Die Entdeckung und Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen Protein-Funktion Mit HaloTag Technologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteinkomplexe effizient aus Säugetierzellen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellen mit einem Halo-Tag-Fusionskonstrukt durchtrennt werden, um das gewünschte Protein zu exprimieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen in Scheiben zu schneiden und die Proteinkomplexe über einen Halo-Tag kovalent auf dem Harz einzufangen.

Anschließend werden die Proteinkomplexe auf dem Harz schonend gewaschen, um unspezifische Wechselwirkungen zu entfernen. Der letzte Schritt besteht darin, die Proteinkomplexe aus dem Harz zu eluieren. Letztendlich werden Halo-Tag-Pulldowns verwendet, um neuartige Proteininteraktionen aus Säugetiersystemen zu isolieren und zu entdecken.

Die Methoden, die wir Ihnen heute vorstellen werden, können wichtige Entdeckungen auf dem Gebiet der funktionellen Proteomik ermöglichen, einschließlich der Identifizierung neuartiger Proteininteraktionen und der Bestimmung der Proteinlokalisation in Zellen. Diese Eingriffe werden heute von zwei unserer leitenden Wissenschaftler, Jackie Mendez und Alen Beek, durchgeführt. Bereiten Sie zunächst für jede Fusion oder Kontrolle eine 15-Zentimeter-Schale mit 30 Millilitern Zellen vor, die drei bis vier mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter oder ein bis 1,2 mal 10 Zellen insgesamt pro Konstrukt enthalten.

Inkubieren Sie die Zellen 18 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach der Inkubation transfizieren Sie das Konstrukt mit dem gewünschten Transfektionsreagenz. Entfernen Sie nach 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion das Medium und waschen Sie die Zellschicht vorsichtig mit 20 bis 25 Millilitern eiskaltem PBS. Entfernen Sie das PBS-Waschmittel und fügen Sie 25 bis 30 Milliliter vier Grad Celsius gekühltes PBS hinzu.

Kratzen Sie anschließend die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber von der Schale. Nachdem die Zellen in konischen Röhrchen gesammelt wurden, zentrifugieren Sie die Proben fünf bis 10 Minuten lang bei 2000 Mal G und vier Grad Celsius. Nach dem Entsorgen des Überstands werden die Zellpellets mindestens 30 Minuten oder maximal sechs Monate lang bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Bereiten Sie für jede Fusions- oder Kontrollprobe 18 Milliliter Harzausgleichs-Waschpuffer vor. Mischen Sie das Harz vorsichtig, indem Sie das Fläschchen umdrehen, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Für jedes Pull-Down-Experiment werden 200 Mikroliter Harz in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.

Die Probe wird eine Minute lang bei 800-facher G-Temperatur zentrifugiert. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Harz am Boden der Tube zu beschädigen. Nachdem der Überstand verworfen wurde, geben Sie 800 Mikroliter Harzausgleichswaschpuffer in die Probe und mischen Sie sie gründlich, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Nach.

Zentrifugieren Sie die Probe zwei Minuten lang mit 800 Mal. G.Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte noch zwei weitere Male für insgesamt drei Wäschen.

Nach dem Auftauen der Zellpellets werden sie in 300 Mikrolitern zuvor vorbereiteter Säugetierlyse suspendiert. Puffern Sie durch Auf- und Abpipettieren. Dann in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und sechs Mikroliter 50 x Proteasehemmer-Cocktail hinzufügen.

Fügen Sie anschließend drei Mikroliter RQ one DNAs hinzu und invertieren Sie die Probe für 10 Minuten. Bei Raumtemperatur werden die Zellen durch fünf- bis zehnmaliges Passieren einer Spritzennadel mit 25 oder 27 Gauge behandelt. Sobald die Probe bei 14.000 Mal, G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert wurde, überführen Sie das klare Lysat in ein neues Röhrchen und legen Sie es auf Eis.

Geben Sie als Nächstes weitere 700 Mikroliter des zuvor vorbereiteten XTBS-Puffers in das klare Lysat und mischen Sie es gut, indem Sie auf und ab pipettieren. Entfernen Sie die letzten Wäschen aus den zuvor vorbereiteten äquilibrierten Harztuben, ohne das Harz am Boden jeder Tube zu stören. Geben Sie dann einen Milliliter des verdünnten Lysats in jedes Röhrchen.

Inkubieren Sie die Proben durch Mischen auf einem Röhrchenrotator für 15 Minuten bei 22 Grad Celsius. Nach dieser Zentrifuge werden die Harzröhrchen zwei Minuten lang bei 800 mal G behandelt. Nach dem Verwerfen des Überstands wird ein Milliliter Harzausgleichswaschpuffer hinzugefügt und gründlich gemischt, indem jedes Harzröhrchen mehrmals von Hand umgedreht wird, nachdem die Harzröhrchen zwei Minuten lang bei 800 Mal zentrifugiert wurden. G.Entsorgen Sie die Wäschen, nachdem die vorherigen Waschschritte dreimal wiederholt wurden.

Geben Sie einen Milliliter Harzausgleichswaschpuffer in die Röhrchen, nachdem Sie die Proben fünf Minuten lang bei 22 Grad Celsius mit konstanter Rotation inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Harzröhrchen zwei Minuten lang bei 800 mal G und verwerfen Sie die Waschvorgänge. Zu diesem Zeitpunkt wird das Harz aus jeder Probe in 50 Mikrolitern SDS-Elutionspuffer durch die Wiederbelebung suspendiert. Schütteln Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur mit einem automatischen Mikrozentrifugen-Röhrchenschüttler 30 Minuten lang.

Nach einer zweiminütigen Zentrifugation mit dem 800-fachen G.Übertragen Sie die EITs zur Analyse in frische Röhrchen Für Western Blot oder Silberfleckengel laden Sie fünf bis 10 Mikroliter der Proben auf ein SDS-Denaturierungsgel für die Massenspektrometrie. Lagern Sie 40 Mikroliter jeder Probe bei minus 20 Grad Celsius für zukünftige Analysen. In einem Deckglas mit acht Vertiefungen werden für jedes Fusionsprotein oder jede Kontrollplatte 400 Mikroliter HELOC-Zellen in ihrem entsprechenden Medium in jeder Vertiefung bei einer Dichte von ein bis zwei mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter gegeben.

Nachdem die Zellen 18 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubiert wurden, transfizierten Sie sie nach 18 bis 24 Stunden mit dem gewünschten Transfektionsreagenz und verdünnen Sie nach der Transfektion den TMR-Liganden eins zu 200 in den entsprechenden zellulären Medien. Geben Sie dann 100 Mikroliter dieser Lösung in jede Vertiefung und mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie anschließend die transfizierten Zellen, die den Liganden enthalten, 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Wenn Sie fertig sind, aspirieren Sie das Medium, das den Liganden enthält, und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter des entsprechenden Mediums ohne Proteinfusions-Tag-Liganden, das auf 37 Grad Celsius vorgewarnt wurde. Einmal wurde der vorherige Schritt zweimal für insgesamt drei Wäschen wiederholt. Legen Sie die Zellen für 30 Minuten zurück in den Inkubator.

Nach der 30-minütigen Inkubation das Medium absaugen und durch 500 Mikroliter geeignetes Medium ersetzen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Im Anschluss an dieses Bild werden die Zellen unter Verwendung der entsprechenden Erfassungsparameter unter Verwendung des Protokolls halo, BRD four und halo tag control expression beobachtet. Die Expression von Fusionsproteinen kann auch mit Western Blots mit Anti-Halo-Tag-Antikörpern oder Antikörpern gegen das Köderprotein nachgewiesen werden.

Silberfärbegele von biologischen Replikaten von Halo BRD four und Kontrollpulldowns weisen eine hohe Reproduzierbarkeit auf und zeigen Proteine, die mit dem BRD four-Protein interagieren. Die hohe Abundanz an Bestandteilen aus PTF, B, CDK neun und Cyclin T sowie dem BRD neun Protein bestätigt die spezifische Erfassung von BRD vier Komplexen. Die Gele zeigten andere Proteine, die als potenzielle Interaktoren von BRD vier identifiziert wurden.

Als weiteres Beispiel wurden komplexe Isolierungen mit dem Halo HD one Protein durchgeführt. In diesem Fall wurde die TEV-Protease verwendet, um in einer Linkerregion zwischen dem Halo-Tag und dem H-DAC-Tag zu spalten und signifikante Mengen des HD-One-Köderproteins freizusetzen. Wie beobachtet.

HD-1-Pulldown-Proben zeigten ein hohes Maß an HD-1-Aktivität, die durch den HDA-Inhibitor Saha gehemmt wurde. Um die Spezifität weiter zu demonstrieren, wurde keine HDA-Hemmung mit dem Inhibitor der Sirtuin-Familie EX 5 27 beobachtet und es wurde kein Signal mit Puffer allein nachgewiesen. He A-Zellen, die mit Halo BRD vier und Halo HDAC eins transfiziert wurden, wurden mit TMR fluoreszenzmarkiert.

Die Ligandenbildgebung zeigte, dass beide im Zellkern lokalisiert sind und zeigen, dass der Tag die physiologische zelluläre Lokalisation seiner Fusionspartner nicht verändert. Nach diesem Verfahren können die isolierten Proteine und ihre Interaktionspartner identifiziert und mit einer Vielzahl von Analysemethoden wie Massenspektrometrie und Western Blotting weiter analysiert werden.