Name: Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung embryonaler Gewebe aus Wachtel- und Hühnerembryonen für Genexpressionsstudien. Diese Mikrochirurgie-Methode ermöglicht hochauflösende funktionelle Analysen in der Entwicklungsbiologie.

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Die Autoren sind dankbar für die kritische Lektüre des Manuskripts, Isabel Alcobia Mário Henriques für video Erzählung und Vitor Proa aus der Histologie-Service des Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa Universidade de Lisboa, für den technischen Support. Wir sind insbesondere verpflichtet, Paulo Caeiro und Hugo Silva aus Unidade de Audiovisuais (Referat audiovisuelle Medien), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa für ihr herausragendes Engagement für die Produktion von diesem Video. Wir anerkennen Leica Microsystems freundlicherweise dafür ein Stereoskop, ausgestattet mit einem Videosystem und Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. für den Beitrag mit Wachteln Eier befruchtet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Alle diese Experimente zu folgen, die Pflege der Tiere und ethischen Richtlinien des Centro Académico de Medicina de Lisboa.
(1) befruchtet Wachteln und Huhn-Ei-Inkubation
<ol><li>Ort befruchtete Eier von der japanischen Wachtel (Coturnix Coturnix Japonica) in einem befeuchteten Inkubator von 38 ° C für 3 Tage. Brüten Sie die Eier (Ei stumpfen Ende) nach oben in die Luftkammer. Hinweis: Die feuchte Umgebung wird erreicht, indem ein Wasserbehälter an der Unterseite des Inkubators.</li>
	<li>Inkubieren Sie befruchtete Eier Huhn (Gallus Gallus) für 2,5 Tage in einem befeuchteten Inkubator von 38 ° C. Brüten Sie die Eier in eine horizontale Position und markieren Sie die Oberseite mit einem Stück Holzkohle um die Embryo-Standort zu ermitteln. Hinweis: Beginnen Sie mit 40 Wachteleier und 60 Hühnereier Festlegung dieses Experiment.</li>
</ol>2. Isolierung der Wachtel Entoderm, enthält die zukünftige Domain Zebrafischembryonen rudiment
Hinweis: Verwenden Sie eine horizontale Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien für Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen.
<ol><li>Die embryonale Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen Rudiment entfernen, die pharyngealen Bogen Region mit 3rd und 4th Bögen (3/4PAR), wie beschrieben7,8.<ol>
<li>Füllen Sie eine große Borosilikat Glasschüssel (100 x 50 mm; 100 cm3) mit 60 mL kalte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Tippen Sie mit Hilfe der gebogenen Schere auf und schneiden Sie ein kreisrundes Loch in der Schale eine Wachtel Ei, das für 3 Tage inkubiert worden. Machen Sie das Loch auf der gegenüberliegenden Seite des Eies stumpf und übertragen Sie das Eigelb (mit dem Embryo) in die Schüssel mit kaltem PBS zu.</li>
		<li>Entfernen Sie den Embryo aus dem Dotter durch die Dotterhäutchen Membran extern zu extraembryonalen Schiffe mit einer gebogenen Schere schneiden.</li>
		<li>Mit Hilfe von dünnen Zange Transfer des Embryos in einer kleinen Schüssel (60 x 30 mm; 15 cm3) mit 10 mL kaltem PBS gefüllt.</li>
		<li>Mit einem Schaumlöffel, bewegen den Embryo mit einem 100 mm Petrischale mit einem schwarzen Sockel (siehe Tabelle der Materialien), enthält 10 mL kaltem PBS und legen Sie es unter einem Stereomikroskop.</li>
		<li>3/4PAR, wie zuvor beschrieben8zu sezieren.</li>
		<li>Aspirat 3/4PAR und Transfer in eine Glasschale drei Viertel mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterile Pasteurpipette gefüllt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Entoderm mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen Rudiment (3/4PP Entoderm) durch enzymatische Verdauung mit Pankreatin zu isolieren.<ol>
<li>Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange Transfer 3/4PAR in einer Glasschale drei Viertel mit kalten Pankreatin (8 mg/mL; 1:3-Verdünnung von 25 mg/mL mit kaltem PBS) gefüllt.</li>
		<li>1 h auf dem Eis für die enzymatische Verdauung inkubieren. Hinweis: Die Zeit der enzymatischen Verdauung hängt von der Phase der Entwicklung (Tabelle 1).</li>
		<li>Legen Sie die Glasschale unter dem Stereomikroskop (40 x-60 X Vergrößerung), das Entoderm aus 3/4PAR zu isolieren. Hinweis: Halten Sie alle Flächen und Lösungen kalt während dieses Vorgangs. In einer neuen kalten Pankreatin-Lösung ändern, wenn sehr lange, das Gewebe zu zergliedern (> 15 min). Als eine Lichtquelle verwenden Sie LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast.</li>
		<li>Um das Entoderm aus dem umliegenden Gewebe zu isolieren, verwenden Sie zwei Edelstahl-Microscalpels in Pin-Halter. Hinweis: Verwenden Sie Microscalpels mit einem Durchmesser zwischen 0,1 mm und 0,2 mm und Nickel-Pin-Halter mit einem Kiefer Öffnung von 0 mm bis 1 mm Durchmesser.<ol>
<li>Entfernen Sie zuerst das Neuralrohr und Mesoderm an der dorsalen Oberfläche des pharyngealen Entoderm befestigt.</li>
			<li>Mit der dorsalen Seite nach oben vorsichtig lösen Sie und entfernen Sie das Mesenchym zwischen den Rachenraum Bögen und setzen Sie der pharyngealen Beutel. Führen Sie dieses Verfahren auf beiden Seiten 3/4PAR.</li>
			<li>Entfernen Sie das Herz Rohr und das Mesenchym rund um den vorderen Taschen.</li>
			<li>Schneiden Sie mit der ventralen Seite nach oben dem Ektoderm der 2Nd und 3rd pharyngealen Bögen und entfernen Sie vorsichtig das Mesenchym der Beutel befestigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der anderen Seite 3/4PAR. In dieser Phase sollte die Schilddrüse Rudiment sichtbar sein.</li>
			<li>Entfernen Sie alle verbleibenden mesenchymalen Zellen an der pharyngealen Entoderm mit zwei Microscalpels befestigt.</li>
			<li>Machen Sie einen transversalen Schnitt zwischen den 2Nd und 3rd PP, Wehre die pharyngealen Entoderm, enthält 3rd und 4th Beutel aus dem vorderen Teil des das Entoderm, die Schilddrüse Rudiment und 2nd pharyngealen Beutel.</li>
			<li>Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange isoliert 3/4PP Entoderm Transfer in eine Glasschale drei Viertel mit 100 % kalt fetalen bovine Serum (FBS) gefüllt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Halten Sie die Glasschale mit den isolierten Geweben auf Eis während der Vorbereitung der in-vitro-Assay. Alternativ die isolierte Gewebe dreidimensional erhalten werden können und in-situ auf Genexpression analysiert.</li>
</ol>3. Isolation von Huhn Somatopleura mesoderm
Hinweis: Führen Sie Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien.
<ol><li>Entfernen Sie die embryonale Territorium mit der Somatopleura Mesoderm auf der Ebene der Somiten 19-24 (19-24).<ol>
<li>Entfernen Sie das Huhn-Ei aus dem Inkubator, nach 2,5 Tagen Inkubationszeit.</li>
		<li>Öffnen Sie mit einer gebogenen Schere ein kleines Loch in der Schale. Legen Sie eine Nadel und aspirieren Sie 2 mL Albumin mit einer 10 mL Spritze, Albumin Lautstärke innerhalb des Eies und Beschädigung des Embryos (befindet sich unter den markierten Bereich der Schale). Entsorgen Sie die angesaugte Albumin.</li>
		<li>Schneiden Sie eine kreisförmige Bohrung (bis zu zwei Drittel der oberen Fläche) in den markierten Bereich der Schale mit einer gebogenen Schere.</li>
		<li>Schneiden Sie die Dotterhäutchen Membran nach außen zu den extraembryonic Gefäßen während Sie den Embryo mit dünnen Zange halten.</li>
		<li>Legen Sie unter einem Stereomikroskop den Embryo in einem 100 mm Petrischale mit einem schwarzen Sockel mit 10 mL kaltem PBS. Hinweis: Verwenden Sie ein Stereomikroskop von diesem Punkt vorwärts für progressive Vergrößerung der Mikrochirurgie Verfahren.</li>
		<li>Verwenden Sie vier dünne Insekten Pins des Embryos an der Unterseite der Platte zu halten. Legen Sie die Stifte in den extraembryonic Region bilden eine quadratische Form.</li>
		<li>Durchführen Sie zwei Einschnitte zwischen den Somiten 19 und 24 quer zur Achse Embryo und überschreiten alle Embryo-Gebiet, mit einer Schere Wecker Auge.</li>
		<li>Lösen Sie Abschnitt Embryo, 19-24, indem marginal embryonalen Kanten schneiden.</li>
		<li>Absaugen der 19-24 Gewebe und Transfer in eine Glasschale drei Viertel gefüllt mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterilen Pasteurpipette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolieren Sie die seitlichen Mesoderm aus Somatopleura Region (19-24) durch enzymatische Verdauung mit Pankreatin (8 mg/mL; 1:3-Verdünnung von 25 mg/mL mit kaltem PBS).<ol>
<li>Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange, Übertragung Schale 19-24-Gewebe zu einem Glas drei Viertel gefüllt mit kaltem Pankreatin Lösung.</li>
		<li>30 min auf Eis für die enzymatische Verdauung inkubieren.</li>
		<li>Isolieren Sie unter dem Stereomikroskop das Mesoderm aus dem umliegenden Gewebe mit zwei Microscalpels in einer Halterung. Hinweis: Halten Sie alle Flächen und Lösungen kalt während dieses Vorgangs. In einer neuen kalten Pankreatin-Lösung ändern, wenn sehr lange, das Gewebe zu zergliedern (> 10 min.). Als eine Lichtquelle verwenden Sie LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast.</li>
		<li>Während Mesoderm Isolierung entfernen Sie zunächst das Ektoderm an der Oberfläche, gefolgt von der sorgfältigen Ablösung der ventral befindet sich Splancnopleura Gewebe.</li>
		<li>Lassen Sie das rechten seitliche Mesoderm der Somatopleura durch Schneiden in einer parallelen Bewegung auf das Neuralrohr.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Mesoderm Trennung von der linken Seite des Embryos. Hinweis: Achten Sie Microscalpel Bewegungen während dieses Vorgangs zu verlangsamen. Die exponierten extrazellulären Matrixproteine halten Sie sich an Gewebe und Instrumente fließende Bewegungen zu verhindern.</li>
		<li>Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange Übertragung der isolierten Mesoderm in einer Glasschale drei Viertel mit kalten FBS gefüllt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Halten Sie die Glasschale mit den isolierten Geweben auf Eis während der Vorbereitung der in-vitro-Assay.</li>
</ol>4. In-vitro- organotypischen Assay: artfremden Verband der Wachtel 3/4PP Entoderm und Huhn Somatopleura Mesoderm
<ol><li>Bereiten Sie das Kulturmedium mit RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Pen/Strep3,5ergänzt.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Metallgitter in einem 35 mm Petrischale mit 5 mL Kulturmedium. Hinweis: Entfernen Sie das überschüssige Flüssigkeit, die mittlere Fläche mit dem oberen Rand des Rasters zu ebnen.</li>
	<li>Tauchen Sie mit Hilfe von dünnen Pinzette ein Membranfilter in das Kulturmedium ein und dann legen Sie es oben auf das Gitter zu einer Oberfläche in Kontakt mit Luft haben. Hinweis: Ein Viertel der Membranfläche (mit 13 mm Durchmesser) ist ausreichend für die Gewebe-Association.</li>
	<li>Assoziieren Sie unter dem Stereomikroskop die isolierte Gewebe an der Oberseite der Membranfilter. Zuerst das 3/4PP Entoderm (Schritt 2) aus der Glasschale zu übertragen, indem Sie sanft mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die isolierte Mesoderm (Schritt 3). Hinweis: Mit Hilfe eines Microscalpel, mischen Sie das Gewebe um die Assoziation zu maximieren.</li>
	<li>Legen Sie vorsichtig die damit verbundenen Gewebe in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 48 h. kultivierten Gewebe auf chorioallantoic Membrane (CAM) verpflanzt werden können. Hinweis: Ektopische Orgel Formation in der CAM war zuvor detaillierte8.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
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<li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das embryonale Gewebe isoliert Verfahren hier detailliert wurde aus früheren Techniken herstellen Wachtel-Hühnerembryos Chimären in verschiedenen biologischen Zusammenhängen3,5,6verbessert.
Dieser Ansatz eignet sich für reine embryonalen Gewebe ohne Genmanipulation oder die Verwendung von Gewebe-spezifische Marker, die sind oft unbestimmt, Begrenzung der Verwendung von gentechnisch veränderten Tiermod...

In den frühen 1970er Jahren entwickelte sich eine elegante Wachtel-Huhn-Chimäre-System von Le Douarin, öffnen neue Wege um zu verstehen, die Rolle der Zellwanderung und zellulären Interaktionen während der Entwicklung1,2. Das Modell wurde unter der Prämisse entwickelt, dass Zelle Austausch zwischen den beiden Arten Embryogenese, später bestätigt, wenn verwendet, um die zahlreichen Entwicklungsprozesse, einschließlich die Bildung des Nervensystems und der hämatopoetischen studieren nicht erheblich stören würde Systeme1. Wobei letzteres als Vorbild, die zyklischen Wellen der hämatopoetischen Vorläuferzellen besiedeln die Zebrafischembryonen epithelialen Rudiment wurde erstmals beobachtet mit Hilfe der Wachtel-Huhn Chimäre System3. Dafür war das prospektive Gebiet des Thymus, das Entoderm des dritten und vierten pharyngealen Beutel (3/4PP), in 15 bis 30 - Somiten Stadium [embryonalen Tag (E) 1,5-E2.5] mechanisch und enzymatisch von Wachteln (Q) Embryonen isoliert. Diese Stufen entsprechen Huhn Hamburger und Hamilton4 (HH) - Stufen 12-17. Die Isolierungsmaßnahmen begann mit dem Einsatz von Trypsin enzymatisch das Entoderm aus der beigefügten Mesenchym distanzieren. Das isolierte Entoderm wurde in der Somatopleura Region eines Host Huhn (c) Embryos bei E3-3,5 (HH-Stufen 20-21) veredelt. Diese heterologen Mesenchym galt "permissive" Zebrafischembryonen Epithel Entwicklung tragen auch zur Orgel Formation3. Danach infiltriert aufeinanderfolgende Wellen Huhn Host Blut übertragbare Vorläuferzellen der Wachtel Spender Zebrafischembryonen epithelialen Gegenstück zur Thymus-Bildung in der Host-Embryo-3.
Vor kurzem wurde eine modifizierte Version dieses Ansatzes als auch wichtig für das Studium epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung5erwiesen. In dieser Hinsicht waren beteiligt an der Gründung des ektopische Thymus Chimäre Embryonen3 Gewebe isoliert, beide aus Spender und Host Embryonen und ex Vivo verbunden. Eine verbesserte Protokoll wurde verwendet, um die Wachteln 3/4PP Entoderm (E2.5-E3) und das Huhn Somatopleura Mesoderm (E2.5-E3) zu isolieren. Kurz, wurden embryonale Gewebe isoliert durch Mikrochirurgie und nach Maßgabe der in-vitro-Pankreatin Verdauung. Außerdem wurden die Bedingungen der enzymatischen Verdauung, Temperatur und Zeit der Inkubation nach Gewebetyp und Entwicklungsstadium (Tabelle 1) optimiert.
Als nächstes wurden isolierte Gewebe in ein organotypischen in Vitro System für 48 h, wie bereits berichtet5,6verbunden. Der in-vitro-Verband der Gewebe imitiert die lokalen zellulären Interaktionen im Embryo, einige Einschränkungen der in-vivo Manipulation zu überwinden. Dieses System ist besonders nützlich, um zelluläre Interaktionen in komplexen morphogenen Ereignisse, z. B. die Entwicklung der pharyngealen Vorrichtung zu untersuchen.
Der Beitrag der einzelnen Gewebe im Thymus Histogenese, sowie die Fähigkeit des Vereins artfremden eine Thymus generieren kann weiter erforscht mit Hilfe der CAM-Methodik, zuvor detaillierte5,7,8. Kurz und bündig, waren die kultivierten Gewebe aufgepfropft CAM cE8 Embryonen und erlaubt, in Ovo für 10 Tage zu entwickeln. Dann wurde Thymus Bildung durch morphologische Analyse in der geernteten Explantaten bewertet. Wie in den Altertumswissenschaften Wachtel-Huhn3wurde der Wachtel Zebrafischembryonen Epithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) abgeleitet vom Huhn Embryo, die später gezeigt wurde, beitragen zur Orgel Entwicklung9,10 besiedelt. . Die HPCs migriert vom Embryo, ektopische Chimären Thymus bis stark vaskularisierte CAM5,7,,8. Wachtel abgeleiteten Zebrafischembryonen Epithel von Immunohistochemistry mit Spezies-spezifische Antikörper (d. h. QCPN - MAb Wachtel Perinukleäre), Überwindung der Notwendigkeit einer Gewebe-spezifische molekulare Marker identifiziert werden kann.
Diese experimentelle Methode ermöglicht als die zweistufigen Ansatz in früheren Veröffentlichung8, berichtet die Modulation der Signalwege durch regelmäßige Gabe von pharmakologischen Wirkstoffen bei in-vitro- und in Ovo Entwicklung. Explantaten können auch zu jedem Zeitpunkt des Kurses der Experiment8geerntet werden.
Schließlich ermöglicht die Isolierung Protokoll hier detailliert die Erhaltung der natürlichen Eigenschaften und 3D-Architektur der embryonalen Gewebe, besonders nützlich für die Detaillierung in-situ-gen-Expressionsmuster von embryonalen Territorien ansonsten unzugänglich durch konventionelle Methoden. Transkriptom-Analyse-Ansätze, einschließlich RNA-Seq oder Microarrays, können darüber hinaus auch in isolierten Geweben ohne genetische Marker und bietet gleichzeitig eine gewebespezifische Hochdurchsatz "Omics" Analyse angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Mit Hühnern befruchtete Eier (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Geflügelzucht&nbsp;</td></tr><tr><td>Mit Wachteln befruchtete Eier (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Vogelfarm&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm Pyrexschalen</td><td>Duran Gruppe</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm Pyrexschalen</td><td>Duran Gruppe</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Metallgitter</td><td>Goodfellows</td><td></td><td>feinmaschiges Edelstahlgitter</td></tr><tr><td>Membranfilter</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Isopore Membranfilter</td></tr><tr><td>Petrischale, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60 x 30 mm Pyrex-Schalen (kleine Größe)</td><td></td><td></td> <td>aus dem Supermarkt&nbsp;</td></tr><tr><td>100 x 50 mm Pyrex-Schalen (Großformat)</td><td></td><td></td><td>aus dem Supermarkt&nbsp;</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL Kunststoffpipette</td></tr><tr><td>Glaspasteurpipette</td><td>Normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Durchsichtiges Kunststoffband</td><td></td><td></td><td>aus dem Supermarkt&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytokeratin (pan; sauer und basisch, Typ I und II Cytokeratine), Klon Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standard FBS</td></tr><tr><td>Pankreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3292</td><td>Bereiten Sie eine Lösung von 25 mg/ml gemäß den Anweisungen des Herstellers vor; zentrifugieren und filtrieren Sie sie vor dem Aliquotieren und lagern Sie sie bei -20 °C. Aliquote können eingefroren aufbewahrt werden mehrere Jahre.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN</td><td>Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Ergänzung&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silikonelastomer 1,1Kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Zur Vorbereitung der hinteren Basis für die Petrischale</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>Dünne Pinzette</td></tr><tr><td>Extra feine Bonn Schere, gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Gebogene Schere</td></tr><tr><td>Insektenstifte&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td>0,3 mm Edelstahlstift</td></tr><tr><td>Mikrospachtel&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Transplantationslöffel</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>0,2 mm Mikroskalpell aus Edelstahl</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0,1 mm Mikroskalpell</td></tr><tr><td>aus Edelstahl Moria Vernickelter Stifthalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Vernickelter Stifthalter</td></tr><tr><td>Moria Perforierter Löffel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Abschäumer</td></tr><tr><td>Wecker Augenschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>MC170 HD-Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer&nbsp; S360 Digital&nbsp; Scanner für Objektträger&nbsp;</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C13220-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung der embryonalen gewebe und die bildung von wachteln-huhn chimären organe thymus am beispiel

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

Die Fähigkeit zur embryonalen Gewebe isolieren war ein wesentlicher Schritt für die Gründung der Wachtel-Huhn Chimera-System, das wiederum unbestritten Beiträge zur Enthüllung Schlüsselprozesse in der Entwicklungsbiologie zur Verfügung gestellt hat.
Hierin ist eine optimierte Methode um embryonale Gewebe von Wachteln und Hühner durch Mikrochirurgie und enzymatische Verdauung unter Beibehaltung seiner biologischen Eigenschaften zu isolieren beschrieben. Nach Isolierung sind Gewebe aus beiden Arten in einem in-vitro-organotypischen Assay für 48 h. Wachtel und Huhn Gewebe können durch unterschiedliche Kernmerkmale und molekulare Marker ermöglicht die Untersuchung der zellulären Übersprechen zwischen diskriminiert werden artfremden Verband der Gewebe. Dieser Ansatz ist daher ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung komplexer Gewebe Wechselwirkungen in Entwicklungsprozessen mit hochdynamischen räumliche Änderungen, wie die auftretenden pharyngealen Morphogenese und die Bildung von der foregut Entoderm abgeleitet Organe. Dieser Versuchsansatz wurde zuerst entwickelt, um die epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung zu untersuchen. In diesem, das Entoderm abgeleitet prospektive Zebrafischembryonen Rudiment und Mesoderm abgeleitet Mesenchym waren bzw. von Wachteln und Hühner-Embryonen, isoliert.
Die Kapazität der damit verbundenen Gewebe, Organe zu generieren kann weiter durch Pfropfung sie auf chorioallantoic Membrane (CAM) von einem Huhn Embryo getestet werden. Die CAM liefert Nährstoffe und Gasaustausch der explantierten Gewebe ermöglicht. Nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung können die Chimäre Organe in der geernteten Explantaten morphologische konventionell analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht auch studieren gewebespezifischen Beiträge während Orgel-Formation, von seiner ersten Entwicklung (in vitro) in der Endphase der Organogenese (bei Ovo-Entwicklung).
Schließlich bietet die verbesserte Isolation-Methode auch dreidimensional (3D) erhalten embryonalen Gewebe, das auch für hochauflösende topografische Analyse der gewebespezifischer Genexpression Muster verwendet werden können.

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Vogelgrippe embryonalen Gewebe in verschiedene Zell- und Entwicklungsbiologie Biologie technische Ansätze zu verwendenden isolieren. Diese Methode wurde früher eingesetzt, um epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung5zu untersuchen. Hier werden neue Ergebnisse in Abbildung 1 und Abbildung 2, mit ähnlichen Ansätzen dargeste...

Dieser Artikel enthält eine Methode, um reine embryonalen Gewebe von Wachteln und Hühner-Embryonen zu isolieren, die kombiniert werden können, um ex Vivo Chimären Organe.

Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen optimierten experimentellen Ansatz zur Isolierung embryonalen Gewebes von wachtelnden und Hühnerembryonen zu präsentieren. Mit dieser Technik erhalten wir reines embryonales Gewebe, das in Genexpressionsstudien und funktionellen Assays verwendet werden kann. Gewebe aus Wachtel- und Hühnerembryonen werden durch Mikrochirurgie isoliert und unterliegen der in vitro enzymatischen Verdauung unter Beibehaltung ihrer biologischen Eigenschaften.Nach der Isolierung können die dreidimensionalen konservierten Gewebe für die analyse der topografischen Genexpressionsmuster mit hoher Auflösung verwendet werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Detaillierung der In-situ-Genexpression in embryonalen Gebieten, die sonst mit herkömmlichen Methoden nicht zugänglich sind. Darüber hinaus können Transkriptomanalyseansätze auch in isolierten Geweben angewendet werden, ohne dass genetische Marker erforderlich sind, während gleichzeitig eine gewebespezifische omische Analyse mit hohem Durchsatz durchgeführt wird.Alternativ können die isolierten Gewebe beider Arten 48 Stunden lang in einem in vitro organotypischen Assay assoziiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es, Gewebewechselwirkungen zu untersuchen, da Wachtel- und Hühnerzellen durch unterschiedliche kerntechnische Merkmale und molekulare Marker diskriminiert werden können. Die Fähigkeit des Kulturgewebes, Organe zu bilden, kann durch ovo assay weiter getestet werden.Diese Methode ist daher ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung komplexer Gewebeinteraktionen in Entwicklungsprozessen mit hochdynamischen räumlichen Modifikationen und kann auch dazu beitragen, das Potenzial bestimmter embryonaler Gebiete für die Bildung von Organen aufzuzeigen. Als Beispiel wird hierin die Bildung von Wachtelhuhn-chimärem Thymus aus isolierten embryonalen Geweben beschrieben. Erstens, das Endoderm des dritten und vierten Pharyngealbeutels, wird das prospektive thymische Rudiment aus der Rachenregion der Wachtelembryonen mit drei Tagen Entwicklung isoliert.Dann wird dieses Gewebe mit einem Mesenchym assoziiert, das seine Entwicklung unterstützen kann, das Somatopleura-Mesoderm. Schließlich wird die heterospezifische Assoziation von Geweben in vitro und in ovo zu einem chimaherthymus kultiviert. Führen Sie alle Eimanipulationsverfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen laminaren Durchflusshaube und sterilisierten Instrumenten und Materialien durch.Befruchtete Wachteleier wurden mit nach oben gerichteter Luftkammer inkubiert. Um zu beginnen, entfernen Sie die Wachteleier aus dem Brutkasten. Bereiten Sie eine große Borosilikat-Glasschüssel mit kaltem PBS gefüllt.Mit gebogener Schere ein kreisförmiges Loch in die Schale eines Wachtelei mit drei Tagen Inkubation tippen und schneiden. Machen Sie das Loch in der gegenüberliegenden Seite des Eis stumpf, und übertragen Sie das Eigelb auf die Schüssel mit kalten PBS. Entfernen Sie den Embryo aus dem Eigelb, indem Sie die Vitelline-Membran extern in extraembryonale Gefäße schneiden.Mit Hilfe von dünnen Zangen, übertragen Sie den Embryo in eine kleine Schüssel mit kalten PBS gefüllt, dann bewegen Sie den Embryo auf eine Petrischale mit schwarzer Basis mit einem Abschäumer. Entfernen Sie den Pharyngealbereich, der den dritten und vierten Pharyngealbeutel enthält, wie in der vorherigen Jove SPA Ligation beschrieben. Dann übertragen Sie den dritten und vierten Rachenbogenbereich in ein Glas, das mit kaltem Pankreatin gefüllt ist und eine Stunde lang auf Eis zur enzymatischen Verdauung brüten.Beachten Sie, dass die Inkubationszeit der enzymatischen Verdauung vom Entwicklungsstadium abhängt. Legen Sie die Glasschale unter das Stereomikroskop und isolieren Sie das Endoderm aus dem dritten und vierten Rachenbogenbereich, indem Sie zwei Mikroskalpell in einem Halter verwenden. Stellen Sie zunächst den Pharyngealbereich mit der Dorsalseite nach oben, der intern das Endoderm und das Ektoderm in der äußeren Oberfläche zeigt.Beobachten Sie den Ektoderm, das Endoderm, das Mesenchym, das Herzrohr und den ventralen Teil des Neuralrohrs. Entfernen Sie das Neuralrohr und das Mesoderm, das an der dorsalen Oberfläche des pharyngealen Endoderms befestigt ist. Beobachten Sie das Endoderm des Rachens, den vierten und dritten Pharyngealbeutel und das Herzrohr.Mit der dorsalen Seite nach oben, vorsichtig lösen und entfernen Sie das Mesenchym zwischen den Rachenbögen und setzen Sie die Pharyngealbeutel. Führen Sie dieses Verfahren auf der anderen Seite des Rachenbereichs aus. Entfernen Sie das Mesenchym, das am hintersten Teil des Endoderms befestigt ist, und beobachten Sie den vierten Pharyngealbeutel.Mit hinteren Seiten nach oben, beobachten Sie sowohl links und rechts vierten Pharyngeal Beutel. Fahren Sie fort, indem Sie das Mesenchym entfernen, das am hintersten Teil des Endoderms und am zweiten Beutel befestigt ist. Entfernen Sie das Herzrohr und das Mesenchym, das die Innenbeutel umgibt.Mit der ventralen Seite nach oben, beobachten Sie den Rachen Endoderm und die rechte Seite des zweiten Pharyngealbogens. In diesem Stadium sollte das Endoderm der Schilddrüsenrudiment sichtbar sein. Lösen Sie das Ektoderm des zweiten und dritten Pharyngealbogens und entfernen Sie vorsichtig das Mesenchym der Bögen.Beobachten Sie die Entfernung des Mesenchym des zweiten Rachenbogens auf der rechten Seite. Beachten Sie die Lage des vierten und dritten Beutels und Schilddrüsenrudiment. Entfernen Sie die Überreste an mesenchymalen Zellen, die an den Pharyngealbeuteln befestigt sind.Beobachten Sie den dritten und vierten Beutel der rechten Seite und den vierten Beutel von der linken Seite. Wiederholen Sie die Mesenchym-Ablösung der linken Seite. Beobachten Sie nun den dritten Beutel der linken Seite.Beobachten Sie mesenchyme Ablösung des zweiten Bogens auf der linken Seite. Beachten Sie, dass alle Oberflächen und Lösungen während dieses Vorgangs kalt gehalten werden sollten. Wechseln Sie zu einer neuen kalten Pankreatin-Lösung und Schale im Falle einer langen Zeit, um das Gewebe zu sezieren.Schließlich machen Sie einen transversalen Schnitt zwischen dem zweiten und dritten PharyngealBeutel, um die zweiten Beutel und die Schilddrüsenrudiment zu entfernen. An dieser Stelle besteht das isolierte Endoderm aus dem dritten und vierten Rachenbeutel und der hinteren Spitze des Rachens. Entfernen Sie die Überreste gelöst Mesenchym mit Hilfe von zwei Mikroskalpellen.Übertragen Sie das isolierte Endoderm auf eine Glasschale, die mit kaltem fetalem Rinderserum gefüllt ist, und halten Sie es während der Herstellung des In-vitro-Assays auf Eis. Die Eier wurden in horizontaler Position platziert und die obere Seite für die Verwendung einer Holzkohle markiert. Um zu beginnen, entfernen Sie die Eier aus dem Brutkasten.Mit einer gekrümmten Schere ein kleines Loch in der Schale öffnen, eine Nadel einsetzen und zwei Milliliter Albumin mit einer 10-Milliliter-Spritze ansaugen. Öffnen Sie ein kreisförmiges Loch im markierten Bereich der Schale und schneiden Sie die Vitelline-Membran extern zu den zusätzlichen embryonalen Gefäßen, während Sie den Embryo mit dünnen Zangen halten. Unter einem Stereomikroskop legen Sie den Embryo in eine Petrischale mit schwarzer Basis, die kalte SPBS enthält.Verwenden Sie vier Insektenstifte, um den Embryo an der Unterseite der Platte zu halten. Platzieren Sie die Stifte in der extraembryonalen Region und bilden sie eine quadratische Form. Führen Sie zwei Schnitte zwischen den Soden 19 und 24 transversal zur Embryoachse durch und kreuzen Sie den Embryo.Lassen Sie diesen Abschnitt los, indem Sie die randalen embryonalen Kanten schneiden. Beobachten Sie die seitliche Platte, das Neuralrohr und die Soden. Aspirieren und übertragen Sie das Gewebe auf eine Glasschale mit kaltem Pankreatin gefüllt.30 Minuten auf Eis für die enzymatische Verdauung inkubieren. Isolieren Sie unter dem Stereomikroskop das Mesoderm aus den umgebenden Geweben mit zwei Mikroskalpellen in Haltern. Beobachten Sie das Somatopleura-Mesoderm, die Splanchnopleura, das Neuralrohr und das Ektoderm.Entfernen Sie zunächst das Ektoderm an der Oberfläche. Beobachten Sie das somatopleura mesoderm, das vom Ektoderm getrennt ist. Dann lösen Sie vorsichtig die ventrally lokalisierten Splanchnopleura von der Somatopleura.Beobachten Sie das rechte seitliche Mesoderm der Somatopleura. Lassen Sie es los, indem Sie es in einer parallelen Bewegung zum Neuralrohr schneiden. Beachten Sie, dass alle Oberflächen und Lösungen während dieses Vorgangs kalt gehalten werden sollten.Wechseln Sie zu einer neuen kalten Pankreatin-Lösung und Schale im Falle einer langen Zeit, um das Gewebe zu sezieren. Beobachten Sie das linke laterale Mesoderm der Somatopleura, soes, Neuralrohr und Ektoderm. Wiederholen Sie die mesoderm-Veröffentlichung dieser Seite.Machen Sie langsame Bewegungen mit dem Mikro-Skalpell. Die exponierten extrazellulären Matrixproteine sitzen durch Gewebe und Instrumente und verhindern Flüssigkeitsbewegungen. Schneiden Sie die Somatopleura vorsichtig in einer parallelen Bewegung zum Neuralrohr.Übertragen Sie das isolierte Mesoderm auf eine Glasschale, die mit kaltem fetalem Rinderserum gefüllt ist, und halten Sie es während der Herstellung von In-vitro-Assays auf Eis. Legen Sie einen feinmaschigen Metallrost in eine Petrischale und füllen Sie es mit Kulturmedium. Entfernen Sie die übermäßigen Flüssigkeiten, um die mittlere Oberfläche mit der Oberseite des Rostes zu nivellieren.Mit Hilfe von dünnen Zangen, tauchen Sie einen Membranfilter in das Kulturmedium und legen Sie ihn vorsichtig auf die Oberseite des Rostes, um eine Oberfläche in Kontakt mit ihr zu haben. Übertragen Sie unter dem Stereomikroskop das isolierte Endoderm von der Glasschale durch sanftes Gleiten mit Hilfe von Spachtel und dünnen Zangen auf den Membranfilter. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das isolierte Mesoderm.Mischen Sie mit Hilfe eines Mikroskalpells das Gewebe, um seine Assoziation zu maximieren. Stellen Sie das zugehörige Gewebe 48 Stunden lang vorsichtig in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad mit 5% CO2. Nach der Inkubationszeit transplantieren Sie das Kulturgewebe auf die Membran des Coriolan-Typs und lassen Sie es sich für weitere 10 Tage oval entwickeln, um die Organbildung wie zuvor beschrieben abzuschließen.Hier ist die Netzmethode, die die Isolierung von aviären embryonalen Geweben in verschiedenen experimentellen Ansätzen verwendet werden kann. Als Beispiel wurde die Expression von Genen, von denen bekannt ist, dass sie an der Bildung der Pharyngealbeutel beteiligt sind, auch ein isoliertes Endoderm bewertet, das das zweite, dritte und vierte Pharyngealbeutel aus Hühnerembryonen am embryonalen Tag dreieinhalb durch ganze Mount-in-situ-Hybridisierung enthält. Die Expression von Sonic Hedgehog wurde im Endoderm des zentralen Rachens nachgewiesen und aus den Beuteln ausgeschlossen, während BMP7 im Endoderm des zweiten und dritten Pharyngealbeutels ausgedrückt und vom zentralen Rachen- und vierten Pharyngealbeutel ausgeschlossen wurde.Isoliertes Gewebe kann auch 48 Stunden lang in vitro in vitro in vitro assoziiert werden, auf die Membran des Coriolan-Typs transplantiert werden und sich für weitere 10 Tage entwickeln. Explanten können durch konventionelle Histologie und Immunhistochemie analysiert werden. Einige repräsentative Ergebnisse der Assoziation von Wachtelendoderm aus dem dritten und vierten Pharyngealbeutel mit Huhn somatopleura mesoderm sind die folgenden-Grafts zeigten einen voll ausgebildeten chimären Thymus mit Wachtel abgeleiteten thymischen Epithelzellen positiv für QCPN und Huhn Lymphoidzellen.Darüber hinaus zeigte Cytokeratin-positives thymisches Epithel normale morphologische Merkmale, die eine typische Retikulusarchitektur aufweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie wachteln und Embryonalgewebe von Hühnern isolieren können, die in Genexpressionsstudien verwendet werden können und durch die Bildung von chimerischen Organen auch dazu beitragen können, die Komplexität der Organgenetik zu entschlüsseln.

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Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Erfahren Sie die Isolierung embryonaler Gewebe aus Wachtel- und Hühnerembryonen für Genexpressionsstudien. Diese Mikrochirurgie-Methode ermöglicht hochauflösende funktionelle Analysen in der Entwicklungsbiologie.

Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel

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