Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Das übergeordnete Ziel des folgenden Protokolls ist es, die Auswirkungen einer mikrobiellen Infektion auf chronische Entzündungen in vivo anhand eines physiologisch relevanten Tiermodells zu untersuchen. Dies wird durch die orale Infektion von Mäusen mit Porphyromonas gingivalis erreicht, um eine lokale und systemische chronische Entzündung auszulösen. Die MRT kann dann verwendet werden, um das Fortschreiten der systemischen Entzündung bei lebenden Tieren zu messen, während der lokale entzündliche Knochenverlust durch Mikro-CT beurteilt wird und atherosklerotische Plaques durch Lipidfärbung im Gesicht nach der Tötung sichtbar gemacht werden können.

Letztendlich können Unterschiede im alveolären Knochenvolumen und die Akkumulation von atherosklerotischen Plaques zwischen P-gingivalis-infizierten Mäusen und nicht infizierten Kontrollen auf der Grundlage von Mikro-CT-Analysen bzw. Gesichtslipidfärbungen gemessen werden. Der große Vorteil unseres Tiermodells besteht darin, dass es Ihnen ermöglicht, sowohl Wirts- als auch pathogene Mechanismen zu untersuchen, die an chronischen Entzündungen beteiligt sind, und zwar speziell an Stellen, die weit von der Infektion entfernt sind. So kann man sowohl systemische als auch lokale Infektionsherde mit transgenen Mäusen und definierten bakteriellen Mutanten betrachten.

Dieses Modell kann dabei helfen, Schlüsselaspekte der Pathogenese zu identifizieren, wie z. B. Wirts- und mikrobielle Faktoren, die zur Krankheit beitragen. Obwohl diese Methode Einblicke in die spezifischen Wirts- und Erregermechanismen geben kann, die an entzündlichem Knochenschwund und Atherosklerose beteiligt sind, kann sie auch für andere Mausmodelle von Krankheiten angepasst werden, darunter rheumatoide Arthritis, Diabetes und Krebs. Dies ist die Hochfeld-MRT-Core Facility für die Boston University, und mein Postdoc-Stipendiat Ning wird Aspekte der Bildgebung bei Mäusen demonstrieren. Beginnen Sie damit, gefrorene Stängel von Pfirsich gingivalis 3 81 auf anaerobe Blutagarplatten zu streichen und die Platten in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius zu inkubieren.

Verwenden Sie nach drei bis fünf Tagen die auf der Platte gezüchteten Organismen, um fünf Milliliter Flüssigkulturen der Gehirn-Herz-Infusionsbrühe oder BHI zu impfen. Nach dem Wachstum über Nacht überführen Sie die Kulturen auf 45 Milliliter BHI und inkubieren die Kulturen weitere 18 bis 24 Stunden lang anaerob. In der mittleren logarithmischen Phase werden die Bakterien durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 7.000 GS und Raumtemperatur geerntet und dann das Pellet in fünf Millilitern PBS mit einer serologischen Pipette gründlich wieder suspendiert, nachdem das Pellet dreimal in 50 Millilitern PBS Resus gewaschen wurde, das Pellet in PBS so, dass eine Verdünnung der Kultur von eins zu 10 eine optische Dichte von 1,0 bei 660 Nanometern aufweist.

Ziehen Sie dann genügend mittelviskose Carboxymethylcellulose heraus, um eine Lösung von 2 % Gewicht zu Volumen zu erhalten, und fügen Sie die Carbox-Ethylcellulose langsam zur Bakteriensuspension hinzu, während Sie vortexen, um ein Verklumpen zu vermeiden. Um das Fortschreiten der Entzündung in C zwei zu messen. Setzen Sie zunächst einen Tierhalter mit dem Kopf der Maus in Rückenlage in eine 30 Millimeter vertikale Sonde und in die vertikale Bohrung eines 11,7-TMRI-Scanners ein.

Verwenden Sie nach Wobbling- und Shimming-Prozessen eine seltene Sequenz, um Scout-Bilder entlang dreier orthogonaler Ausrichtungen aufzunehmen, um axiale koronale und sagittale Bilder zu erstellen. Nachdem Sie eine Magnetresonanzangiographie mit niedriger Auflösung verwendet haben, um zu bestätigen, dass sich die aufgenommenen Bilder innerhalb der Zielregion befinden, führen Sie eine hochauflösende Magnetresonanzangiographie der Arteria innominatis mit einer undatierten 3D-Gradientenechosequenz unter Verwendung der folgenden Parameter durch. Eine Plattendicke von 1,5 Zentimetern, ein Schwenkwinkel von 45 Grad, eine Wiederholungszeit von 20 Millisekunden, eine Echozeit von 2,2 Millisekunden, ein Sichtfeld von 1,5 x 1,5 x 1,5 Zentimetern, eine Matrix von 1 28 x 1 28 x 1 28 und eine Anzahl von durchschnittlich vier für eine Gesamtscanzeit von etwa 22 Minuten.

Wählen Sie dann ein axiales Bild der Nennarterie 0,3 bis 0,5 Millimeter unterhalb der Bifurkation des Schlüsselbeins für die ROI-Analyse aus. Um die Aorta zu fixieren und das Gewebe immer mit PBS bedeckt zu halten. Beginnen Sie damit, die Aorta in der anatomischen Position zu legen, mit den Bulben der Aorta auf der linken Seite. Platzieren Sie dann provisorische Mnuchin-Stifte nacheinander an den folgenden fünf Stellen, am oberen Ende der Aorta unterhalb des dritten Astes des Bogens, in der Mitte der absteigenden Aorta in der Nähe des unteren Endes der absteigenden Aorta und über dem Ast der Oberschenkelarterie.

Schneiden Sie anschließend mit einer extra feinen Federschere die linke Seite der Aorta auf, beginnend am linken Ast der Oberschenkelarterie bis unter den untersten Ast der aufsteigenden Aorta. Nachdem Sie jeden Ast abgeschnitten und festgesteckt haben, um seine innere Oberfläche freizulegen, fahren Sie fort, das Gewebe festzustecken. Die gesamte Innenfläche ist freiliegend und von oben gut sichtbar und frei von optischen Störungen durch die Pins.

Um die Lipide zu färben und die Läsionen zu quantifizieren, beginnen Sie damit, die fixierte Aorta mit frisch zubereiteter Sudan Four oder ölroter O-Lösung zu bedecken. Waschen Sie das Tuch nach 50 Minuten ein bis fünf Minuten lang mit 70 % Isopropanol und spülen Sie die Aorta dann vorsichtig mit doppelt destilliertem Wasser aus, bis das Wasser, das aus dem Gewebe austritt, nicht mehr rot ist. Decken Sie als Nächstes die Aorta mit PBS ab und legen Sie ein Lineal neben das Gewebe, um die Bildkalibrierung zu unterstützen.

Nehmen Sie dann Bilder des Gewebes mit der hochauflösenden Kamera auf, die an ein Präpariermikroskop angeschlossen ist, und speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien. Schließlich kann in der Bildanalysesoftware jede Intimaloberfläche manuell nachgezeichnet werden, um ihre Fläche zu bestimmen. Um dann den Läsionsbereich mithilfe der automatischen Farbschwellenwerte zu berechnen, legen Sie für jedes Bild einen Schwellenwert fest, um eine Farbintensität zu definieren, die die Läsionen von den normalen Bereichen unterscheidet.

Der prozentuale Anteil der Intimaoberfläche, der von atherosklerotischen Läsionen bedeckt ist, kann dann in diesem repräsentativen Experiment mit p gingivalis infizierten Mäusen berechnet werden. Die volumetrische Analyse zeigte, dass infizierte Mäuse im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen einen signifikanten Knochenverlust aufweisen. Die visuelle Inspektion des rekonstruierten Hemi-Oberkiefers zeigt eine Zunahme der freiliegenden Oberfläche der Backenzahnwurzeln bei infizierten Mäusen im Vergleich zu Kontrollen mit Atherosklerose-Anfälligkeit.

Eine POE-defiziente Maus. P gingivalis induziert eine chronische Entzündung, die bereits 24 Stunden nach der letzten Infektion zu einem Verlust von Alveolarknochen und entzündlichen Plaqueablagerungen in der Aortenhöhle und einer Nominatarterie führt, die bei lebenden Mäusen durch serielle in vivo MRT zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion überwacht werden kann, wie in diesen repräsentativen Bildern zu sehen ist. Darüber hinaus zeigen Messungen der Sudan-Aorta mit vier Flecken, dass eine p gingivalis-Infektion die Lipidablagerung und die läsionalen Bereiche auf der intimalen Oberfläche signifikant erhöht.

Darüber hinaus zeigt die immunhistochemische Analyse von Aortensinusläsionen eine erhöhte Mikrophageninfiltration und eine erhöhte Expression des Toll-like-Rezeptors des angeborenen Immunrezeptors bei zwei IVs-infizierten Mäusen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die experimentelle Dauer zu berücksichtigen, zu der die Zeitpunkte, zu denen die Entzündung bewertet wird, angemessen mit dem Fortschreiten der Krankheit übereinstimmen sollten. Nach der MRT-Bildgebung anderer können andere Methoden wie das Stehen im Gesicht oder die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die globale atherosklerotische Belastung oder die zellulären Komponenten der Läsion zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für ein In-vivo-Mausmodell haben, das es Ihnen ermöglicht, sowohl Wirts- als auch pathogene Faktoren zu untersuchen, die an chronischen Entzündungen beteiligt sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die ordnungsgemäße Verwendung von PSA getroffen werden sollten.