Name: Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge In situ Hybridisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Flat-Mount-Technik für Zebrafisch-Embryonen nach WISH-Färbung zur verbesserten Visualisierung embryonaler Strukturen. Diese Methode ermöglicht dorsale Ansichten für die Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung von RAW aus jeder der folgenden unterstützt: NIH Zuschüsse K01 DK083512, DP2 OD008470 und R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Zuschussvergabe # 5-FY12-75; Start-up-Fonds von der Universität von Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences. Besonders möchten wir auf Elizabeth und Michael Gallagher zu danken, mit der gesamten Familie Gallagher, der ein großzügiges Geschenk an die Universität von Notre Dame verliehen zur Förderung der Stammzellforschung. Die Geldgeber hatten keine Rolle in dem Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften für ihre Unterstützung, und das Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der Notre Dame für ihre herausragende Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Schließlich danken wir den Mitgliedern unserer Forschungslabor für ihre Kommentare, Diskussionen und Erkenntnisse über diese Arbeit, wiesowie Ringelblume (Maripooka) und Zinnia Wingert natürlich für die Bereitstellung von Schuppen Katzen Schnurrhaare, die meisten ausgezeichnete Peitsche Tools für unsere Forschung.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zebrafische haben sich als ein äußerst wertvolles Modellorganismus in der gesamten Forschungsgemeinschaft in den letzten Jahren. Zebrafisch zeigen einen hohen Grad an genetischer Naturschutz mit der höheren Wirbeltieren und Vorteile in Bezug auf ihre Anatomie, Zucht-, und Lebenszyklus machen diese Spezies sehr zugänglich für experimentelle Untersuchungen. Darüber hinaus hat die Weiterentwicklung der molekularen Techniken für den Zebrafisch ferner die Verwendung dieser Modellorganismus in der wissenschaftlichen Forschung gefördert. Zum Beispiel, eine große Vielfalt von transgenen Zebrafischlinien erzeugt worden sind, den Krankheitsverlauf zu untersuchen und viele grundlegende Fragen, die die wichtigsten Mechanismen der Entwicklung zugrunde liegen, einschließlich der Organ beantworten. Demzufolge, basierend auf dem dynamischen Verwendung eines Zebrafischs sowohl Erkrankung und des Entwicklungsforschung, Zellmarkierungsmethoden und Quantifizierung Signal sind ein wichtiger Aspekt der Datenanalyse. Während Methoden, die eine Leuchtstoff beschäftigenAntikörpern verwendet werden, um die Proteinexpression in transgenen Zebrafisch erkennen, Forschern der Regel verlassen sich auf Standard-Verfahren wie WISH 12-16, um die raumzeitliche Lokalisierung von Gen-Transkripte in einer festen, nicht-transgenen Zebrafisch-Probe zu untersuchen. In der Tat ist WISH einer der am weitesten verbreiteten Techniken in der Biologie 16, und ist ein wichtiges Werkzeug, um den Phänotyp von genetischen Mutationen und genetischen Störungen chemische Charakterisierung. Dennoch ist WISH mit einer Reihe von möglichen Gefahren und Herausforderungen verbunden. Um die Spezifität des Antisense-ribroprobe bestätigen, können Sinn Ribosonden als Kontrolle, um die Spezifität des Antisense-RNA-Sonde Färbungsmuster Beurteilung verwendet werden. Während die Abschnitte 4 und 5 sind in der Reihenfolge der Kennzeichnung und Erkennung einer Digoxygenin-markierten Sonde, gefolgt von Fluorescein-markierten Sonde präsentiert, kann diese Reihenfolge umgekehrt werden. Typischerweise werden schwächere Signale (Gene mit niedrigeren Expressionsniveaus) am besten mit Digoxygenin-markierten Sonden und diese Färbung nachgewiesenentwickelt, zuerst mit einem violetten Substrat, gefolgt von der Detektion und Färbung des stärkeren Signals (mehr reichlich exprimierten Gens) unter Verwendung des roten Substrat. Jedoch, wenn zwei Farbreaktionen gehen geführt werden soll, empfiehlt es sich, dass verschiedene Kombinationen von Markierungen und Substrate getestet, um die Verfahren, die am besten für die Datenerfassung und-analyse werden. Darüber hinaus können die Zeiten für das Sperren, Antikörper-Inkubation und Waschen in Abschnitten 4-5 sind Embryonen, die jünger als 24 Stunden nach der Befruchtung zugeschnitten vorgesehen; zeitlichen Abständen dieser gleichen Schritte mit älteren Embryonen zu Salzanreicherung auf der Probe führen. Umfangreiche Tipps zur Fehlerbehebung Standard Zebrafischembryo wollen, haben bereits in der Literatur 12-16 dokumentiert. Wohl die häufigste Dilemma ist Hoch Hintergrund. Wir empfehlen die Erhöhung der Anzahl von MABT Waschungen in Schritt 4,7 bis 15-20 wäscht, wenn nötig, aber nach unserer Erfahrung die Zugabe der Nacht MABT &quot;Super-Wash&quot;gibt hervorragende Ergebnisse, wenn bevor Sie zu Schritt 4.8 in Verbindung mit 10 oder mehr kurze MABT Waschungen verwendet. Ein weiteres Beispiel ist schlecht Dilemma Sonde Infiltration, die mit langen Ribosonden auftreten können. Scheren der Riboprobe folgenden Schritt 3.6 durch alkalische Hydrolyse kann dem entgegenwirken. In unserer Erfahrung mit kleinen Proben wird Scher Sonde in der Regel nicht erforderlich. Allerdings sollte man bedenken, dass wie diese können Faktoren werden im Ergebnis eines Experiments WISH-Parameter zu halten, und wir schlagen vor Prüfung dieser nützlichen Anweisungen zur Fehlerbehebung bereits öffentlich in der Gemeinde bei Bedarf zur Verfügung, um die experimentellen Parameter für WISH in Ihrem eigenen zu verfeinern Forschungs 12. Neben den traditionellen Techniken WISH 12-16, hat es eine kontinuierliche Fortschritte in der Entstehung von WISH Methoden und alternative Protokolle, die formuliert wurden. Dazu gehören neue Möglichkeiten der Signalerfassung, beispielsweise durch die Verwendung von FluoreszenzFluoreszenz 17-19, zu Methoden, die die Lokalisierung von microRNAs 20 zu ermöglichen. Auch so, trotz der vielen Verbesserungen, die Stromzelle Markierungsverfahren hergestellt wurden, die Wirksamkeit dieser Verfahren werden negiert, wenn der Fleck (en) kann nicht einfach in der Probe von Interesse zu einem beliebigen Zeitpunkt dargestellt werden. Diese Einschränkung ist problematisch für die Forscher vor allem, wenn es um die frühen embryonalen Stadien der Ontogenese Zebrafisch betrifft, die möglicherweise zu Lücken führen könnte in unserem Verständnis der verschiedenen Entwicklungsprozesse, die zu diesen Zeiten auftreten. Während des normalen Zebrafisch-Entwicklung, wird der Dottersack schrittweise zu verkleinern, wie die Embryo im Alter von 11. Daher wird bei diesen späteren Entwicklungsstadien (&gt; 24 Stunden nach der Befruchtung) ist WISH Färbung relativ einfach zu analysieren, weil der Embryo ist größer im Vergleich zu den angrenzenden Dottersack. Dies ist jedoch nicht der Fall von Schwanzknospenstadium früh Somitogenese (wenn der embryonalenMasse um das Eigelb positioniert), wobei die opake Dottersack kann manchmal verdecken die Visualisierung der Fleck. Folglich ist die Methode der flachen Montage wurde entwickelt, um die Bild-und Datenanalyseprobleme mit der Charakterisierung der frühen Zebrafischembryo Proben (in Fig. 1 und Fig. 2 schematisch dargestellt) verbunden zu lindern, und ist breit, da die systematischen Phänotypisierung von genetischen Mutationen isoliert verwendet von den ersten großen genetischen Bildschirme 21. Seit dem Aufkommen des flachen Befestigungstechnik hat sich die Analyse der frühen Entwicklungsstadien wurde erheblich verbessert. Sobald das Eigelb aus dem Embryo entfernt wird, ist es möglich, den Embryo flach auf einem Glasträger in der gewünschten Orientierung für die Bildgebung zu legen. Dieses zweidimensionale Position ermöglicht das Betrachten des gesamten Embryos auf einmal, wodurch die Notwendigkeit, die Probe zu drehen verhindert. Zahlreichen Geweben sind in breiten Bereichen des Embryos, wie sichdie Vorläufer, die die Blut-und Nieren bilden. Weiterhin kann man brauchen, um mehrere verschiedene Gewebe entwickeln auf einmal vergleichen. Flache Montage ermöglicht die Forscher gleichzeitig betrachten die gesamte Domäne solcher Zellgruppen, und kann somit große Hilfe Quantifizierungen wie einem Flächenmessung für ein Gewebe-oder Zellzahlen. Diese Technik hat sich letztlich dazu beigetragen, führte zu vielen Entdeckungen über eine Vielzahl von wichtigen Entwicklungsmechanismen Hämatopoese, Neurogenese und Organogenese zugrunde liegen. So, einmal gemeistert, die Anwendungen für diese einfache Technik für die Forscher sind ganz erheblich. Zum Beispiel, in einer Studie, Abstammung Wahl während der Hämatopoese, flach montieren Zubereitungen von Zebrafischembryonen bei den 14 und 18 Somiten Stufen (ss) wurden verwendet, um die Änderungen, die in der Expressionsmuster des PU.1 Zinkfinger-Transkriptionsfaktor zwischen aufgetreten veranschaulichen Wildtyp-und GATA1 Morpholino injizierten Embryonen 22.Dieses Verfahren ermöglichte die Detektion eines erweiterten PU.1-Domäne bei 18 ss, die anzeigt, dass GATA1 ist wahrscheinlich die Expression von PU.1 in der Zwischenzellmasse (ICM) um diesen Zeitpunkt. Zusätzliche flach montiert Embryonen für verschiedene erythroid Gene einschließlich gtpbp1 und Epsin gefärbt zeigte einen Verlust in der Expression dieser Gene in vlt Mutanten, die GATA1 waren - / -. Weitere Analysen zeigten keine Veränderung in der Expression von Genen wie erythoid biklf und testhymin, die bekannt waren, unabhängig von gata Aktivität sein. Daher wird in Verbindung mit ihren anderen experimentellen Ergebnissen wurde gezeigt, dass GATA1 wesentlich bei der Regulierung der Differenzierung von Zellen in der erythroiden Abstammungslinie Myelom. In einer Studie der Neuralleiste Entwicklung wurden flache Halterungen verwendet werden, um Crestin Ausdruck in mont blanc untersuchen (mob m610)-Mutanten in einer StudieUntersuchung der Rolle von Mont Blanc und tfap2a Genfunktion 23. Bei 10 und 20 ss, wurde Crestin Ausdruck ganz in den Kopf aufgehoben und wurde im Rumpfbereich der Mob m610-Mutanten im Vergleich zu den normalen Wildtyp-Ausdruck zurück, schließlich Unterstützung bei dieser Gruppe, über die Bedeutung des Mont Blanc und tfap2a Regulierung schließen während Neuralleisteninduktion. Zusätzlich wird in Bezug auf Organ, Flachlager haben die Entdeckung der Anwesenheit von verschiedenen Domänen in den frühen Nierenvorläuferfeld während der Entwicklung des Zebrafisch embryonalen Niere, wie die Pronephros bekannt freigegeben. Die Zebrafischembryo bietet eine konservierte und doch anatomisch einfaches System zu untersuchen, wie Nierenvorläuferzellen führen zu den nephron Funktionseinheiten, die die Pronephros umfassen, ein Verfahren, wie bekannt Nephrogenese 6,7 (Abbildung 4). Wohnung montieren Analyse hat sich als nützlich erwiesen, um Dokument-Domänen der Wiedernal-und Vorläuferzellen, um das Ergebnis von Veränderungen in RA-Signalisierung während Pronephros Strukturieren 6,7 (Abbildung 5), die bisher unbekannt war sezieren. Zusammengenommen deuten diese Beispiele, dass es tatsächlich viele breite Anwendungen für diese Wohnung montieren Protokoll in der Studie der vielfältigen Prozesse, die während der normalen Entwicklung und Krankheitszuständen auftreten. Konzeptionell ist diese flache Halterung Verfahren recht einfach insgesamt. Allerdings können die Manipulationen und der Grad der Finesse erforderlich, um dieses Verfahren beherrschen recht schwer zu meistern in der Abwesenheit von visuellen Demonstration sein. Daher wurde dieses Protokoll erstellt, um Forscher, vor allem diejenigen, die mit dem Zebrafisch-Modell, mit der Möglichkeit, besser zu verstehen, wie diese Technik durchführen und unsere Beratung zu den Reagenzien, Gewebe Handhabung optimieren können. Wir hoffen, dass dieses Protokoll wird letztlich anderen in der Gemeinschaft, die ideale Probenbedingungen zu verfeinern, um used für Premium-Bildgebung, Datenanalyse und Kommunikation der Ergebnisse in Publikationen. Letztlich sollte dies Forschern ermöglichen, die anatomischen Hindernisse des Zebrafisch während der frühen Embryogenese zu überwinden, welche die Darstellung der Versuchsergebnisse verschleiern kann, und lösen diese durch die Verwendung dieser einfachen, aber bedeutende Technik.

Der Zebrafisch, Danio rerio, hat sich ein weit verbreiteter Organismus in der Studie der Entwicklungsbiologie. Zebrafische sind eine tropische, Süßwasser-Wirbeltierarten aus der Familie der Karpfenfische gehören. Zebrafisch wurden ursprünglich für Umweltforschung verwendet, um Informationen über die Gefahren von möglichen Wasserschadstoffe zu gewinnen, da sie leicht zugänglich, kostengünstig und einfach zu behalten 1 waren. In den letzten dreißig Jahren hat der Zebrafisch werden als genetisch manipulierbaren Wirbeltier-Modellsystem für eine Vielzahl von Gründen anerkannt. Zebrafisch zeigen eine hohe anatomische und physiologische Erhaltung mit höheren Wirbeltieren einschließlich Säugetieren 2,3. Jüngsten Genoms Annotation hat ergeben, daß etwa 70% aller menschlichen Gene mindestens eine Zebrafisch-Gegenstück 4. Zum Beispiel haben viele orthologen Gene, die eine wichtige Rolle während der Nierenentwicklung spielen zwischen diesen Arten 5-7 identifiziert worden. Diese dramatic Konservierungsgrad in Bezug auf Zell-und Molekularbiologie konnten die Forscher Modelle für eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen in der Zebrafisch-8 erstellen und Zebrafisch haben ein wertvolles Werkzeug, um potenzielle medikamentöse Therapien identifizieren, mit chemisch-genetischen Screens 9 geworden. Darüber hinaus ist der Zebrafisch-Modell nicht nur in der Lage, eine Vielzahl von komplexen Entwicklungsprozesse und Krankheitszustände, die in den Menschen gesehen werden rekapitulieren, sondern mehrere zusätzliche Attribute seine Attraktivität erhöhen auch als Modellorganismus für embryologische Studien. Zebrafische sind eierlegend und reproduzieren durch Broadcast Laich, die die Forscher mit einfachem Zugang zu den Embryonen vom Beginn der Befruchtung 10 liefert. Weitere Vorteile sind Embryo Größe, Transparenz und eine schnelle, externe Entwicklungs 10. Zusätzlich Zebrafisch Erwachsenen besitzen eine hohe Fruchtbarkeit und erzeugen typischerweise relativ großen Kupplungsgrößen, die zwischen 200 bis 500 liegen kannpro Woche, so dass die Forscher schließlich Hochdurchsatz-Experimenten, wie Phänotyp Chemie Bildschirme, mit Leichtigkeit 9 durchzuführen. Auch so, trotz der Fülle von Vorteilen, die durch die Zebrafisch-Modell gezeigt werden, gibt es Probleme, die mit der Analyse und Kommunikation der von der frühen Entwicklungsstadien erhaltenen Versuchsergebnisse beziehen. In einigen Fällen könnte die inhärente Anatomie des Zebrafischembryos der Visualisierung von Daten von einem zu verschleiern. Nach der Befruchtung der Ausgangszelle durchläuft mehrere Spaltungsereignisse wie die Entwicklung fortschreitet 11. Nach Gastrulation tritt der embryonalen Achse an der Schwanzknospen-Stufe (10 HPF), so daß es um das Eigelb 11 gewickelt. Als weitere Entwicklung schreitet durch die Segmentierung Zeitraum wird der Stamm in der Masse zu wachsen und auch verlängern durch axiale Dehnung, so dass ein Schwanz zusammen mit einem Teil des Dottersacks selbst erstrecken sich von der zentralen Dottermasse11. Zwischen der Schwanzknospe und 20 Somitenstadium (19 hpf), versucht, spezifische Entwicklungsmerkmale nach der Nutzung der verschiedenen Färbemethoden wie WISH zu beobachten, kann eine Herausforderung sein, sowohl aufgrund der Geometrie des Embryos und Deckkraft zu visualisieren und zu fotografieren der Dottersack. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu beseitigen, ist das Eigelb zu entfernen, und dann abzuflachen des Embryos in einem zweidimensionalen Probe, die in einer einfacheren Weise analysiert werden kann. Die folgenden Protokoll-und Video-Ressourcen bieten eine Anleitung, wie Sie erfolgreich deyolk und Flachmontage einen Embryo nach Fixierung und Färbung, am Beispiel von ein oder zwei-Farben-WISH Färbung. WISH ist eine weit verbreitete Technik, die den Nachweis von spezifischen Nukleinsäuren in Präparate ermöglicht und somit erlaubt die Stelle (n) der Genexpression in Geweben festgestellt werden. WISH Techniken sind ausführlich beschrieben und können mit verschiedenen Farbuntergründe sowie geführt werden Grippeorescent Detektionssysteme 12-20. Hier bieten wir unseren für Zebrafischembryonen zwischen den Schwanzknospe und Segmentierung Entwicklungsstadien verwendet modifizierte WISH-Protokoll. Alternative WISH-Protokolle sind jedoch mit der flachen hier beschriebene Montageverfahren kompatibel ist, wie eingangs der unten Protokoll vermerkt. Zusätzlich könnte flache Montage in Verbindung mit einer beliebigen Anzahl von bestehenden Visualisierungstechniken wie whole mount Immunhistochemie oder Zelllinie Spurmarkierungen sind, die in diesem Protokoll beschrieben sind, verwendet werden. Insgesamt kann die Technik der flachen Montage besser ermöglichen eine optimale Analyse und Präsentation von Daten aus Versuchen mit den frühesten Stadien der embryonalen Entwicklung im Zebrafisch erhalten.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 in destilliertem Wasser. Ergänzen Sie mit Methylenblau (1 x 10-5 M) (Sigma M9140), um Kontaminationen zu hemmen.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>50 X E3 in destilliertem Wasser verdünnen.</td></tr><tr><td>Mesh Teesieb</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationsschale für Embryonen</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen mit flachem Boden</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>0,1 % Tween-20-Waschmittel in 1x PBS, hergestellt durch Verdünnen von 10x PBS in destilliertem Wasser.</td></tr><tr><td>Tween-20 Stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>4% PFA (w/v) in 1x PBS auflösen, auf einer heißen Platte in einem Abzug zum Kochen bringen. Aliquots für die Lagerung bei -20 °C kühlen und einfrieren. Kurz vor Gebrauch auftauen und die Bestände nicht wieder einfrieren.</td></tr><tr><td>Filter-Sterilisationseinheit</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>1 L Filtersystem, 0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>CA MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>In destilliertem Wasser auflösen, um Proteinase K-Stamm (10 mg/ml) herzustellen, und Aliquote bei -20 μC lagern.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% Formamid, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/ml Hefe-Torula-RNA, 50 &mu; g/&mu; l Heparin</td></tr><tr><td>DIG/FLU-markierte Ribosonde in vitro Transkriptionsreaktionsreagenzien</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Siehe Herstelleranweisungen.</td></tr><tr><td>SP6 RNA-Polymerase</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA-Polymerase</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA-Polymerase</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>RNase 1 Inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 Inhibitor, 10x DNase 1 Puffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Aliquot von 50 ml Aliquoten aus 100 % EtOH und 70 % EtOH (verdünnt mit Wasser in molekularer Qualität) und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser in molekularer Qualität</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>Modell 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L Formel: In 1,5 l destilliertes Wasser 23,2 g Maleinsäure, 17,5 g NaCl, 55,0 g Trisma-Base mischen, dann 8 ml 1M Tris-HCl pH 9,5 hinzufügen und dann auf 2 l auffüllen.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0,1 % (v/v) Tween-20-Blocklösung</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Wir stellen in 50 ml frischen Aliquoten her: 10 ml BSA (aus 10 % Laborbestand), 5 ml FCS (aus Lager) und 35 ml MABT. Speichern Sie unbenutzten Block bei 4 Grad; C zur Verwendung als Antikörperlösung. Hinweis: Tauen Sie die BSA- und FCS-Bestände bei 37 > C&ndash; Wenn Sie bei einer höheren Temperatur auftauen, werden sie zu einem dicken Gel (nicht verwenden).</td></tr><tr><td>FCS (fetales Kälberserum) lagert</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquot in 5 oder 10 ml Portionen und lagert es bei -20 °C.</td></tr><tr><td>BSA-Stamm (Rinderserumalbumin)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Stellen Sie eine 10%ige in MAB verdünnte Brühe her, indem Sie die BSA-Flocken bei Raumtemperatur unter schnellem Rühren auflösen, dann 10 ml Aliquots bei -20 °C lagern. Lagern Sie ungelöste BSA-Flocken bei 4 °C.</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Antikörper</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Bei 4 &°C lagern.</td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-Antikörper</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Bei 4 &°C lagern.</td></tr><tr><td>12-Well-Färbeschale</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>Vorfärbepuffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween-20. Immer frisch machen: Es wird im Laufe einiger Tage ausfallen.</td></tr><tr><td>Färbelösung-violett</td><td></td><td></td><td>Pro benötigte 10 ml: 45 &#956; l NBT und 35 &#956; l des BCIP in frischen Vorfärbepuffer (wird nicht bei Embryoproben verwendet).</td></tr><tr><td>Färbelösung-rot</td><td></td><td></td><td>Pro benötigte 10 ml: 31,5 &#956; l von INT und 35 &#956; l des BCIP in frischen Vorfärbepuffer (wird nicht bei Embryoproben verwendet).</td></tr><tr><td>NBT Schaft</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Gelagert bei -20 &deg; C; Pulver verdünnt 50 mg/ml in 70 % DMF, 30 % Wasser.</td></tr><tr><td>INT Lager</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Gelagert bei -20 &deg; C; Pulver verdünnt 55 mg/ml in 70 % DMF, 35 % Wasser.</td></tr><tr><td>BCIP Schaft</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Gelagert bei -20 &deg; C; Pulver verdünnt 50 mg/ml in 100% DMF.</td></tr><tr><td>DMF (Dimethylformaldehyd)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0,1 M Glycin, pH 2,2</td></tr><tr><td>Kleine Petrischale aus Kunststoff</td><td>Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinzette Muster #55</td></tr><tr><td>Wimpernwerkzeug</td><td></td><td></td><td>Konstruiert durch Befestigen einer geeigneten Wimper an einer Pipettenspitze (es können Größen von P10-P1000 verwendet werden) mit Sekundenkleber. Wir verwenden eine natürlich abgestoßene menschliche Wimper, einen natürlich abgestoßenen tierischen Schnurrbart oder drahtige Fellhaare oder eine natürliche oder synthetische Wimper, die in der Schönheitsabteilung eines Pharma- oder Einzelhandelsgeschäfts gekauft wurde (extra lange Wimpern eignen sich am besten für eine stabile Befestigung an der Pipettenspitze). Die Pipettenspitze wird zur einfachen Handhabung auf einen geraden Stab (8-10 cm Länge), wie z.B. einen Nadelhalter (z.B., Fisher 08-965-A) geklebt. Siehe Abbildung 3 für Bilder dieser selbstgemachten Werkzeuge.</td></tr><tr><td>Glasschiene</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>Weiß Frost</td></tr><tr><td>Glasdeckglas</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modelliermasse</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Andere Bastelknete Produkte können ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Objektträgerhalter</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Tablett aus Karton zum flachen Aufbewahren von Objektträgern.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Zusammengesetztes Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

wohnung berge vorbereitung für beobachtung und analyse der zebrafisch-embryo proben von bunt ganze berge<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierung

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Die Zebrafischembryo ist jetzt allgemein für die Grundlagenforschung und biomedizinische Forschung verwendet, um die genetische Kontrolle der Entwicklungsprozesse zu untersuchen und zu angeborenen Missbildungen zu modellieren. Am ersten Tag des Lebens, schreitet die Zebrafisch-Embryos durch viele Entwicklungsstadien einschließlich Düngung, Spaltung Gastrulation, Segmentierung und der Organogenese von Strukturen, wie den Nieren, Herz und Zentralnervensystem. Die Anatomie eines jungen Zebrafischembryos zeigt mehrere Herausforderungen für die Visualisierung und Analyse der in vielen dieser Ereignisse beteiligt, da das Gewebe Embryo in Verbindung mit einem Runddottermasse. So ist eine genaue Analyse und Abbildung von experimentellen Phänotypen in festen embryonalen Proben zwischen der Schwanzknospe und 20 Somitenstufe (10 und 19 Stunden nach der Befruchtung (hpf), respectively), wie sie gefärbt mit ganzen mount in situ Hybridisierung (WISH), es Oft ist es wünschenswert, den Embryo aus dem Eigelb zu entfernen balle und zu positionieren, flach auf einem Glasträger. Allerdings Durchführung einer flachen Montageverfahren kann sehr mühsam sein. Daher erfolgreiche und effiziente Flachmontage Vorbereitung ist stark durch die visuelle Demonstration der Präparationstechnik erleichtert und auch mit Reagenzien, die in der optimalen Handhabung Gewebe unterstützen geholfen. Hier bieten wir unseren WISH-Protokoll für ein-oder zweiFarbErkennung der Genexpression im Zebrafischembryo, und zeigen, wie die flache Montageverfahren kann auf diesem Beispiel eines gefärbten fixierten Probe durchgeführt werden. Diese flachen Montage Protokoll ist breit anwendbar auf die Untersuchung von vielen embryonalen Strukturen, die während der frühen Zebrafischentwicklung entstehen, und kann in Verbindung mit anderen Färbemethoden auf fest Embryo Proben durchgeführt umgesetzt werden.

Das flache Befestigungs Protokoll Verfahren beinhaltet Transformation des Zebrafischembryos aus seiner normalen Anatomie, wobei der Körperachse um einen zentral gelegenen Dotterkugel gewickelt, in einer zweidimensionalen Zubereitung (Fig. 1A). Whole mount Abbildung des jungen Zebrafischembryos durch die Art, wie der embryonalen Achse um den Dotter gewickelt beschränkt. Als Ergebnis, Seiten-oder Rückenansichten von ganzen montieren Bunt Embryo Proben können nur einen Teil der Achse oder obskuren bestimmten Geweben (Abbildung 1B) zu erfassen. Im Vergleich deyolking und Abflachung des Embryos kann die gesamte embryonalen Achse, die gleichzeitig (Fig. 1B) dargestellt werden. Diese Einschränkungen werden durch die Untersuchung einer WISH gefärbten Embryos, die mit Antisense-Ribosonden markiert war zu erkennen irx3b (lila), die eine Untergruppe der Nierenvorläuferzellen befinden, durch 13 neben Somiten 7 markiert und MyoD1 (rot), die Etiketten zeigte dieSomiten (Abbildung 1B). Der Bereich der irx3b + Nieren Vorläufern in dem gesamten verdeckt montieren Seitenansicht weil irx3b Transkripte sind reichlich vorhanden in dem Zentralnervensystem, so dass die Nieren Feld praktisch unmöglich, mit der seitlichen Kamerawinkel zu visualisieren; Ferner ist der Bereich der irx3b + Nieren Vorläufer nur teilweise sichtbar ist, wenn der Embryo wird in eine dorsale Ansicht der Kamera gedreht, da der Bereich um den Dotter (1B) gewickelt. , Eine Rückenansicht des gleichen Embryos folgenden flachen Montage ermöglicht es jedoch, den gesamten Bereich der irx3b + Nierenvorläuferzellen, um auf einfache Art und Weise in Bezug auf die Somiten entlang des Rumpfes und anderen embryonalen Strukturen (Abbildung 1B) analysiert werden. So können aufwendige Raum Domains idealerweise mit diesem Verfahren dokumentiert werden. Mehrere große Schritte bei der erfolgreichen Durchführung der flachen Halterung Verfahren beteiligt. Um diese durchführen technique, muss das Eigelb Ball als Erster aus dem Embryo richtige (2A), die mit feinen Instrumenten wie einer feinen Pinzette getan werden kann, während der Embryo mit einem Stereomikroskop sichtbar gemacht werden gelöst werden. Nach der Entfernung des rohen Eigelb Ball wird eine feine Wimpern Werkzeug genutzt, um abkratzen Dotterkörnchen, die der Embryo (2B) befestigt geblieben. Die Entfernung der Restdotterkörnchen hilft, Visualisierung der embryonalen Geweben zu erleichtern. Schließlich wird der Embryo deyolked manipuliert, um es stabil auf einem Glasobjektträger (2C), die Beobachtung und Hilfsmittel Dokumentation der Probe mit Bildverarbeitungssoftware und eine Kamera an das Mikroskop angeschlossen ermöglicht positionieren. Die Peitsche Werkzeuge sind hausgemacht Geräte, die durch das Anbringen eines geeigneten Peitsche mit einer Pipettenspitze mit Sekundenkleber konstruiert werden können, die auf einem Handgriff, wenn gewünscht (3A, Materialien Tabelle) montiert werden kann. Verschiedene Peitsche Proben beschafft zu erzeugenpeitschen Werkzeuge mit leicht unterschiedlichen Eigenschaften in Bezug auf Länge und Verjüngung (3B), die die einzelnen Benutzer unterschiedliche Vorlieben für sobald sie mit der flachen Montageverfahren zu experimentieren beginnen haben. Beispiele für Wimpern Proben umfassen natürlich Schuppen menschlichen Wimpern, natürlich Schuppen Tier drahtige Haar-oder Barthaare und schließlich synthetischen Sorten von kommerziell erhältlichen Wimpern im Einzelhandel Kosmetik-Abteilungen gefunden. Die lokale Umgebung und die Probe (n) auf einem Glasträger (4A) angeordnet enthält, kann für die hochauflösende Analyse abgebildet werden. Eine Kombination von Sonden wurden verwendet, um die Entwicklung von Nierenvorläuferzellen, die Anlass zu der Niere in der Wildtyp-Embryo im frühen Entwicklungsstadien mit zweifarbigen WISH beschriften und dann flach montieren Vorbereitungen wurden durchgeführt, um die Proben (4B, 4C ansehen ). Während der frühen Stadien Somiten sind Nierenvorläuferzellen in einem U-förmigen Muster von th abgegrenzteir Ausdruck pax2a Transkripte (lila), die die paraxiale Mesoderm, die gleichzeitig drückt Delta C (dlc) (rot) (linke Spalte, 4B) 6,7. Im Vergleich dazu, wenn DLC-Transkripte wurden mit einem violetten Substrats nachgewiesen und wurden in Kombination mit dem Hinterhirn Marker Krox20 (rot) markiert, ein rostralen Subdomäne des Nieren Vorläufer wurde sichtbar gemacht, die DLC (rechte Spalte, 4B) exprimiert, wie zuvor angemerkt 6,7. Wohnung montieren Zubereitungen können ähnlich verwendet werden, um später Somitogenese Stufen zu untersuchen. Am 14 Somitenstadium, analysierten wir die Expression von Marker der Nieren pax2a, slc4a4 und SLC12A3 (lila) zusammen mit smyhc1 (rot), die die Somiten (4C) markiert. Diese Kombinationen ermöglichen die Abbildung des gesamten Nierenvorläuferdomäne mit pax2a, während offenbart, dass eine Teilmenge der Zellen in einer rostralen Subdomäne exprEssed slc4a4a und wurden von einem nicht-überlappenden Schwanzdomäne der Nierenvorläuferzellen, die SLC12A3 ausgedrückt aus. Zwei-Farben-WISH und die flache Montage Vorbereitung sind auch wertvoll für die Untersuchung der zellulären Domänen während der Organogenese im Zebrafisch mit genetischen Mutationen oder andere Störungen aus der Umwelt gegenüber kleinen Molekülen 6,7 (Abbildung 5). Die Zebrafisch-Mutanten nls und lib Hafen Mutationen in Aldehyd-Dehydrogenase 1a2 (aldh1a2, früher als raldh2 bekannt), die ein Enzym für die Biosynthese von Retinsäure (RA) erforderlich kodiert. RA ist wichtig für die richtige Entwicklung der Nieren vielen Zelltypen, einschließlich der Bildung von Zellen, die Podozyten, um den Blutfilter der embryonalen Niere, als Glomerulus 6,7 bekannt zu machen beitragen. WISH wurde durchgeführt, um die Vorläuferzellen mit Podozyten wt1a gleichzeitig mit Abgrenzung von T beschriftenentwickelt er Somiten mit smyhc1 und Hinterhirn mit Krox20 in Wildtyp-Embryonen, nls mutierten Embryonen lib mutierten Embryonen und Embryonen mit einem Enzym ALDH chemischer Inhibitor, DEAB (Abbildung 5) behandelt. Embryonen mit mangel aldh1a2 Ausdruck zeigte reduziert wt1a Expression im Vergleich zu Wildtyp-Embryonen, während DEAB-behandelten Embryonen zeigten eine Aufhebung der wt1a Transkripte (Abbildung 5, rechte Spalte). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, wie repräsentativ die flache Halterung Technik kann verwendet werden, um zu analysieren und zu dokumentieren anatomischen Unterschiede mit Präzision im frühen Embryo und damit für wertvolle Entwicklungsstudien implementiert werden kann. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Abbildung 1. Übersicht der flachen Halterung VorbereitungRation für Zebrafisch-Embryonen. A) Das Verfahren des flachen Montage ermöglicht die gleichzeitige Ansicht von Geweben entlang der embryonalen Achse, weil die zentrale Dottermasse wird entfernt und auf einer flachen Oberfläche der Embryo stabil positioniert. B) Bilder einer ganzen montieren wollen Bunt Embryo in Quer-und Rückenansichten und dann nach einer flachen Montagevorbereitung wurde durchgeführt. Der Embryo wurde mit Antisense-Sonden gefärbt, um Gen-Transkripte irx3b (lila) und MyoD1 (rot) kodiert, zu erkennen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung des flachen Montageverfahren für Zebrafisch-Embryonen. A) Der Embryo wird zunächst grob deyolked, um die Mehrheit der Dottermasse zu entfernen, dann (B) die ventrale Oberfläche fein deyolked restlichen Dotterkörnchen zu entfernen, undNach dem Waschen der Embryos (C) montiert Rückenseite nach oben auf einem Glasobjektträger für die visuelle Analyse und / oder fotografische Bildgebung. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Abbildung 3. Fotografien von beispielsweise Wimpern Tools im Vergleich zu feinen Pinzette. A) Peitsche Hausgemachte Werkzeuge wurden neben einer Standard-feinen Pinzette abgebildet, neben einem Lineal, um eine Referenz. B) Vergrößerte Ansicht der Peitsche Werkzeuge neben den feinen Pinzette Verfügung zu stellen, mit dem Referenz Millimeter entlang der oben in der Ansicht bereitgestellt positioniert . Zwei verschiedene Wimpern Werkzeuge angezeigt, mit dem Stern (*) verwendet, um die von Wimpern markieren erhalten ein natürlich Schuppen menschlichen Wimper, und zwei Sternchen (**) verwendet, um eine Peitsche, die aus einer natürlich Schuppen Katzen-Whisker erhalten und getrimmt wurde markiert machen einen etwas stumpfen Ende. In jedem ca.se, die Peitsche wurde durch die Pipettenspitze eingefädelt und mit mehreren Schichten von Sekundenkleber befestigt, um eine starke Dichtung zu stabilisieren / verankern, die Peitsche in die Pipette in ein Handhabungsgerät angebracht zunehmend zu schaffen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Abbildung 4. Charakterisierung der entwicklungsbedingten Veränderungen in der Nierenvorläufer Feld in der Wildtyp-Zebrafisch-Embryos. A) Bewegen schema, der den Bereich für die Analyse in (B, C). B) Wildtyp-Embryonen in der 1, 3 und 5 Somitenstufe wurden durch Zweifarben-WISH gefärbt, um die Zusammensetzung der Nierenvorläuferfeld, gibt beurteilen abzubildenden steigen, um die embryonale Niere oder Pronephros. (Linke Spalte) Transcripts den Transkriptionsfaktor pax2a (in lila gefärbt) kodiert markieren mehrere Populationen im Embryo, einschließlich der Nieren progenitor Feld, das von der Zwischen Mesoderm entsteht. Abschriften der Notch-Liganden dlc Codierung markieren die Somiten, die aus dem paraxialen Mesoderm (rot angefärbt) bilden. (Rechte Spalte) Wenn der Ausdruck der dlc-Transkripte (in lila gefärbt) und dem Hinterhirn Rhombomer Krox20 Marker (rot gefärbt) werden in den gleichen Embryonen untersucht, kann dlc Ausdruck in einer Subdomain rostral der Nierenvorläuferzellen befindet sich neben Somiten beobachtet werden 1-5, die bei der Co-Färbung der dlc mit pax2a. C) Wildtyp-Embryonen im 14 Somitenstadium verdeckt wurde, waren doppelt oder mit einer Kombination aus einem Nierenmarker (lila Dreifach-gefärbt), die Somiten smyhc1 Marker (rot) und das Hinterhirn Rhombomer Marker Krox20 (auch rot). (Top-Panel) In diesem Stadium pax2a Transkripte weiterhin die Nierenvorläuferzellen abzugrenzen. (Middle, Nieder Platten) Im Nierenvorläufer Gebiet, ein rostralen Subdomain ist markiertvon slc4a4 und Abschriften, die SLC12A3 kodieren markieren eine Schwanzdomäne. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Abbildung 5. Die Verwendung von Flach montiert Vorbereitungen, um die Phänotypen durch genetische Mutationen oder chemisch-genetischen Störungen, die Retinsäure Biosynthese modulieren verursacht charakterisieren. WISH Die Expressionsmuster bei den 15 Somitenstadium wt1a (lila) und smyhc1/krox20 (rot) wurde im Vergleich zwischen Wildtypen und Embryonen mit Defiziten in der Retinsäure (RA) Produktion aufgrund von Mängeln in Aldehyd-Dehydrogenase 1a2 (nls und lib-Mutationen) oder chemische Hemmung der Retinaldehyd-Dehydrogenase-Aktivität mit Diethylaminobenzaldehyd (DEAB). Die Reduktion der RA-Produktion in lib ist etwas schwerer als nls, wielib, dass Embryonen zum Ausdruck leicht reduziert Färbung von wt1a Transkripte als ähnlich inszeniert nls mutierten Embryonen, während DEAB Behandlung von Wildtypen ist mit einer kompletten Aufhebung der wt1a Expression assoziiert.

Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gefärbte, fixierte Zebrafischembryonen zu frühen Entwicklungszeitpunkten besser sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem der Zebrafischembryo zunächst mittels Home-Mount in C zwei Hybridisierung gefärbt wird. Danach wird ein Embryo zum Flachpräparat ausgewählt, und ein zentraler Einschnitt in das Eiweiß wird mit einer feinen Pinzette vorgenommen. Anschließend werden Lash-Tools verwendet, um vorsichtig die verbleibenden Eiweißkörnchen abzukratzen und zu entfernen.Schließlich wird das Embryo in Glycerin auf einem Objektträger montiert, um eine geeignete Bildgebung des Präparats zu ermöglichen. Letztendlich erlaubt die flache Einbettung eine bessere Visualisierung gefärbter Embryonen aus dorsaler Sicht, indem der Dottersack entfernt und das Embryo in einer zweidimensionalen Präparation positioniert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Bildgebung intakter Embryonen in jüngeren Entwicklungsstadien, besteht darin, dass durch die flache Einbettung der Dottersack entfernt wird, wodurch das gesamte Embryo sichtbar wird.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Entwicklungsgebiet zu beantworten, beispielsweise die Charakterisierung der Domäne des prärenalen Geschlechtsfeldes in einem Embryo. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da diese Technik ein schonendes Umgangs mit dem Embryo erfordert und zudem die richtige Druckmenge zum Entfernen des Dottersacks erst erlernt werden muss. Diese Prozedur werden meine Kolleginnen Zoe und Amanda sowie ich demonstrieren, die wir Doktorandinnen im Winger-Labor sind.Nachdem Sie die Embryonen gemäß dem Textprotokoll gesammelt, fixiert und gefärbt haben, wählen Sie einen Embryo zur flachen Einbettung mit einem X-P-B-S-T aus. Überführen Sie den Embryo in eine Plastik- oder Glas-Petri-Schale. Anschließend, bei Betrachtung der Schale unter einem Stereomikroskop, verwenden Sie feine Pinzette, um den Embryo so zu rollen, dass eine Seitenansicht entsteht, bei der Kopf- und Schwanzende sichtbar sind.Verwenden Sie anschließend feine Pinzetten, um das Embryo ruhig zu halten, und eine zweite Pinzette, um einen Einschnitt im Eiweiß an einer zentral zwischen Kopf und Schwanz des Embryos gelegenen Stelle vorzunehmen. Entfernen Sie dann mit feinen Pinzetten das Eiweiß aus dem Eizellhohlraum. Spülen Sie mit einer X-P-B-S-T freigesetztes Eiweiß vom Embryo ab, indem Sie ein bis zwei Tropfen XPBS verwenden.Überführen Sie das Embryo auf einen flachen Objektträger. Ziehen Sie das Embryo an den Rand der Pufferlösung, sodass es flach an dem Objektträger anliegt. Während Sie das Embryo fixieren, verwenden Sie ein Wimpern-Tool, um vorsichtig die ventrale Fläche abzukratzen und so die Dottergranula zu entfernen.Falls die PBST-Lösung durch überschüssiges Eigelb verunreinigt wird oder anfängt zu verdunsten, geben Sie ein bis zwei frische Tropfen hinzu und ziehen Sie das Embryo in diesen frischen Puffer. Nachdem das Eigelb zufriedenstellend entfernt wurde, überführen Sie das Embryo vorsichtig zurück in eine Petrischale mit PBST zur endgültigen Spülung. Anschließend überführen Sie das Embryo in eine Petrischale, die 100 % Glycerin enthält, und inkubieren es fünf Minuten lang.Um das Embryo auf einen Objektträger zu montieren, überführen Sie es auf einen sauberen Objektträger. Geben Sie ein bis zwei Tropfen 100 % Glycerin darauf und positionieren Sie das Embryo so, dass die ventrale Dotterseite zum Objektträger weist. Ziehen Sie mit einem Wimpernwerkzeug das Embryo an den Rand des Glycerintropfens, damit es flach anliegend auf dem Objektträger verbleibt.Wenn die embryonale Achse gekrümmt ist, verwenden Sie die feine Pinzette, um vorsichtig kleine Einschnitte im verbleibenden Eigelb vorzunehmen, um die Spannung zu verringern, sodass sie flach positioniert werden kann. Auf dem Objektträger. Platzieren Sie kleine Vertiefungen aus Modelliermasse an den vier Ecken eines 18 mal 18 mm großen Glasdeckgläschens.Platzieren Sie langsam die Deckglasabdeckung auf dem Embryo, wobei das Deckglas angewinkelt werden sollte, um Luftblasen im Glycerin zu minimieren. Geben Sie abschließend einen weiteren Tropfen 100 % Glycerin an die Seite des Deckglases, um den Raum zwischen dem Glas zu füllen und ein Verschieben zu verhindern; zur Bildaufnahme verwenden Sie ein Stereomikroskop oder ein aufrechtes Mikroskop, wie hier gezeigt. Eine Kombination von Sonden wurde zusammen mit einer Zweifarbemarkierung verwendet, um sich entwickelnde renale Vorläuferzellen zu markieren, aus denen die Niere hervorgeht, und die Embryonen wurden in einem frühen Stadium flach eingebettet.So zeigen die Nierenprogenitoren in einem U-förmigen Muster ihre Expression von PAX zwei A-Transkripten, die das pariale Mesoderm umgeben, welches gleichzeitig delta C, dargestellt in Rot, exprimiert. Wenn delta C gemeinsam mit C crox 20 markiert wurde, zeigte sich eine rostrale Teilregion der Nierenprogenitoren, die delta C exprimieren. Die Analyse der Expression von PAX zwei a, SLC vier A vier, SLC 12 A drei und S-M-Y-H-C eins im 14. So-Miten-Stadium ermöglicht die Kartierung des gesamten Nierenprogenitorbereichs mittels PAX zwei A und zeigte, dass eine Teilmenge von Zellen in der rostralen Teilregion SLC vier A vier exprimierte.Das überlappte nicht mit der Coddle-Subdomäne renaler Vorläuferzellen, die SLC12A3 exprimierten. In dieser Abbildung wiesen Embryonen mit Mutationen im Retin-Retaldehyd-Dehydrogenase-2-Gen, das für die Biosynthese von Retinsäure erforderlich ist, oder Embryonen, die mit dem DEAB- und ALDH-Hemmer behandelt wurden, jeweils verminderte oder abgeschwächte Expression von WT1A auf, was zeigt, dass die zweifarbige WISH-Färbung an flachpräparierten Proben wertvoll für die Untersuchung zellulärer Domänen während der Organogenese ist. Bei Zebrafischembryonen mit genetischen Mutationen oder nach chemischer Exposition gegenüber kleinen Molekülen kann diese Technik, einmal beherrscht, bei korrekter Durchführung 10 bis 15 Minuten in Anspruch nehmen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Bildgebung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wo die Grenzen der Nierensegmente liegen. Nach dem Anschauen des Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein gefärbtes Zebrafischembryo flach einbettet, um die gewünschten Strukturen durch Entfernung des Dotters besser sichtbar zu machen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Erfahren Sie die Flat-Mount-Technik für Zebrafisch-Embryonen nach WISH-Färbung zur verbesserten Visualisierung embryonaler Strukturen. Diese Methode ermöglicht dorsale Ansichten für die Entwicklungsbiologie.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge

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