Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, extrazelluläre Vesikel mittels abstimmbarem resistiven Impulssensing zu quantifizieren und hinsichtlich ihrer Größe zu charakterisieren. Die Standardmethode vergleicht Stromblockademesungen, die an gereinigten extrazellulären Vesikeln durchgeführt wurden, mit Messungen an Polystyrol-Perlen-Standards. Ein zweiter Ansatz zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel besteht darin, die Probe mit Polystyrol-Perlen zu versetzen, was angewendet wird, wenn mit komplexen Proben wie ungeklärten extrazellulären Vesikeln gearbeitet wird.

In Zellkulturmedium charakterisieren die resultierenden Daten die Größe und Anzahl der extrazellulären Vesikel, unabhängig davon, ob diese gereinigt oder ungereinigt sind. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber etablierten Verfahren wie der Westernblot-Analyse oder der Durchflusszytometrie von an Latexkügelchen gebundenen extrazellulären Vesikeln liegt darin, dass diese Methode die Partikel direkt in biologischen Flüssigkeiten charakterisiert, ohne dass eine physikalische Isolierung oder Markierung erforderlich ist. In der Regel haben Personen, die neu in der Methode sind, Schwierigkeiten, da die extrazellulären Vesikel hinsichtlich ihrer Größe heterogen sind.

Beim Versuch, die kleineren Vesikel nachzuweisen, können größere Vesikel die Nanopore verstopfen. Wir haben der Anleitung einige praktische Tipps und Tricks hinzugefügt, um schnell wieder brauchbare Bedingungen herzustellen. Wir versuchten, die Produktion extrazellulärer Vesikel zu reduzieren, und benötigten eine Methode, um die Konzentration von Vesikeln in der Zellkultur zu quantifizieren.

Bei der Suche nach Methoden zur Charakterisierung von Nanopartikeln stießen wir auf TRPS und modifizierten dessen Protokolle, um sie besser für die Charakterisierung von Zellkulturüberständen und anderen biologischen Flüssigkeiten geeignet zu machen. Beginnen Sie damit, das TRPS-Instrument mit einem Computer zu verbinden, auf dem die Control-Suite-Software installiert ist. Achten Sie darauf, elektrische Störungen so gering wie möglich zu halten, wie im textlichen Protokoll beschrieben.

Wählen Sie nun die Nanoporengröße aus. Eine NP 100 ist die beste Wahl für Vesikel mit einem Durchmesser von 70 bis 200 Nanometern, während eine NP 150 für Vesikel im Größenbereich von 85 bis 300 Nanometern verwendet werden kann. Eine NP 200 eignet sich besser zur Messung von Vesikeln mit 100 bis 400 Nanometern.

Danach die komplementären Polystyrol-Kalibrierpartikel für die NP 100 und NP 150 auswählen, für die NP 200 die CPC-100-Kalibrierpartikel auswählen. CPC-200-Kalibrierpartikel verwenden. Die Kalibrierpartikel 30 Sekunden vortexen.

Falls sie weiterhin aggregiert sind, verwenden Sie eine Beschallung und verdünnen Sie die Kalibrierpartikel anschließend in PBS auf die Zielkonzentration. Abhängig von der Größe der Nanoporen muss das Endvolumen mindestens 40 Mikroliter betragen. Benetzen Sie nun die untere Flüssigkeitskammer des Instruments, indem Sie 78 Mikroliter PBS auftragen und diese unmittelbar wieder entfernen.

Dadurch wird das Risiko verringert, dass sich Blasen unter dem Nanopore bilden. Anschließend platzieren Sie den Nanopore in den beiden gegenüberliegenden Armen des Instruments. Messen Sie den Abstand zwischen den beiden gegenüberliegenden Armen mithilfe digitaler Messschieber.

Geben Sie diesen Wert in das Feld mit der Bezeichnung Stretch in der Software ein und klicken Sie anschließend mit dem Seitenrad, das den Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen steuert, auf „Calibrate Stretch“. Dehnen Sie das Nanopore auf 47 Millimeter. Sobald die gewünschte Größe erreicht ist, geben Sie erneut 78 Mikroliter PBS in die untere Fluidzelle.

Beginnen Sie den Kalibrierungsprozess, indem Sie die obere Flüssigkeitszelle auf die Nanopore setzen und die Abschirmhaube befestigen. Geben Sie anschließend 40 µL verdünnte Kalibrierpartikel in die obere Flüssigkeitszelle. Wenden Sie nun mindestens 0,8 kPa positiven Druck an.

Wählen Sie mithilfe des Variablen-Druck-Moduls (VPM) eine positive Spannung aus und klicken Sie auf Einschalten. Verringern Sie dann langsam die Dehnung, während Sie den Blockadezustand analysieren. Ereignisse, die durch die Kalibrierpartikel verursacht werden.

Wenn die Streckung abnimmt, steigt die Blockadenhöhe allmählich an, wodurch sich das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert. Eine Erhöhung der Spannung kann die Blockadenhöhe ebenfalls vergrößern, erzeugt jedoch auch mehr RMS-Rauschen. Beenden Sie die Verringerung der Streckung, sobald die beobachteten Blockaden deutlich über dem Hintergrundniveau liegen, wie anhand des Signalverlaufs im Diagrammfenster feststellbar ist.

Zweitens beobachten Sie die Teilchenrate. Dieser Wert hat jedoch eine weniger strikte Grenze. Die Teilchenrate sollte idealerweise mindestens 100 pro Minute betragen.

Wenn jedoch die Teilchenrate höher als 2000 pro Minute ist, verdünnen Sie die Probe und kalibrieren Sie das Gerät erneut. Eine so hohe Rate kann zu ungenauen Messungen bei dieser Demonstration führen. Zuvor gereinigte extrazelluläre Vesikel aus einer Gehirntumorzelllinie werden charakterisiert.

Beginnen Sie damit, die Kalibrierpartikel in die obere Druckzelle des Flüssigkeitszylinders einzubringen. Schalten Sie das Gerät ein, wenden Sie dann mithilfe des VPM Druck an und erfassen Sie hier mindestens 500 Partikel Daten. Es wird ein Druck von 0,8 Kilopascal angelegt.

Optional kann auch eine Mehrfachdruckmessung durchgeführt werden, um dies zu tun, erhöhen Sie den angelegten Druck und nehmen Sie eine zweite Kalibrierungsdatei auf. Die Druckerhöhungen müssen mindestens 0,2 Kilopascal betragen. Entfernen Sie nun die Probe aus der oberen Zelle und spülen Sie die Zelle dreimal mit je 100 Mikrolitern PBS aus. Wischen Sie nach den Spülgängen die obere Flüssigkeitszelle mit fusselfreiem Papier ab.

Fügen Sie als Nächstes die Versuchsprobe hinzu. Der Ausgangsstrom muss innerhalb von 3 % des Stroms liegen, der bei der Messung der Kalibrierpartikel beobachtet wurde. Falls dies nicht der Fall ist, klopfen oder drehen Sie die Abschirmkappe leicht an, setzen Sie den Kolben ein oder entfernen Sie die Nanopore vollständig und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser aus.

Falls der beobachtete Strom gut ist, dieselben Druckverhältnisse anwenden wie bei den Kalibrierungspartikeln. Anschließend mindestens 500 Partikel aufzeichnen und die Datendatei speichern. Falls eine plötzliche Unterbrechung der Partikelerkennung, ein Abfall des Grundstroms oder ein plötzlicher Anstieg des RMS-Rauschens auftritt, die Aufnahme unterbrechen und versuchen, den Nanoporenverschluss zu beseitigen.

Wie zuvor den Probeninhalt mehrmals auf- und abpipettieren. Die Abschirmkappe antippen oder drehen, den Kolben betätigen oder das Nanopore vollständig entfernen und mit entionisiertem Wasser durchspülen. Eine alternative Strategie besteht darin, die Nanoporendehnung auf bis zu 47 Millimeter zu erhöhen und den Druck des VPM etwa fünf Minuten lang zu maximieren.

Dadurch kann das NPO auch in der Software deaktiviert werden. Wechseln Sie zum Reiter „Daten analysieren“ und beginnen Sie mit der Datenverarbeitung, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Option „Unverarbeitete Dateien“ klicken und die Option „Dateien verarbeiten“ auswählen. Um dann die Proben- und Kalibrationsdateien zu koppeln, aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der Probe.

Wählen Sie in der kalibrierten Spalte die entsprechenden Dateien aus und bestätigen Sie. Die Auswahl. Die Software zeigt verschiedene Probeneigenschaften an, wie Größe, Verteilung, Baseline-Dauern, volle Breite, Halbwertsbreiten und Konzentrationsanalysen.

Der folgende Ansatz wird für Proben wie biologische Flüssigkeiten angewendet, die bei Verwendung des Standardverfahrens in der Vorbereitung zu übermäßigen Verstopfungen führen. Zentrifugieren Sie mindestens 50 Mikroliter Zellkultur. Überstand, der die extrazellulären Vesikel enthält, für sieben Minuten bei 300 G. Bereiten Sie außerdem eine Kontrolle mit Medium allein auf die gleiche Weise für Probe und Kontrolle vor. Übertragen Sie 20 Mikroliter des Überstandes in neue Röhrchen und geben Sie 20 Mikroliter PBS sowie 10 Mikroliter verdünnter 335-Nanometer-Polystyrol-Perlen-Stammlösung mit 10 Millionen Perlen pro Milliliter hinzu.

Richten Sie nun das Instrument erneut ein, verwenden Sie eine NP 200 Nanopore und messen Sie die Kontrollprobe, die nur aus Perlen in Medium besteht. Zunächst muss zur Genauigkeit die Hintergrunddetektion kleiner, nicht-perlenartiger Partikel auf weniger als 10 % der Perlen-Detektionen minimiert werden. Messen Sie danach jede Probe einmal, bevor Sie Replikate aufzeichnen.

Dadurch werden die wechselnden Nanoporenbedingungen gleichmäßig auf die Proben verteilt. Jede Probe sollte insgesamt dreimal gemessen werden, wobei am Ende erneut die Kalibrierperle allein gemessen wird. Verwenden Sie später bei der Datenanalyse eine Tabellenkalkulationssoftware, um die Konzentrationsberechnungen durchzuführen.

Ein Beispiel für die Berechnung ist im schriftlichen Protokoll enthalten. Extrazelluläre Vesikel wurden aus dem Zellkulturüberstand von U 87 M-G-E-G-F-R-V-Drei-Zellkulturen durch Ultrazentrifugation angereichert und anschließend mit dem beschriebenen Protokoll unter Verwendung von 115 Nanometer Kalibrierperlen gemessen. Es wurde eine Größenverteilung der extrazellulären Vesikel ermittelt.

Extrazelluläre Vesikel wurden ebenfalls direkt aus dem Überstand von Glioblastom-Zellkulturen quantifiziert, wobei der alternative Ansatz verwendet wurde, bei dem die Probe mit einem Standard versetzt wird. Es wurden zwei Populationen von Nanopartikeln beobachtet. Die kleineren extrazellulären Vesikel und die größeren, bekannten Standardpartikel ermöglichten anhand der Größenschätzung der beiden Populationen im Vergleich zum bekannten Standard die Identifizierung der Vesikelpopulation als größer als 140 Nanometer.

Kleinere extrazelluläre Vesikel hätten möglicherweise mithilfe einer kleineren Nanoporenöffnung nachgewiesen werden können, allerdings wäre die Neigung zu Verstopfungen höher gewesen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie je nach Anzahl der analysierten Proben in ein bis vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Proben möglicherweise an den septalen Anpassungen des Protokolls angepasst werden müssen.

Beispielsweise können Proben, die aus größeren Vesikeln bestehen, die Verwendung größerer Nanoporen bei relativ starker Dehnung erfordern, und die Messungen können durch Filtration oder Zentrifugation der Proben zur Entfernung von zellulärem Trümmermaterial erleichtert werden, das die Nanopore verstopfen kann. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie extrazelluläre Vesikel mittels TRPS charakterisiert werden können. Abhängig von Ihrer Probe an extrazellulären Vesikeln können Sie entweder den Standardprotokollansatz anwenden oder die angepasste Spike-in-Methode verwenden.