Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge In situ Hybridisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gefärbte fixierte Zebrafischembryonen zu frühen Entwicklungszeitpunkten besser sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem der Zebrafischembryo zunächst mit Hilfe der Homemount-Hybridisierung in C zwei gefärbt wird. Als nächstes wird ein Embryo für die flache Montage ausgewählt und ein zentraler Schnitt in das Eigelb mit einer feinen Pinzette gemacht, dann werden die Wimpernwerkzeuge verwendet, um das verbleibende Dottergranulat vorsichtig abzukratzen und zu entfernen.

Schließlich wird der Embryo in Glycerin auf einen Objektträger montiert, um die entsprechende Bildgebung der Probe zu ermöglichen. Letztendlich ermöglicht die flache Montage eine bessere Visualisierung von gefärbten Embryonen aus dorsaler Sicht, indem das Eigelb entfernt und der Embryo in einer zweidimensionalen Präparation positioniert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Bildgebung intakter Embryonen in jüngeren Entwicklungsstadien besteht darin, dass durch die flache Montage der Dottersack entfernt wird, sodass der gesamte Embryo betrachtet werden kann.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Entwicklungsbereich zu beantworten, wie z.B. die Charakterisierung des Bereichs des renalen Prä-Gender-Feldes in einem Embryo. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, weil diese Technik einen schonenden Umgang mit dem Embryo erfordert und auch weil das Erlernen des richtigen Drucks, der zum Entfernen des Dottersacks erforderlich ist, einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Dieses Verfahren werden von mir, Zoe und Amanda demonstriert, die Doktorandinnen im Winger-Labor sind.

Nach der Entnahme, Fixierung und Färbung der Embryonen gemäß dem Textprotokoll wählen Sie einen Embryo für die flache Montage mit einem X-P-B-S-T aus. Übertragen Sie den Embryo in eine Petrischale aus Plastik oder Glas. Halten Sie dann die Schale unter ein Stereomikroskop und rollen Sie den Embryo mit einer feinen Pinzette, so dass eine Seitenansicht mit sichtbarem Kopf und Schwanz entsteht.

Verwenden Sie dann eine feine Pinzette, um den Embryo ruhig zu halten, und einen zweiten Satz, um einen Schnitt in das Eigelb an einer Position zu machen, die sich zentral zwischen dem Kopf und dem Schwanz des Embryos befindet. Schöpfen Sie dann mit einer feinen Pinzette das Eigelb aus der Eichenzellhöhle heraus. Verwenden Sie ein X-P-B-S-T, um das verirrte Eigelb vom Embryo mit ein bis zwei Tropfen eines XPBS abzuspülen.

Übertragen Sie den Embryo auf einen flachen Objektträger. Ziehen Sie den Embryo an den Rand des Puffers, so dass er in einer flachen Position auf dem Objektträger anliegt. Während Sie den Embryo verankern, kratzen Sie mit einem Wimpernwerkzeug vorsichtig die Bauchoberfläche ab, um das Dottergranulat zu entfernen.

Wenn die PBST-Lösung mit überschüssigem Eigelb verstopft ist oder zu verdampfen beginnt, fügen Sie ein bis zwei frische Tropfen hinzu und ziehen Sie den Embryo in diesen frischen Puffer. Nachdem das Eigelb zufriedenstellend entfernt wurde, übertragen Sie den Embryo vorsichtig zurück in eine Petrischale mit PBST für eine abschließende Spülung. Dann wird der Embryo in eine Petrischale mit 100 % Glycerin gegeben und fünf Minuten lang inkubiert.

Um den Embryo auf einen Objektträger zu setzen, übertragen Sie ihn auf ein sauberes Glas. Schieben Sie ein bis zwei Tropfen 100%iges Glycerin hinein und positionieren Sie es mit der ventralen Dotterseite zum Objektträger. Ziehen Sie den Embryo mit einem Wimpernwerkzeug an den Rand des Glycerintropfens, so dass er in einer flachen Position gegen den Objektträger anliegt.

Wenn die Embryonalachse gekrümmt ist, machen Sie mit der feinen Pinzette vorsichtig kleine Schnitte in das verbleibende Eigelb, um Spannungen zu lösen, damit es flach positioniert werden kann. Auf der Folie. Platzieren Sie kleine Vertiefungen aus Modelliermasse auf den vier Ecken eines 18 x 18 großen Abdeckglases.

Legen Sie das Deckglas langsam auf den Embryo und winkeln Sie es an, um Luftblasen im Glycerin zu minimieren. Geben Sie zum Schluss einen zusätzlichen Tropfen 100% Glycerin auf die Seite des Deckglases, um den Raum zwischen dem Glas zu füllen und ein Abdriften zu vermeiden, verwenden Sie ein Stereo- oder Verbundmikroskop, um das hier gezeigte Bild zu machen. Eine Kombination von Sonden wurde zusammen mit zwei farbigen Wünschen verwendet, um sich entwickelnde Nierenvorläuferzellen zu markieren, aus denen die Niere hervorgeht, und die Embryonen wurden früh flach montiert.

Milbenstadien, Nierenvorläuferzellen, werden in einem U-förmigen Muster durch ihre Expression von PAX zwei A-Transkripten abgegrenzt, die das pariale Mesoderm umgeben, das gleichzeitig Delta C exprimiert, das in rot dargestellt ist. Als delta C mit C crox 20 co-markiert wurde, wurde eine rostrale Subdomäne der Nierenvorläufer entdeckt, die delta C exprimiert, wobei die Expression von PAX zwei a, SLC vier a vier, SLC 12 A drei und S-M-Y-H-C eins an der 14 analysiert wurde. Das Milbenstadium ermöglicht also die Kartierung der gesamten renalen Vorläuferdomäne mit PAX zwei A und zeigte, dass eine Untergruppe von Zellen in der rostralen Subdomäne SLC vier A vier exprimierte.

Dies überschnitt sich nicht mit der Coddle-Subdomäne von Nierenvorläuferzellen, die SLC 12 A drei exprimierten. In dieser Abbildung wurden Embryonen mit Mutationen im Retinaldehyd-Dehydrogenase-Zwei-Gen, das für die Biosynthese von Retinsäure erforderlich ist, oder Embryonen, die mit DEAB- und ALD-H-Inhibitor behandelt wurden, mit reduzierter bzw. aufgehobener Expression von WT one A entwickelt, was zeigt, dass der Zwei-Farben-Wunsch mit dem Flat-Mount-Präparat für die Untersuchung zellulärer Domänen während der Organogenese wertvoll ist. Bei Zebrafischen mit genetischen Mutationen oder wenn sie chemisch kleinen Molekülen ausgesetzt sind Einmal gemeistert, kann diese Technik 10 bis 15 Minuten dauern, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie bildgebende Verfahren durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wo sich die Grenzen der Nierensegmente befinden. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen gefärbten Zebrafischembryo flach montieren können, um die gewünschten Strukturen durch die Entfernung des Eigelbs besser sichtbar zu machen.