger richtig gemacht wird, besteht für den Embryo das Risiko, dass er austrocknet, und die Überlebensrate sinkt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich Ihrer Haltung bewusst zu sein, Ihre Schultern zu entspannen und eine gute Handhaltung beizubehalten. Entwickeln Sie außerdem eine Routine und platzieren Sie Ihre chirurgischen Instrumente und Reagenzien jedes Mal an der gleichen Stelle, damit Sie Ihre Augen im Mikroskop halten und Ihre Hände automatisiert bewegen können.