Die Entdeckung und Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen Protein-Funktion Mit HaloTag Technologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Protein-Komplexe effizient aus Säugetierzellen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst mit einem Halo-Tag-Fusionskonstrukt transfiziert werden, um das Protein von Interesse zu exprimieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen aufzuschließen und die Protein-Komplexe über das Halo-Tag kovalent an eine Harzmatrix zu binden.

Anschließend werden die Protein-Komplexe auf der Harzmatrix vorsichtig gewaschen, um unspezifische Wechselwirkungen zu entfernen. Der letzte Schritt besteht darin, die Protein-Komplexe von der Harzmatrix zu eluieren. Letztendlich dienen Halo-Tag-Pull-downs der Isolierung und Entdeckung neuartiger Proteinwechselwirkungen aus Säuger-Systemen.

Die hier vorgestellten Methoden können wesentliche Entdeckungen im Bereich der funktionellen Proteomik ermöglichen, einschließlich der Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen und der Bestimmung der Proteinlokalisation innerhalb von Zellen. Heute führen zwei unserer leitenden Wissenschaftlerinnen, Jackie Mendez und Alen Beek, diese Verfahren durch. Bereiten Sie zunächst für jede Fusion oder Kontrolle eine 15-Zentimeter-Schale mit 30 Milliliter Zellen bei einer Dichte von drei bis vier mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter oder insgesamt ein bis 1,2 mal 10 hoch sieben Zellen pro Konstrukt vor.

Inkubieren Sie die Zellen 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach der Inkubation transfizieren Sie das Konstrukt mit dem gewünschten Transfektionsreagenz. 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion entfernen Sie das Medium und waschen die Zellschicht vorsichtig mit 20 bis 25 Milliliter eiskalter PBS. Entfernen Sie die PBS-Waschung und geben Sie 25 bis 30 Milliliter mit vier Grad Celsius gekühlte PBS hinzu.

Im Anschluss die Zellen vorsichtig mit einem Zellabstreifer vom Gefäß abkratzen. Sobald die Zellen in konischen Röhrchen gesammelt wurden, die Proben fünf bis zehn Minuten bei 2000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Entsorgen des Überstandes die Zellpellets für mindestens 30 Minuten oder maximal sechs Monate bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Für jede Fusion oder Kontrollprobe bereiten Sie 18 Milliliter Puffer zur Äquilibrierung und Waschung der Harzes vor. Mischen Sie das Harz vorsichtig durch mehrmaliges Umstülpen des Gefäßes, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Geben Sie für jedes Pull-down-Experiment 200 Mikroliter Harz in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Probe eine Minute lang mit 800 × g. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Harz am Boden des Röhrchens zu stören. Sobald der Überstand verworfen wurde, geben Sie 800 µL Puffer zur Äquilibrierung und Waschen des Harzes zur Probe hinzu und mischen gründlich durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens. Danach.

Zentrifugieren Sie die Probe zwei Minuten lang mit 800 × g. Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte noch zweimal, insgesamt drei Waschungen.

Nach dem Auftauen der Zellpellets suspendieren Sie diese durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in 300 Mikrolitern des zuvor hergestellten Säugerzell-Lysepuffers. Anschließend überführen Sie die Suspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und geben sechs Mikroliter 50x-Proteaseinhibitorcocktail hinzu.

Fügen Sie danach drei Mikroliter RQ1-DNA hinzu und invertieren Sie die Probe zehn Minuten lang. Lyse die Zellen bei Raumtemperatur, indem Sie die Probe fünf bis zehn Mal durch eine 25- oder 27-Gauge-Spritzenkanüle ziehen. Nach einer Zentrifugation bei 14.000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius überführen Sie das klare Lysat in ein neues Röhrchen und stellen es auf Eis.

Fügen Sie anschließend weitere 700 Mikroliter des zuvor hergestellten 1×TBS-Puffers zum klaren Lysat hinzu und mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Entfernen Sie die letzten Waschschritte aus den zuvor vorbereiteten, equilibrierten Harzröhrchen, ohne das Harz am Boden jedes Röhrchens aufzuwirbeln. Geben Sie dann je ein Milliliter des verdünnten Lysats in jedes Röhrchen.

Die Proben 15 Minuten bei 22 Grad Celsius unter Rühren auf einem Rohrschüttler inkubieren. Anschließend die Harzröhrchen zwei Minuten bei 800 × g zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstandes ein Milliliter Harz-Ausgleichspuffer hinzufügen und durch mehrmaliges Vorsichtig-Invertieren der Harzröhrchen gründlich mischen, gefolgt von einer Zentrifugation der Harzröhrchen zwei Minuten bei 800 × g. Die Waschschritte verwerfen, nachdem die vorherigen und die Waschschritte insgesamt dreimal wiederholt wurden.

Geben Sie nach der Inkubation der Proben bei 22 Grad Celsius für fünf Minuten mit konstanter Rotation je ein Milliliter Harzäquilibrierpuffer zu den Röhrchen hinzu, zentrifugieren Sie die Harzröhrchen zwei Minuten lang bei 800 ×g und entsorgen Sie die Waschlösungen. Resuspendieren Sie anschließend das Harz aus jeder Probe in 50 Mikroliter SDS-Elutionspuffer. Schütteln Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem automatischen Mikrozentrifugenröhrchenschüttler.

Nach der Zentrifugation für zwei Minuten bei 800 × g die EITs in frische Röhrchen zur Analyse überführen. Für Western Blot oder Silberfärbung 5 bis 10 µL der Proben auf ein SDS-denaturierendes Gel laden, für Massenspektrometrie geeignet. 40 µL jeder Probe bei −20 °C für zukünftige Analysen lagern. In einer 8-Loch-Kammerobjektträgerplatte für jedes Fusionsprotein oder Kontrollpräparat 400 µL HELOC-Zellen in dem jeweils geeigneten Medium pro Kammer bei einer Dichte von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen pro mL ansäen.

Nach der Inkubation der Zellen für 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 transfectieren Sie diese mit dem gewünschten Transfektionsreagenz. 18 bis 24 Stunden nach der Transfektion verdünnen Sie das TMR-Ligand im Verhältnis 1 zu 200 in dem geeigneten Zellkulturmedium. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter dieser Lösung in jede Vertiefung und mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie danach die transfizierten Zellen mit dem Liganden für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Wenn fertig, das Medium, das den Liganden enthält, abpipettieren und durch 500 Mikroliter des entsprechenden Mediums ohne Protein-Fusionstag-Liganden ersetzen, das zuvor auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Nachdem der vorherige Schritt insgesamt dreimal wiederholt wurde, wobei er zweimal erneut durchgeführt wird, die Zellen für 30 Minuten zurück in den Inkubator stellen.

Nach der 30-minütigen Inkubation das Medium abpipettieren und durch 500 Mikroliter geeignetes Medium ersetzen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Danach die Zellen auf einem Mikroskop unter Verwendung der geeigneten Aufnahmeparameter gemäß dem Protokoll Halo, BRD vier und Halo-Tag-Kontrolle auf Expression untersuchen. Die Expression des Fusionsproteins kann zusätzlich mittels Western Blot mit Anti-Halo-Tag-Antikörpern oder Antikörpern gegen das Bait-Protein nachgewiesen werden.

Silberfärbungen von Gelen biologischer Replikate von Halo-BRD-vier- und Kontroll-Pulldowns zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit und stellen Proteine dar, die mit dem BRD-vier-Protein interagieren. Die hohe Häufigkeit von Bestandteilen aus PTF B CDK neun und Cyclin T sowie des BRD-neun-Proteins bestätigt die spezifische Anreicherung von BRD-vier-Komplexen. Die Gele zeigten weitere Proteine, die als potenzielle Interaktoren von BRD vier identifiziert wurden.

Als zusätzliches Beispiel wurden komplexe Isolierungen mit dem Halo-HD-eins-Protein durchgeführt. In diesem Fall wurde die TEV-Protease verwendet, um im Linkerbereich zwischen Halo-Tag und H-DAC-eins zu schneiden, wodurch signifikante Mengen des HD-eins-Baitproteins freigesetzt wurden. Wie beobachtet wurde.

HD1-Pulldown-Proben zeigten hohe Stufen der HD1-Aktivität, die durch den HDA-Hemmer SAHA inhibiert wurde. Um die Spezifität weiter zu belegen, wurde keine HDA-Hemmung mit dem Sirtuinfamilienhemmer EX-527 beobachtet, und kein Signal wurde allein mit Puffer detektiert. HeLa-Zellen, die mit Halo-BRD4 und Halo-HDAC1 transfiziert wurden, wurden fluoreszenzmarkiert mit TMR.

Die Liganden-Bildgebung zeigte, dass beide Proteine im Zellkern lokalisiert sind, und belegt, dass der Tag die physiologische zelluläre Lokalisation ihrer Fusionspartner nicht verändert hat. Somit können nach dieser Vorgehensweise die isolierten Proteine sowie ihre Interaktionspartner identifiziert und mithilfe verschiedener analytischer Methoden wie der Massenspektrometrie und der Western-Blot-Analyse weiter untersucht werden.