Name: Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung und Größenprofilierung extrazellulärer Vesikel mit TRPS für Zellbiologie und Biotechnologie. Diese Methode ermöglicht direkte Messungen in biologischen Flüssigkeiten ohne Isolation.

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1. Standard Operating Protocol 1.1 Einstellungen und Probenvorbereitung <ol><li> Schließen Sie das Gerät an einen Computer mit dem Izon Control Suite-Software installiert. </li><li> Wählen Sie die Nanoporengröße zu verwenden: für die Größe und Konzentrationsmessung von Elektrofahrzeugen ein NP150 (Zielgrößenbereich von 85 bis 300 nm) oder NP200 (Zielgröße Bereich 100 - 400 nm) werden am häufigsten verwendet. Beim Arbeiten mit Elektrofahrzeugen, die isoliert wurden, unter Verwendung eines Protokolls, das die Entfernung von größeren EVs beispielsweise beinhaltet, indem die Probe durch einen 220 nm-Filter, ein Poren NP100 (Zielgrößenbereich von 70 bis 200 nm) verwendet werden. Beim Arbeiten mit Elektrofahrzeugen in einer biologischen Probe oder EVs isoliert mit einem anderen Protokoll kann die NP200 verwendet werden, da es weniger häufig verstopft. Andere Nanoporen wie der NP300 (Zielgrößenbereich von 150 bis 600 nm) oder der NP400 (Zielgröße 200 - 800 nm) oder sogar größer Nanoporen, für größere Arten von Elektrofahrzeugen verwendet werden. </li><li> Wählen Sie die Polystyrol-Abgleichation Teilchen, die im Schritt 1.1.2 ausgewählt Nanopore ergänzen. Für eine NP100, NP150 und NP200 Nanopore verwenden Sie die CPC100, CP100 und CPC200 Partikel auf. Für eine genaue Größenabschätzung, sicherzustellen, dass die Kalibrierung Partikel haben eine ähnliche Größe wie die unbekannten Teilchen. </li><li> Um eine gute Homogenität der Kalibrierungspartikeln Wirbel kurz (30 Sekunden) zu gewährleisten. Optional gelten Beschallung, um Aggregate zu entfernen. </li><li> Verdünne die Eichpartikel in PBS auf die Zielkonzentration in einem Volumen von mindestens 40 ul. Hinweis: Die Zielkonzentration variiert in Abhängigkeit von dem in Schritt 1.1.2 ausgewählt Nanopore basiert. Zielkonzentrationen sind mit den Nanoporen geliefert. </li><li> Anzuwenden und direkt entfernen 78 ul PBS auf der unteren Flüssigkeitszelle; Diese Benetzung der unteren Fluidkammer verringert die Gefahr von Luftblasenbildung unter der Nanopore, wenn die Anwendung eines Elektrolyten auf der unteren Fluidkammer, wenn der Nanopore in Position ist. </li><li> Platzieren Sie die Nanopore auf die Arme 4 des Instruments. Verwendungdie digitale Messschieber, um den Abstand zwischen zwei gegenüberliegenden Armen messen, und geben Sie den Abstand in mm in den &quot;Stretch&quot; Eingabefeld ein und klicken Sie auf &quot;Kalibrieren strecken&quot;, um die Nanoporen-Strecke zu kalibrieren. </li><li> Strecken die Nanopore 47 mm, durch Drehen der Seitenscheibe und somit der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen des Gerätes, bevor Sie das 78 ul PBS in der unteren Fluidzelle. Hinweis: Elektrische Störungen können die Qualität der Messungen wesentlich beeinflussen. Bei Verwendung eines Laptops, um die Izon Control Suite Software ausführen, stellen Sie sicher, dass der Laptop an das Stromnetz mit einer geerdeten Steckdose und Stecker. Mobiltelefon gehalten wird nahe dem Instrument kann auch eine Quelle für elektrische Störungen sein. Elektrische Störungen als ständig wiederholt Spitzen in der Baseline-Strom beobachtet, oft mit Root Mean Square (RMS) Lärm&gt; 10 pA. Hinweis: Fast alle Puffer kann verwendet werden, um die Kalibrierung Teilchen und EVs für trpS CHARAKTERI verdünnenrung. Die Anwesenheit von Salzen ist eine Voraussetzung für die Errichtung eines elektrischen Stroms. EV-Messungen verwenden PBS als Puffer. Kalibrierung Partikel sollten immer in dem gleichen Puffer verdünnt werden, da die Elektrofahrzeuge, um genaue Messungen zu gewährleisten. </li></ol> 1.2. Bestimmen Sie die optimalen Einstellungen für Mess Hinweis: Vor der Aufnahme ist es wichtig, eine optimale Messeinstellungen festzulegen. Die Blockade Größenordnung von einem Teilchen, das durch die Nanopore verursacht ist abhängig von der aufgebrachten Dehnung und der angelegten Spannung. Für zuverlässige Messungen sollte der RMS-Rauschen 0,1 nA &lt;10 pA und der Modus Blockade Größenordnung sollte&gt;. <ol><li> Legen Sie den oberen Flüssigkeitszelle und Schutzkäfig auf der Nanoporen-und einzuführen 40 ul verdünnt Kalibrierung Teilchen in der oberen Flüssigkeitszelle. Verwenden Sie die VPM zu ≥0.8 kPa Überdruck anzuwenden. </li><li> Reduzieren Sie die aufgebrachte Dehnung langsam in Richtung 44 mm, während die Analyse der Ereignisse Blockade durch die Kalibrierung verursachtPartikel. Hinweis: Wenn man den Porendurchmesser die Bewegung von Partikeln durch die Nanopore wird weniger wahrscheinlich, und somit die Partikelgeschwindigkeit abnehmen. Jedoch aufgrund der erhöhten relativen Blockade der Poren einen größeren Blockade Ereignis eintreten wird, was zu verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Erhöhung der Spannung kann weiter die Blockade Größenordnung zu erhöhen, sondern können auch die RMS-Rauschen zu erhöhen. </li><li> Reduzieren Sie die Strecke, bis geeignete Blockade Ereignisse (Abbildung 1c) werden im Bedienfeld &quot;Signal Trace&quot; beobachtet. (Modus&gt; 0,1 nA) und die entsprechende Partikelrate&gt; 100 / min. Anmerkung: Die Partikelgeschwindigkeit eine weniger strenge abgeschnittenen jedoch als Messungen von mindestens 500 Teilchen eignen, werden Partikelgeschwindigkeiten von &lt;100 / min führen Aufzeichnungsdauer von mindestens 5 min. Partikelraten über 2.000 / min in weniger genaue Messungen ergeben (wenn vorhanden, sollte die Probenverdünnung durchgeführt werden). </li></ol> 1.3 Messung der KalibrierungPartikel, Waschen der Uper Fluidzelle und Probenmessung <ol><li> In diesem Abschnitt EVs aus dem Zellkulturüberstand des Glioblastoma multiforme Zelllinie U87-MG / EGFRvIII sind gekennzeichnet. Die Isolierung und Herstellung dieser EVs wurde zuvor beschrieben und visualisiert 18. </li><li> Legen die Eichpartikel in der oberen Fluidzelle. Druck ausüben (zum Beispiel 0,8 kPa) unter Verwendung des VPM und Rekord&gt; 500 Partikel. </li><li> Bei Durchführung einer Multi-Druckmessung, erhöhen Sie den Druck (zum Beispiel auf 1,0 kPa) und nehmen Sie eine zweite Kalibrierungsdatei. Anmerkung: Ein Minimum von 0,2 kPa Differenz erforderlich. </li><li> Entfernen Sie die Eichstichprobe aus der oberen Flüssigkeitszelle. Waschen Sie die obere Fluidkammer 3 mal mit 100 ul PBS, um Restpartikel zu entfernen. Vor der Einführung der Probe in der oberen Flüssigkeitszelle, verwenden fusselfreien Tuch, um restliche PBS von der oberen Flüssigkeitszelle zu entfernen. </li><li> Einführung der Probe in den oberen Fluidzelle. Sicherzustellen, dass die Ausgangsstrom innerhalb 3% beobachtet bei der Messung der Eichpartikel Ausgangsstrom. Wenn nicht innerhalb von 3%, gelten die unten beschrieben, um die Basislinienstrom stabilisieren Strategie. Übernehmen Sie die genaue Druck, um den Eichpartikel aufgebracht und notieren Sie die Beispieldateien. Hinweis: Die Partikelrate Grundstück sollte konstant Partikeldetektion (Abbildung 2a) anzuzeigen. Im Fall einer plötzlichen Unterbrechung der Partikelerkennung, einem plötzlichen Abfall des Ausgangsstroms oder eine plötzliche Zunahme der RMS-Rauschen kann die Poren verstopft werden; damit die Aufzeichnung unterbrochen werden. Um die Grundlinie, tippen Sie auf Wiederherstellung oder verdrehen die Schirmkappe, gelten den Kolben oder vollständig zu entfernen die Nanoporen und waschen Sie es mit VE-Wasser und ersetzen Sie es auf dem Instrument. Hinweis: Alternativ erhöhen die Nanopore Strecke bis 47 mm in Kombination mit maximalen Druck von der VPM für etwa 5 min. </li></ol> 1.4 Datenanalyse <ol><li> Klicken Sie auf &quot;; Registerkarte Analysieren von Daten &quot;, um den Analyseteil der Software geben. Verarbeiten die Kalibrierung und Beispieldateien mit der rechten Maustaste auf das &quot;Unverarbeitete Dateien&quot; und wählen Sie &quot;Dateien verarbeiten&quot;. </li><li> Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben der Probe in der Spalte &quot;kalibrierte&quot; zu koppeln, die Beispieldateien auf der Eichaufnahmen. Wählen entsprechenden Probe und Kalibrierungsdateien und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Hinweis: Wenn Sie die Option Multi-Druckkalibrierung wählen Sie die &quot;Multi-Druck Kalibrierung&quot; Registerkarte auf der linken Seite zu koppeln mehrere Proben auf mehrere Kalibrierungsdateien. </li><li> Einmal erfolgreich gekoppelt, wird der Izon Control Suite Software verschiedene Proben Eigenschaften wie Größenverteilung zeigen (Abbildung 2b), Baseline-Laufzeiten, Halbwertsbreite (FWHM) und eine Konzentrationsanalyse. Optional: Für jede Probe, einzelne Datenpunkte können exportiert werden als kommagetrennte Datei. </li></ol> 2.lternative Protocol - Spick Proben mit Kalibrierungskügelchen Hinweis: In der Regel können die Standard-Betriebsverfahren bei der Arbeit mit isolierten Elektrofahrzeugen verwendet werden. Bei der Arbeit mit nicht-isolierten Elektrofahrzeuge in biologischen Proben, oder isoliert EV Vorbereitungen mit großen Proteinaggregaten kontaminiert ist, mit dem Instrument kann eine Herausforderung sein. Diese Herausforderungen bestehen vor allem aus einer hohen Rate von Nanoporen-Sperrung (plötzlicher Abfall der Ausgangsstrom), die Unfähigkeit, Baseline-Ströme innerhalb von 3% der Kalibrierungsmessung oder signifikante Unterschiede in der Partikelraten zwischen identischen Proben (Abbildung 3a) erholen. Für Proben, die Anzeige dieser Schwierigkeiten ein alternatives Protokoll zu quantifizieren wurde EVs 17 entwickelt. Diese Methodik beruht auf der Einführung von größeren Polystyrol-Kalibrierung Perlen in der Probe von Interesse (Bild 3b). Ein detailliertes Verfahren für diese alternative Protokoll wird unten diskutiert. 2.1. ProbeVorbereitung Hinweis: Bei der Herstellung von Proben mit der alternativen Methode, ist es wünschenswert, einen EV-zu-Wulst-Verhältnis von rund 1. Auch zu etablieren, ist es wichtig, eine &quot;Perle der Kalibrierung nur&quot; umfassen Probe, um eine genaue &quot;Gating&quot; der erlauben Kalibrierungsperlen und die Anzahl der Hintergrundpartikel (zB Proteinaggregate) im Puffer vorhanden bestimmen. <ol><li> Zentrifuge 100 ul Zellkulturüberstand für 7 min bei 300 xg </li><li> Fügen Sie 20 ul der Überstand auf 20 ul PBS und 10 ul 75 fach verdünnt 335 nm Polystyrol-Kügelchen (Aktien 7E10 / ml). </li></ol> 2.2. Probenmessung <ol><li> Verwenden Sie die in Abschnitt 1.2 beschriebene Strategie, um die optimalen Geräteeinstellungen zu bestimmen. </li><li> Messen Sie den &#39;Kalibrationsbeadsets nur &quot;Probe zuerst. Sicherzustellen, dass die Hintergrunderkennung von kleinen nicht-Bead-Partikel so niedrig wie möglich ist (&lt;10% der Kügelchen). </li><li> Messen Sie jeden einzelnen sample einmal vor der Aufnahme repliziert, um Schwankungen in Nanoporen-Bedingungen gleich auf die verschiedenen Proben zu verteilen. Messung mindestens 3 Wiederholungsversuche für jede Probe. </li><li> Wiederholen Sie die &#39;Perle der Kalibrierung nur &quot;Probe nach Beendigung der Aufnahme aller Proben. </li></ol> 2.3. Datenanalyse Hinweis: Bei Verwendung der alternativen Protokoll, hat die exklusive Nutzung des Izon Control Suite Software, die nicht für die Berechnung der Konzentration ausreichen. Zusätzliche Tabellenkalkulationssoftware erforderlich ist. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für die Berechnung der Konzentration der in 3 dargestellten Muster. <ol><li> Öffnen Sie die &quot;Perle Kalibrierung nur&quot; Probe und ein oder mehrere Beispieldateien. </li><li> Bestimmen Sie, welche Blockade Ereignisgröße (in nA) als Cut-off für EVs und Unterscheidung zwischen Polystyrolkügelchen verwendet werden kann. Bestimmung der Blockade Wert (NA) entsprechend dem linken Fuß des Polystyrolkügelchen Population ( <strong&gt; Abbildung 3b). Hinweis: die Gleich Einstellung der bin-Größen aller Messungen (in &#39;ViewSettings &quot;, die durch Klicken auf die&quot; Pop-up &quot;Button&quot; Individuelle Blockade Trace &quot;zugegriffen wird, eingestellt werden). </li><li> Rufen Sie die Werte der Gesamtpartikelzahl für jede Probe, indem Sie auf das &quot;Particle Analysis Summary&quot; Reiter der Probe. </li><li> Filtern Sie die Datensätze mit Hilfe der Cut-Off-Wert in Schritt 2.3.2 bestimmt. durch die Auswahl der &quot;Datenfilterung&quot; Pop-up. Display nur Partikel kleiner als die cut-off. </li><li> Rufen Sie die Werte der EV Zahl für jede Probe aus der &quot;Particle Analysis Summary&quot;. </li><li> Subtrahieren der Menge an Elektrofahrzeugen aus der gesamten Teilchen, die Menge von Kalibrierungsperlen zu bestimmen. </li><li> Bestimmen Sie die EV-zu-Wulst-Verhältnis durch Division EV Zahl durch Kalibrationsbeadsets Zahl. </li><li> Bestimmen Sie die durchschnittliche Hintergrundverhältnis durch Mittelung der Verhältnisse für jede &amp; bestimmt# 8220; Wulst nur &quot;Eichprobe. Ziehen Sie diesen Wert aus jeder einzelnen Probe. </li><li> Multiplizieren Sie die eingestellte EV-zu-Wulst-Verhältnis durch die Konzentration der Kalibrierung Perlen, um die Konzentration von Elektrofahrzeugen für jede Probe zu bestimmen. </li><li> Multiplizieren Sie die Konzentration in Schritt 2.3.9 von der durch die Zugabe von Kalibrierungsperlen auf die Probe eingeführt EV EV Verdünnungsfaktor gefunden. Hinweis: Im Beispiel Probe-Setup, die Gesamt Verdünnung der Probe in PBS und Kalibrierung Perlen ist 2,5-mal und damit die Konzentration in Schritt 2.3.9 wurde, sollten von 2,5 multipliziert, um die Roh-EV Probenkonzentration zu bestimmen. </li><li> Statistiken berechnen, wie die Durchschnittswerte, Standardabweichung und der Standardfehler des Mittelwerts für jede Gruppe von Wiederholungen. Hinweis: In einigen Fällen überlappen zwischen EVs und Stachel Polystyrol-Kügelchen beobachtet. Wenn die Korrektur für die Unterschätzung der EV Konzentration, die erforderlich ist, sollten die Proben ohne Stachel Polystyrol-Kügelchen gemessen werden. Verwenden Sie die gleiche Schneidab, wie in Schritt 2.3.2 entschlossen, einen &quot;Wulst zu EV&quot;-Verhältnis zu bestimmen, um das Verhältnis von Elektrofahrzeugen, die im Bereich der Stachel Polystyrol-Kügelchen fallen zu berechnen. Dieser Wulst-zu-EV-Verhältnis sollte dem EV-zu-Kügelchen-Verhältnis in Schritt 2.3.8 bestimmt zugesetzt werden. </li></ol> 2.4. Optional: EV Größe Verteilung über die alternative Methode. <ol><li> Zweimal öffnen Sie eine Sample-Aufnahme in der Control Suite-Software. </li><li> Stellen Sie die Filtermöglichkeiten von einer der Proben nur aus Teilchen größer als der Cut-off-oben bestimmt. Dies wird die Kalibrierung Partikel nur anzuzeigen. </li><li> Stellen Sie die filtrierte Probe zu &quot;Kalibrierungsdatei&quot; und geben Sie den Modus Größe der Kalibrierung Perlen. </li><li> Koppeln die Beispieldatei und die &quot;Kalibrierung&quot; in Schritt 2.4.3 erstellt, wie in 1.4.2 beschrieben. Die Beispieldatei zeigt nun eine Größenverteilung von beiden EVs und Kalibrierung Perlen auf der Basis der Stachel Kalibrierung Perlen. Hinweis: Die Standard-Operting-Protokoll wird meist genügen für die Bestimmung der Größe-Distributionen von Elektrofahrzeugen. Manchmal jedoch sind exakte Pufferkomponenten unbekannt (zum Beispiel in Plasma oder Urin), die es unmöglich ist, eine Probe der Kalibrierung Perlen in dem gleichen Puffer wie die Elektrofahrzeuge von Interesse vorzubereiten macht. Für EV Größe Schätzung in diesen besonderen Bedingungen kann eine EV Probe mit Partikeln versetzt Kalibrierung verwendet werden. </li></ol>

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Die Entwicklung der skizzierten Protokoll und das Schreiben des Manuskripts wurde finanziell unterstützt, zum Teil, von der niederländischen Gehirn-Stiftung, Schumacher Kramer-Stiftung, und Bohnenn Fund. Produktion von diesem Video-Artikel wurde teilweise durch Izon sponsorted.

Die in diesem Angebot Manuskript Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe EVs mit trpS beschriebenen Protokollen. Die wichtigsten Vorteile der trpS Plattform sind die geringen Stichprobengröße relativ kurze Messdauer und das Fehlen der erforderlichen Probenmanipulation. Voraussetzung für eine genaue Messung ist trpS gleichen Bedingungen zwischen Kalibrierung und Probenmessungen zu halten. Dies umfasst die Verwendung von identischen Puffern sowie identische Geräteeinstellungen, wie beispielsweise Nanoporengröße, Spannung und Druck aufgebracht. Die ursprüngliche VPM fehlt ein Mechanismus für die exakte Einstellung der aufgebrachte Druck, wodurch kleine Unterschiede in der angewandten Druck zwischen den Proben verursacht. Außerdem kann die Verdampfung der Flüssigkeit in der Grundierung VPM geringe Druckdifferenzen zu induzieren, wenn die Messung zu unterschiedlichen Zeitpunkten und das VPM daher oft neu grundiert werden. Diese Einschränkungen haben möglicherweise durch die Einführung des VPM2, gelöst worden, diehat einen Klick-basierte Skalierung und Luftdruck. Die in diesem Manuskript beschrieben alternatives Protokoll ist besonders geeignet für die Messung von EVs in nicht gereinigten biologischen Proben 17. Wir glauben, daß Pufferkomponenten, wie beispielsweise Zucker, Lipide, Proteine ​​und andere Grobschmutz kann in einigen Fällen die Messbedingungen zu viel für das Standardprotokoll beeinflussen anwendbar. Neben der Kalibrierung Perlen auf die Probe und nicht den Vergleich von zwei separaten Messungen führt &quot;Echtzeit-Kalibrierung &#39;. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere bei einem Vergleich Proben (zB Blutplasma von verschiedenen Spendern), die verschiedene und / oder unbekannten Fluidhintergrundgehalte haben. Obwohl die Unterschiede zwischen Elektrofahrzeugen und Polystyrol-Partikel (zB Partikeldichte und Oberflächenladung), theoretische Modelle als auch experimentelle Daten vorhanden sind unterstreichen die Benutzerfreundlichkeit von Polystyrol-Kügelchen für die Quantifizierung und Größe Profilierung von Elektrofahrzeugen,unter der Voraussetzung, dass erhebliche Druck ausgeübt wird, 15,19. Um den Einfluss von elektrokinetische Kräfte zu minimieren, ist die Nutzung der relativ größeren NP150 / NP200 Nanoporen und signifikant positiven Druck geraten. EVs und Kalibrierung Perlen werden nach Größe unterschieden. Folglich hat der Nanopore durch Anlegen Strecke bis zu einem Durchmesser, bei dem Nachweis beider EVs und die größeren Partikel Kalibrierung beobachtet geöffnet werden. Seit der Eröffnung des Poren wird die Empfindlichkeit in Richtung kleinerer Partikel zu verringern, EVS nur größer als eine bestimmte Größe aufgezeichnet (oft EVs&gt; 120 nm bei Verwendung eines 335 nm Kalibrationsbeadsets). Die Nachweisgrenze für Elektrofahrzeuge auf etwa 90 nm verringert werden kann, mit 203 nm Kalibrierung Perlen auf einer NP150 Nanoporen. Dies kann jedoch nicht lebensfähig sein, wenn Setup größeren EVs induzieren häufige Verstopfung der Nanoporen. Das Vorhandensein dieser Behinderung EVs kann die Verwendung einer Einrichtung zwingen, wenn eine Population von EVs, zu klein, um reach die Detektionsschwelle, werden nicht erkannt. Die Schwierigkeit für den Betrieb des Systems erhöht sich, wenn versucht wird, die kleiner als 100 nm Größe zu messen. In solchen Fällen kann der Nachweis durch Erhöhung der Salzkonzentration des Elektrolyten verbessert werden. Eine erhöhte Ionenkonzentration relativ erhöht Blockade Grßen für kleine Teilchen (größeres Signal-zu-Rausch-Verhältnis) zu induzieren. Die Lebensfähigkeit dieser Technik für Messungen von Elektrofahrzeugen muss aber überprüft werden, da erhöhte Salzkonzentrationen kann die Lautstärke von Elektrofahrzeugen beeinflussen. Abschließend kann trpS Plattform für den direkten Quantifizierung und Charakterisierung von Elektrofahrzeugen Größe verwendet werden. Da keine Isolation oder EV Manipulation (Antikörper-Bindungs ​​oder Fluoreszenzmarkierung) erforderlich ist, ist die Plattform für die direkte Quantifizierung EV in biologischen Flüssigkeiten. Eine alternative Protokoll vorgesehen ist, die vorteilhaft für Proben werden kann, wo Pufferkomponenten induzieren signifikante Poren clogging Ereignisse, so dass zuverlässige Nutzung des Standard-Protokoll nicht lebensfähig.

Vesikel aus zellulären Ursprungs sind sehr reichlich in Körperflüssigkeiten 1. Diese sogenannten extrazellulären Vesikeln (EFD) (50 - 1.000 nm in der Größe) werden entweder durch Fusion von Mehr vesikulären Körper mit der Zellmembran oder durch eine direkte außen knospe der Zellmembran gebildet. In den letzten Jahren hat das wissenschaftliche Interesse an Elektrofahrzeugen stark erhöht, was zu einer Fülle von EV orientierte Publikationen, in denen neue Funktionen und Eigenschaften von Elektrofahrzeugen werden beschrieben 1. EVs sind nun angenommen, dass in einer breiten Palette von physiologischen und pathologischen Prozessen wie Signaltransduktion, Immunregulation und Blutgerinnung 1-4 einbezogen werden. Bei Krebs, Elektrofahrzeuge scheinen eine Rolle bei der Bildung von 5,6 premetastatic Nischen, die Übertragung von Pro-Krebs Inhalt 7,8 und Anregung der Angiogenese 8 zu spielen. Daneben werden EVs als Zusteller von Therapeutika 9 erforscht. Trotz dieser deEntwicklungen bleibt zuverlässige Quantifizierung von Elektrofahrzeugen eine Herausforderung. Traditionell sind indirekte Verfahren zur Quantifizierung verwendet, die auf der Bestimmung des Gesamtproteingehalts oder spezifischen Proteinen beruhen. Obwohl allgemein verwendet, müssen diese Techniken nicht für die Protein-per-EV Unterschiede ausmachen, und nicht zwischen gefährdend Proteinaggregate und Proteinen in EVs unterscheiden. Darüber hinaus erfordern diese Techniken Isolierung von Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen einen Vergleich der EV-Konzentrationen in biologischen Proben, nicht möglich ist. Daher werden Anstrengungen unternommen, um neue Methoden, die für mehr präzise und direkte Messung EV 10 erlauben zu entwickeln. Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von einstellbaren Pulswiderstandserkundung (TRP) für eine zuverlässige Quantifizierung und Größe Profilierung der Elektrofahrzeuge. Derzeit ist die qNano Gerät an (Abbildung 1a) ist das einzige kommerziell verfügbare Plattform für trpS. In TRP, punktiert eine nicht-leitende elastische Membran witen einer Nano-Poren trennt zwei Fluidzellen. Einer der Fluidkammern ist mit der interessierenden Probe gefüllt, während die andere Zelle mit partikelfreien Elektrolyten gefüllt. Durch Anlegen einer Spannung wird ein Ionenstrom / elektrischem Strom geschaffen, das bei der Übertragung von Teilchen durch die Poren verändert wird (Abbildung 1b). Die Stärke dieses Stroms Blockade (&quot;resistive pulse&quot;) ist proportional zu dem Volumen des Teilchens 11 (Figur 1c). Die Blockade Dauer kann verwendet werden, um das Zeta-Potential der Teilchen, die auf die Partikeleigenschaften wie Ladung oder die Form 12 verlässt bewerten. Größe Profilierung unbekannter Partikel kann durch Vergleich der Widerstandsimpulse, die durch den unbekannten Teilchen mit den Widerstandsimpulse, die durch Kalibrierung Teilchen mit einem bekannten Durchmesser verursacht geführt werden. Neben der Größe einer Blockade Fall wird die Rate von denen diese auftreten, gemessen. Diese Zählrate relies von der Partikelkonzentration. Da die Konzentration und die Geschwindigkeit der Blockaden linear proportional 13, unter Verwendung eines einzigen Kalibrierungsprobe mit Partikeln bekannter Konzentration und Teilchengrße ermöglicht die Messung der Konzentration 14 und Größenverteilung 11 einer unbekannten Probe. Die Bewegung der Teilchen durch die Nanopore wird elektro kinetisch (elektrophoretische und elektroosmotische) und Fluidkräfte 15 bestimmt. Durch Verwendung der variablen Druckmodul (VPM) eine Druckdifferenz zwischen den Fluidzellen können als zusätzliche Kraft induziert werden. Aufbringen von Überdruck erhöht sich die Strömungsrate der Teilchen, die von Nutzen sein können, wenn die Partikelkonzentration niedrig ist. Auch kann Druck aufgebracht werden, um die Wirkung der elektrokinetischen Kräfte zu reduzieren. Dies ist besonders wichtig bei der Verwendung von Nanoporen mit relativ kleinen Porendurchmesser (NP100, NP150 und NP200 möglicherweise) so oft für den Nachweis von EVs verwendet.Für diese Nanoporen, auch bei der Anwendung erheblichen Druck, die elektrokinetische Kräfte, je nach Partikeloberflächenladung, bleiben nicht vernachlässigbare 16. Durch die Messung der Partikelrate bei Mehrfachbelastungen, ein elektro kinetisch korrigiert und damit genauer, kann EV-Konzentration berechnet werden. Hier werden detaillierte Protokolle bereitgestellt, um die Größenverteilung und Konzentration von Elektrofahrzeugen zu ermitteln. Neben dem regulären Betrieb Protokoll wird ein alternativer Ansatz beschrieben, bei dem Proben mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Größe und Konzentration 17 versetzt. Diese Echtzeit-Kalibrierungsverfahren kann verwendet werden, zu überwinden einige der technischen Probleme auftreten, wenn die Messung EVs direkt in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin, Plasma und Zellkulturüberstand, oder wenn die Stabilität der Nanopore über einen langen Zeitraum der Messzeit kann nicht sichergestellt.

<table><tbody><tr><td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano-Instrument</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Modul mit variablem Druck</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>NP100, NP200</td><td>Die Wahl der Nanopore variiert je nach Zielpartikel. Für unterschiedliche Targetgrößen stehen unterschiedliche Nanoporen zur Verfügung.</td></tr><tr><td>Kalibrierung Partikel</td><td>Izon Science Ltd.</td><td>CPC100, CPC200, CPC400</td><td>Kalibrierpartikel sind in verschiedenen Größen erhältlich.</td></tr><tr><td>Beschallungsbad</td><td>Mehrfach verfügbar</td><td></td><td>Basis-Beschallungsbad ist ausreichend</td></tr> <tr><td>(Mini) Vortexer</td><td>Mehrfach verfügbar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lift-freies Gewebe</td><td>Mehrfach verfügbar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td> <td>Mehrfach verfügbar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows-basierter Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izon Control Suite 2.2</td><td>Izon Science GmbH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tabellenkalkulationssoftware</td><td>Mehrere verfügbar</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung und größe-profilierung der extrazellulären vesikeln mit tunable resistive pulse sensing

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Extrazellulären Vesikeln (EVS), einschließlich &quot;Mikrovesikeln&quot; und &quot;Exosomen&quot;, sind sehr reichlich in Körperflüssigkeiten. Die letzten Jahre haben einen enormen Anstieg der Zinsen in EVs erlebt. EVs sind gezeigt worden, um eine wichtige Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs. Darüber hinaus haben EVs Potential als therapeutische Mittel, beispielsweise als Arzneimittelabgabevehikel oder der regenerativen Medizin. Aufgrund ihrer geringen Größe (50 bis 1.000 nm) genaue Quantifizierung und Größe Profilierung der Elektrofahrzeuge ist technisch anspruchsvoll. Dieses Protokoll beschreibt abstimmbaren Widerstandserfassungsimpuls (TRP)-Technologie unter Verwendung des qNano System kann verwendet werden, um die Konzentration und Größe EVs bestimmen. Das Verfahren, das durch eine Nanoporengröße auf der Detektion von EVs auf ihre Übertragung beruht, relativ schnell ist, reicht die Verwendung von kleinen Probenmengen und nicht PUR erfordernkation und Konzentration von Elektrofahrzeugen. Neben dem regulären Betrieb Protokoll ein alternativer Ansatz beschrieben, unter Verwendung von Proben gespickt mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Größe und Konzentration. Diese Echtzeit-Kalibrierungstechnik kann verwendet werden, um technische Hürden überwunden werden, die auftreten, wenn die Messung direkt EVs in biologischen Flüssigkeiten.

Um trpS Instrument weist eine nichtleitende Nanopore auf die Arme 4 der Maschine (1a) angeordnet werden und eine Spannung (Abbildung 1b) aufgebracht werden. Sobald eine elektrische Ausgangsstrom hergestellt ist, werden resistive Impulse, die durch Partikel, die durch die Pore verursacht erkannt werden, wie in Abbildung 1c veranschaulicht. EVs wurden aus dem Zellkulturüberstand der Glioblastom-Zelllinie U87-MG / EGFRvIII durch Ultrazentrifugation gereinigt. Eine stabile Partikelrate-Grundstück wird beobachtet, wenn die Messung der isolierten Elektrofahrzeuge (Abbildung 2a) auf einem NP100 Nanoporen. Diese stabile Partikelrate-Grundstück ist für eine zuverlässige EV Konzentrationsmessung erforderlich. Nach der Kopplung der EV-Sample-Aufnahme auf einer Aufnahme von 115 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen, eine Größenverteilung (Abbildung 2b) und Konzentration Schätzung der EV-Probe erhalten werden (Daten nicht gezeigt). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; EVs wurden auch direkt in Glioblastomzellkulturüberstand quantifiziert. Bei der Messung von EVs in biologischen Proben, Nanoporenverstopfung führt oft zu Unterbrechungen und / oder Schwankungen in der Partikelrate Parzellen (Figrue 3a). Dies führt zu ungenauen Schätzungen EV Konzentration. Durch Aufstocken der Probe mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Konzentration und Größe kann eine EV-zu-Wulst-Verhältnis bestimmt werden. 3b veranschaulicht die nach Spick Zellkulturüberstand mit Polystyrol-Kügelchen von 335 nm groß erzielten Ergebnisse. Zwei klare Populationen beobachtet. Die Partikel induzieren eine Blockade von weniger als 0,46 nA sind entschlossen EVs, die größeren Partikel bestimmt Polystyrol-Kügelchen. Das Verhältnis von Elektrofahrzeugen zu Polystyrol-Kügelchen, die das Ausgangskonzentration von Elektrofahrzeugen (Tabelle 1) zu berechnen. 3c veranschaulicht die Größenabschätzung der beiden Populationen auf der Basis der Stachel Polystyrol-Kügelchen. Die Nanoporen-Setup verwendet Wiederkonsultiert bei der Erkennung von EVs&gt; 140 nm groß. Dies kann durch Verringerung der Nanoporenöffnung gesenkt werden, jedoch wird dies auch in mehr Verstopfung Ereignissen führen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1: qNano Instrument und Betriebsmodus. (A) Foto des Instruments. Ein Nanopore auf dem Instrument angeordnet ist, Abtrennen eines unteren Flüssigkeitszelle von einem oberen Fluidzelle. Die Fluidzellen werden aus Umwelt elektrische Störungen durch die Schirmkappe (B) Illustration skizziert abstimmbaren Widerstandspulserkennung (TRP) geschützt.. Eine nicht-leitfähige elastische Nanopore zwischen zwei Fluidkammern. Durch Anlegen einer Spannung ein elektrischer Strom durch die Pore in der Nanopore punktiert hergestellt. Als extrazelluläre Vesikel durch die Nanopore bewegen, wird der Ionenstrom verändert und als Widerstandsimpuls erkannt. In trpS die Öffnungsgröße der Nanopore kann durch Strecken der Nanopore, indem der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen des Instruments oder Verringerung dieses Abstandes eingestellt werden (verringert oder erhöht). (C) Ausführungsbeispiel der Widerstandsimpulse. Die Größe eines einzelnen Widerstands Impuls ist proportional zum Volumen des Partikels. Größere Impulse geben größere Teilchen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 2: Partikelanzahl-Grundstück und Größenverteilung von Mess isoliert EVs von U87-MG / EGFRvIII Zellkulturüberstand (A) erhaltenen Partikelzahl-Plot zeigt insgesamt konstanten Partikelerkennung.. Kurze Reduzierung der insbesonle Detektion wurde zwischen 80 und 100 Sekunden der Aufzeichnung beobachtet. Nach Unterbrechung der Aufzeichnung und die Erschließung der Abschirmung Kappe, stabilisierte sich die Partikelrate nach dem wurde die Aufnahme fortgesetzt. (B) Die Größenverteilung der isolierten Elektrofahrzeuge wird nach der Kalibrierung der unbekannten Probe (EVS) bis 115 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen aufgetragen. (5 nm bin Größe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3: trpS Quantifizierung von Elektrofahrzeugen in Zellkulturüberstand mit dem alternativen Protokoll. (A) Typische Partikelrate Parzellen erhalten bei der Messung von Elektrofahrzeugen direkt in einer biologischen Flüssigkeit. Porenverstopfung verursacht kurze Unterbrechungen und Schwankungen in der Rate der Partikelerkennung. JederGrundstück stellt eine Wiederholungsmessung der gleichen Probe. (B) drei Wiederholungsgrößenverteilung Graphen nach Spick Zellkulturüberstand mit 335 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen erhalten. Alle Partikel induzieren eine Widerstands Puls von weniger als 0,46 nA als EVs ausgewählt. (C) Die Stachel Polystyrol-Kügelchen kann eine Größenverteilung der Probe zu erhalten. (5 nm bin Größe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Messung </td><td> Kalibrierung nur # 1 </td><td> Kalibrierung nur # 2 </td><td> Überstand # 1 </td><td> Überstand # 2 </td><td> Überstand # 3 </td></tr><tr><td> Durchschnittsstrom (NA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;td&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Partikelgeschwindigkeit </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> Cutoff verwendet (na) </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td></tr><tr><td> Gesamtpartikel </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Extrazellulären Vesikeln </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> Stachel Kalibrierung Perlen </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> EVs / Kalibrierung Perlen </td><td> 0,01 </td><td> 0,003 </td><td> 0,772 </td><td> 0,788 </td><td> 0,884 </td></tr><tr><td> Probe - Hintergrund </td><td></td><td></td><td> 0,765 </td><td> 0.781 </td><td> 0,877 </td></tr><tr><td> Extrazelluläre Vesikel (10 7) / Ml </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7,29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> Probe 2.5x verdünnt </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Raw Konzentration EVs (10 7) / ml </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20,46 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Beispiel Berechnung des EV-Konzentration mit dem alternativen Protokoll Ein Cut-off-Wert ist entschlossen, EVs von der Kalibrierung Perlen zu unterscheiden. Anschließend kann die Gesamtzahl der EVs und Perlen abgerufen werden. Für jede Messung wird die EV-zu-Kügelchen-Verhältnis berechnet wird. Die Höhe der Hintergrund-Teilchen im Elektrolyten (zB Proteinaggregate) wird durch Mittelung der EV-zu-Wulst-Verhältnis für die einzelnen Messungen der &quot;Kalibrierung Perlen nur&quot; Probe berechnet. Für jede Probe der Hintergrund-Verhältnis von dem erhaltenen Verhältnis subtrahiert. Diese adjusted-Verhältnis wird durch die Konzentration der Kalibrierungskügelchen in der Probe (: 9.33e7 / ml in diesem Beispiel) multipliziert. Um die rohen Konzentration von Elektrofahrzeugen zu ermitteln, wird die erhaltene Konzentration durch die Gesamt EVs Verdünnungsfaktor (2,5 in diesem Beispiel) multipliziert.

Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung.

Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, extrazelluläre Vesikel mittels abstimmbarem resistiven Impulssensing zu quantifizieren und hinsichtlich ihrer Größe zu charakterisieren. Die Standardmethode vergleicht Stromblockademesungen, die an gereinigten extrazellulären Vesikeln durchgeführt wurden, mit Messungen an Polystyrol-Perlen-Standards. Ein zweiter Ansatz zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel besteht darin, die Probe mit Polystyrol-Perlen zu versetzen, was angewendet wird, wenn mit komplexen Proben wie ungeklärten extrazellulären Vesikeln gearbeitet wird.In Zellkulturmedium charakterisieren die resultierenden Daten die Größe und Anzahl der extrazellulären Vesikel, unabhängig davon, ob diese gereinigt oder ungereinigt sind. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber etablierten Verfahren wie der Westernblot-Analyse oder der Durchflusszytometrie von an Latexkügelchen gebundenen extrazellulären Vesikeln liegt darin, dass diese Methode die Partikel direkt in biologischen Flüssigkeiten charakterisiert, ohne dass eine physikalische Isolierung oder Markierung erforderlich ist. In der Regel haben Personen, die neu in der Methode sind, Schwierigkeiten, da die extrazellulären Vesikel hinsichtlich ihrer Größe heterogen sind.Beim Versuch, die kleineren Vesikel nachzuweisen, können größere Vesikel die Nanopore verstopfen. Wir haben der Anleitung einige praktische Tipps und Tricks hinzugefügt, um schnell wieder brauchbare Bedingungen herzustellen. Wir versuchten, die Produktion extrazellulärer Vesikel zu reduzieren, und benötigten eine Methode, um die Konzentration von Vesikeln in der Zellkultur zu quantifizieren.Bei der Suche nach Methoden zur Charakterisierung von Nanopartikeln stießen wir auf TRPS und modifizierten dessen Protokolle, um sie besser für die Charakterisierung von Zellkulturüberständen und anderen biologischen Flüssigkeiten geeignet zu machen. Beginnen Sie damit, das TRPS-Instrument mit einem Computer zu verbinden, auf dem die Control-Suite-Software installiert ist. Achten Sie darauf, elektrische Störungen so gering wie möglich zu halten, wie im textlichen Protokoll beschrieben.Wählen Sie nun die Nanoporengröße aus. Eine NP 100 ist die beste Wahl für Vesikel mit einem Durchmesser von 70 bis 200 Nanometern, während eine NP 150 für Vesikel im Größenbereich von 85 bis 300 Nanometern verwendet werden kann. Eine NP 200 eignet sich besser zur Messung von Vesikeln mit 100 bis 400 Nanometern.Danach die komplementären Polystyrol-Kalibrierpartikel für die NP 100 und NP 150 auswählen, für die NP 200 die CPC-100-Kalibrierpartikel auswählen. CPC-200-Kalibrierpartikel verwenden. Die Kalibrierpartikel 30 Sekunden vortexen.Falls sie weiterhin aggregiert sind, verwenden Sie eine Beschallung und verdünnen Sie die Kalibrierpartikel anschließend in PBS auf die Zielkonzentration. Abhängig von der Größe der Nanoporen muss das Endvolumen mindestens 40 Mikroliter betragen. Benetzen Sie nun die untere Flüssigkeitskammer des Instruments, indem Sie 78 Mikroliter PBS auftragen und diese unmittelbar wieder entfernen.Dadurch wird das Risiko verringert, dass sich Blasen unter dem Nanopore bilden. Anschließend platzieren Sie den Nanopore in den beiden gegenüberliegenden Armen des Instruments. Messen Sie den Abstand zwischen den beiden gegenüberliegenden Armen mithilfe digitaler Messschieber. Geben Sie diesen Wert in das Feld mit der Bezeichnung Stretch in der Software ein und klicken Sie anschließend mit dem Seitenrad, das den Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen steuert, auf „Calibrate Stretch“. Dehnen Sie das Nanopore auf 47 Millimeter. Sobald die gewünschte Größe erreicht ist, geben Sie erneut 78 Mikroliter PBS in die untere Fluidzelle.Beginnen Sie den Kalibrierungsprozess, indem Sie die obere Flüssigkeitszelle auf die Nanopore setzen und die Abschirmhaube befestigen. Geben Sie anschließend 40 µL verdünnte Kalibrierpartikel in die obere Flüssigkeitszelle. Wenden Sie nun mindestens 0,8 kPa positiven Druck an.Wählen Sie mithilfe des Variablen-Druck-Moduls (VPM) eine positive Spannung aus und klicken Sie auf Einschalten. Verringern Sie dann langsam die Dehnung, während Sie den Blockadezustand analysieren. Ereignisse, die durch die Kalibrierpartikel verursacht werden.Wenn die Streckung abnimmt, steigt die Blockadenhöhe allmählich an, wodurch sich das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert. Eine Erhöhung der Spannung kann die Blockadenhöhe ebenfalls vergrößern, erzeugt jedoch auch mehr RMS-Rauschen. Beenden Sie die Verringerung der Streckung, sobald die beobachteten Blockaden deutlich über dem Hintergrundniveau liegen, wie anhand des Signalverlaufs im Diagrammfenster feststellbar ist.Zweitens beobachten Sie die Teilchenrate. Dieser Wert hat jedoch eine weniger strikte Grenze. Die Teilchenrate sollte idealerweise mindestens 100 pro Minute betragen.Wenn jedoch die Teilchenrate höher als 2000 pro Minute ist, verdünnen Sie die Probe und kalibrieren Sie das Gerät erneut. Eine so hohe Rate kann zu ungenauen Messungen bei dieser Demonstration führen. Zuvor gereinigte extrazelluläre Vesikel aus einer Gehirntumorzelllinie werden charakterisiert.Beginnen Sie damit, die Kalibrierpartikel in die obere Druckzelle des Flüssigkeitszylinders einzubringen. Schalten Sie das Gerät ein, wenden Sie dann mithilfe des VPM Druck an und erfassen Sie hier mindestens 500 Partikel Daten. Es wird ein Druck von 0,8 Kilopascal angelegt.Optional kann auch eine Mehrfachdruckmessung durchgeführt werden, um dies zu tun, erhöhen Sie den angelegten Druck und nehmen Sie eine zweite Kalibrierungsdatei auf. Die Druckerhöhungen müssen mindestens 0,2 Kilopascal betragen. Entfernen Sie nun die Probe aus der oberen Zelle und spülen Sie die Zelle dreimal mit je 100 Mikrolitern PBS aus. Wischen Sie nach den Spülgängen die obere Flüssigkeitszelle mit fusselfreiem Papier ab.Fügen Sie als Nächstes die Versuchsprobe hinzu. Der Ausgangsstrom muss innerhalb von 3 % des Stroms liegen, der bei der Messung der Kalibrierpartikel beobachtet wurde. Falls dies nicht der Fall ist, klopfen oder drehen Sie die Abschirmkappe leicht an, setzen Sie den Kolben ein oder entfernen Sie die Nanopore vollständig und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser aus.Falls der beobachtete Strom gut ist, dieselben Druckverhältnisse anwenden wie bei den Kalibrierungspartikeln. Anschließend mindestens 500 Partikel aufzeichnen und die Datendatei speichern. Falls eine plötzliche Unterbrechung der Partikelerkennung, ein Abfall des Grundstroms oder ein plötzlicher Anstieg des RMS-Rauschens auftritt, die Aufnahme unterbrechen und versuchen, den Nanoporenverschluss zu beseitigen.Wie zuvor den Probeninhalt mehrmals auf- und abpipettieren. Die Abschirmkappe antippen oder drehen, den Kolben betätigen oder das Nanopore vollständig entfernen und mit entionisiertem Wasser durchspülen. Eine alternative Strategie besteht darin, die Nanoporendehnung auf bis zu 47 Millimeter zu erhöhen und den Druck des VPM etwa fünf Minuten lang zu maximieren.Dadurch kann das NPO auch in der Software deaktiviert werden. Wechseln Sie zum Reiter „Daten analysieren“ und beginnen Sie mit der Datenverarbeitung, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Option „Unverarbeitete Dateien“ klicken und die Option „Dateien verarbeiten“ auswählen. Um dann die Proben- und Kalibrationsdateien zu koppeln, aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der Probe.Wählen Sie in der kalibrierten Spalte die entsprechenden Dateien aus und bestätigen Sie. Die Auswahl. Die Software zeigt verschiedene Probeneigenschaften an, wie Größe, Verteilung, Baseline-Dauern, volle Breite, Halbwertsbreiten und Konzentrationsanalysen.Der folgende Ansatz wird für Proben wie biologische Flüssigkeiten angewendet, die bei Verwendung des Standardverfahrens in der Vorbereitung zu übermäßigen Verstopfungen führen. Zentrifugieren Sie mindestens 50 Mikroliter Zellkultur. Überstand, der die extrazellulären Vesikel enthält, für sieben Minuten bei 300 G. Bereiten Sie außerdem eine Kontrolle mit Medium allein auf die gleiche Weise für Probe und Kontrolle vor. Übertragen Sie 20 Mikroliter des Überstandes in neue Röhrchen und geben Sie 20 Mikroliter PBS sowie 10 Mikroliter verdünnter 335-Nanometer-Polystyrol-Perlen-Stammlösung mit 10 Millionen Perlen pro Milliliter hinzu.Richten Sie nun das Instrument erneut ein, verwenden Sie eine NP 200 Nanopore und messen Sie die Kontrollprobe, die nur aus Perlen in Medium besteht. Zunächst muss zur Genauigkeit die Hintergrunddetektion kleiner, nicht-perlenartiger Partikel auf weniger als 10 % der Perlen-Detektionen minimiert werden. Messen Sie danach jede Probe einmal, bevor Sie Replikate aufzeichnen.Dadurch werden die wechselnden Nanoporenbedingungen gleichmäßig auf die Proben verteilt. Jede Probe sollte insgesamt dreimal gemessen werden, wobei am Ende erneut die Kalibrierperle allein gemessen wird. Verwenden Sie später bei der Datenanalyse eine Tabellenkalkulationssoftware, um die Konzentrationsberechnungen durchzuführen.Ein Beispiel für die Berechnung ist im schriftlichen Protokoll enthalten. Extrazelluläre Vesikel wurden aus dem Zellkulturüberstand von U 87 M-G-E-G-F-R-V-Drei-Zellkulturen durch Ultrazentrifugation angereichert und anschließend mit dem beschriebenen Protokoll unter Verwendung von 115 Nanometer Kalibrierperlen gemessen. Es wurde eine Größenverteilung der extrazellulären Vesikel ermittelt.Extrazelluläre Vesikel wurden ebenfalls direkt aus dem Überstand von Glioblastom-Zellkulturen quantifiziert, wobei der alternative Ansatz verwendet wurde, bei dem die Probe mit einem Standard versetzt wird. Es wurden zwei Populationen von Nanopartikeln beobachtet. Die kleineren extrazellulären Vesikel und die größeren, bekannten Standardpartikel ermöglichten anhand der Größenschätzung der beiden Populationen im Vergleich zum bekannten Standard die Identifizierung der Vesikelpopulation als größer als 140 Nanometer.Kleinere extrazelluläre Vesikel hätten möglicherweise mithilfe einer kleineren Nanoporenöffnung nachgewiesen werden können, allerdings wäre die Neigung zu Verstopfungen höher gewesen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie je nach Anzahl der analysierten Proben in ein bis vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Proben möglicherweise an den septalen Anpassungen des Protokolls angepasst werden müssen.Beispielsweise können Proben, die aus größeren Vesikeln bestehen, die Verwendung größerer Nanoporen bei relativ starker Dehnung erfordern, und die Messungen können durch Filtration oder Zentrifugation der Proben zur Entfernung von zellulärem Trümmermaterial erleichtert werden, das die Nanopore verstopfen kann. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie extrazelluläre Vesikel mittels TRPS charakterisiert werden können. Abhängig von Ihrer Probe an extrazellulären Vesikeln können Sie entweder den Standardprotokollansatz anwenden oder die angepasste Spike-in-Methode verwenden.

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

Die neueste Generation von EV-Charakterisierungswerkzeugen ist in der Lage, eine einzelne EV-Analyse über mehrere Parameter gleichzeitig durchzuführen. Die Nano-Durchflusszytometrie misst alle biologischen Partikel größer als 45 nm ohne Markierung und identifiziert spezifische Eigenschaften von Subpopulationen durch eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungstechniken.

Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel-Transmembranproteine mittels Nano-Durchflusszytometrie

In diesem Artikel wird eine neue Generation multiparametrischer Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von extrazellulären Vesikel-Untergruppen vorgeschlagen. Die Methode basiert auf einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie, gekoppelt mit Raman-Spektroskopie, um vesikuläre Ziele zu qualifizieren, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind.

Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen

Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Hier demonstrieren wir die Charakterisierungsmethode für extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus biologischen Flüssigkeiten wie Tränen und Speichel von menschlichen Probanden gewonnen wurden. Der bei dieser Methode verwendete Scanner ist in der Lage, den Phänotyp, die Größe und die Gesamtpartikelzahl von EVs aus 1 μl der Probe zu erkennen.

Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Analyse einzelner kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) mittels label-freier, oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), was minimalinvasive Krankheitsdiagnostik und Bewertung von sEVs als therapeutische Verabreichungsmittel ermöglicht.

Erforschung der Anwendung oberflächenverstärkter Raman-Streuung-basierter Biosensierung einzelner sEVs in der Krankheitsdiagnose und -therapie

Raman-Spektroskopie ist eine geeignete Technik für die berührungslose, Label-freie Analyse lebender Zellen, Tissue-Engineering-Konstrukten und nativen Geweben. Quellenspezifische spektralen Fingerabdrücke können generiert und analysiert werden mit multivariaten Analyse.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Lernen Sie die Quantifizierung und Größenprofilierung extrazellulärer Vesikel mit TRPS für Zellbiologie und Biotechnologie. Diese Methode ermöglicht direkte Messungen in biologischen Flüssigkeiten ohne Isolation.

Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

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