Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, extrazelluläre Vesikel mit Hilfe von abstimmbarer resistiver Impulsmessung zu quantifizieren und zu dimensionieren. Der Standardansatz besteht darin, Stromblockademessungen von gereinigten extrazellulären Vesikeln mit denen von Polystyrol-Bead-Standards zu vergleichen. Ein zweiter Ansatz zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel besteht darin, die Probe mit Polystyrolkügelchen zu spießen, was bei der Arbeit mit komplexen Proben wie ungereinigten extrazellulären Vesikeln verwendet wird.

In Zellkulturmedien charakterisieren die resultierenden Daten die Größe und Anzahl der extrazellulären Vesikel, unabhängig davon, ob sie gereinigt oder ungereinigt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Western Blotting oder Durchflusszytometrie von ex-extrazellulären Vesikel, die an Latexkügelchen gebunden sind, besteht darin, dass diese Methode Partikel direkt in biologischen Flüssigkeiten charakterisiert, ohne dass eine physikalische Isolierung oder Markierung erforderlich ist. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Methode sind, Schwierigkeiten haben, da extrazelluläre Vesikel in der Größe heterogen sind.

Beim Versuch, die kleineren Vesikel zu erkennen, können größere Vesikel die Nanopore verstopfen. Wir haben das Protokoll um einige praktische Tipps und Tricks ergänzt, um schnell wieder zu funktionsfähigen Bedingungen zurückzukehren. Wir haben versucht, die Produktion von extrazellulären Vesikeln zu reduzieren und brauchten eine Methode, um die Konzentration von Vesikeln in Zellkulturen zu quantifizieren. Snet.

Auf der Suche nach Methoden zur Charakterisierung von Nanopartikeln stießen wir auf TRPS und modifizierten seine Protokolle, um sie für die Charakterisierung von SLES und Zellkulturen besser geeignet zu machen. S-Überstände und andere biologische Flüssigkeiten Beginnen Sie damit, das TRPS-Instrument an einen Computer anzuschließen, auf dem die Software der Eyes on Control Suite installiert ist. Achten Sie darauf, elektrische Interferenzen zu minimieren, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wählen Sie nun die Nanopore-Größe. Ein NP 100 ist die beste Wahl für Vesikel von 70 bis 200 Nanometern, während ein NP 150 für Vesikel mit einer Größe von 85 bis 300 Nanometern verwendet werden kann. Ein NP 200 eignet sich besser, um Vesikel von 100 bis 400 Nanometern zu messen.

Wählen Sie dann die komplementären Polystyrol-Kalibrierpartikel für den NP 100 und NP 150 aus, wählen Sie CPC 100 Kalibrierpartikel für den NP 200. Verwenden Sie CPC 200 Kalibrierpartikel. Wirbeln Sie die Kalibrierpartikel 30 Sekunden lang durch.

Wenn sie noch aggregiert sind, verwenden Sie Ultraschall und verdünnen Sie die Kalibrierpartikel in PBS auf die Zielkonzentration. Basierend auf der Nanoporengröße muss das endgültige Volumen mindestens 40 Mikroliter betragen. Befeuchten Sie nun die untere Flüssigkeitszelle des Instruments, indem Sie 78 Mikroliter PBS auftragen und sofort entfernen.

Dadurch sinkt das Risiko, dass sich Blasen unter der Nanopore bilden. Setzen Sie dann die Nanopore in die Bügel des Instruments ein. Messen Sie den Abstand zwischen den beiden gegenüberliegenden Armen mit einem digitalen Messschieber.

Geben Sie diesen Wert in die Software unter dem Feld "Dehnung" ein und klicken Sie nach der Eingabe auf "Dehnung kalibrieren" mit dem Seitenrad, das den Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen steuert. Dehnen Sie die Nanopore auf 47 Millimeter. Sobald Sie auf die richtige Größe gedehnt sind, tragen Sie erneut 78 Mikroliter PBS auf die untere Flüssigkeitszelle auf.

Beginnen Sie den Kalibrierungsprozess, indem Sie die obere Flüssigkeitszelle auf die Nanopore setzen und den Abschirmkäfig anbringen. Geben Sie dann 40 Mikroliter verdünnte Kalibrierpartikel in die obere Flüssigkeitszelle. Wenden Sie nun mindestens 0,8 Kilopascal Überdruck an.

Wählen Sie mit dem Modul mit variablem Druck oder VPM eine positive Spannung aus und klicken Sie auf Einschalten. Reduzieren Sie dann langsam die Dehnung, während Sie die Blockade analysieren. Ereignisse, die durch die Kalibrierpartikel verursacht werden.

Wenn die Dehnung abnimmt, nimmt die Blockadehöhe allmählich zu und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert sich somit. Eine Erhöhung der Spannung kann auch die Blockadehöhe erhöhen, aber auch mehr RMS-Rauschen erzeugen. Hören Sie auf, die Dehnung zu reduzieren, wenn die beobachteten Blockaden die Hintergrundwerte entsprechend überschreiten, wie im Signal-Trace-Panel angegeben.

Zweitens, beobachten Sie die Partikelrate. Dies hat jedoch einen weniger strengen Grenzwert. Die Partikelrate sollte idealerweise mindestens 100 pro Minute betragen.

Wenn die Partikelrate jedoch mehr als 2000 pro Minute beträgt, verdünnen Sie die Probe und kalibrieren Sie das Gerät neu. Eine so hohe Rate kann zu ungenauen Messungen für diese Demonstration führen. Zuvor gereinigte extrazelluläre Vesikel aus einer Hirntumorzelllinie werden charakterisiert.

Beginnen Sie mit dem Laden der Kalibrierpartikel in die obere Flüssigkeitszellenpresse. Schalten Sie das Gerät ein, üben Sie mit dem VPM Druck aus und zeichnen Sie hier mindestens 500 Datenpartikel auf. Es wird ein Druck von 0,8 Kilopascal ausgeübt.

Optional kann dazu auch eine Mehrfachdruckmessung durchgeführt werden, um den angelegten Druck zu erhöhen und eine zweite Kalibrierdatei aufzuzeichnen. Die Druckschritte müssen nun mindestens 0,2 Kilopascal betragen, die Probe aus der oberen Zelle entnehmen und die Zelle dreimal mit 100 Mikrolitern PBS pro Waschgang waschen. Wischen Sie nach dem Waschen die obere Flüssigkeitszelle mit fusselfreiem Papier ab.

Fügen Sie als Nächstes die experimentelle Stichprobe hinzu. Der Ausgangsstrom muss innerhalb von 3 % des bei der Messung der Kalibrierpartikel beobachteten Stroms liegen. Wenn nicht, klopfen oder drehen Sie die Abschirmkappe, setzen Sie den Kolben auf oder entfernen Sie die Nanopore vollständig und spülen Sie sie mit Wasser ab.

Wenn der beobachtete Strom gut ist, üben Sie genau den gleichen Druck aus, der auf die Kalibrierpartikel ausgeübt wird. Nehmen Sie dann mindestens 500 Partikel auf und speichern Sie die Datendatei. Wenn es zu einer plötzlichen Unterbrechung der Partikeldetektion, einem Abfall des Ausgangsstroms oder einem plötzlichen Anstieg des RMS-Rauschens kommt, unterbrechen Sie die Aufzeichnung und versuchen Sie, die Nanopore zu verstopfen.

Pipettieren Sie die Probe wie zuvor auf und ab. Klopfen oder drehen Sie die Abschirmkappe, setzen Sie den Kolben an oder entfernen Sie die Nanopore vollständig und waschen Sie sie mit DI-Wasser ab. Eine weitere Strategie besteht darin, die Nanoporendehnung auf bis zu 47 Millimeter zu erhöhen und den Druck des VPM für etwa fünf Minuten zu maximieren.

Da dies auch UNC den NPO in der Software ausstecken kann. Gehen Sie zur Registerkarte "Daten analysieren" und beginnen Sie mit der Verarbeitung der Daten, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Option "Nicht verarbeitete Dateien" klicken und die Option "Dateien verarbeiten" auswählen. Um die Proben- und Kalibrierungsdateien zu koppeln, klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben der Probe.

Wählen Sie in der kalibrierten Spalte die entsprechenden Dateien aus und klicken Sie auf OK. Die Entscheidungen. Die Software zeigt verschiedene Probenmerkmale wie Größe, Verteilung, Basisliniendauer, volle Breite, halbe Maximalwerte und Konzentrationsanalysen an.

Der folgende Ansatz wird für Proben wie biologische Flüssigkeiten verwendet, die mit der Standardmethode zur Vorbereitung zu einer übermäßigen Verstopfung führen, zentrifugieren Sie mindestens 50 Mikroliter Zellkultur. Überstand, der die extrazellulären Vesikel enthält, sieben Minuten lang bei 300 Gs.Bereiten Sie auch eine Kontrolle des Mediums auf die gleiche Weise für die Probe und die Kontrolle vor. Übertragen Sie 20 Mikroliter des Überstands in neue Röhrchen und fügen Sie 20 Mikroliter PBS und 10 Mikroliter verdünntes 335-Nanometer-Polystyrol-Kügelchen mit 10 Millionen Kügelchen pro Milliliter hinzu.

Richten Sie nun das Gerät wie bisher mit einem NP 200 Nanopore ein und messen Sie die Kontrollprobe nur von Kügelchen im Medium. Erstens, um Genauigkeit zu gewährleisten, muss die Hintergrunderkennung von kleinen Nicht-Kügelchenpartikeln auf weniger als 10 % der Kügelchendetektion minimiert werden. Messen Sie nun jede Probe einmal, bevor Sie Replikationen aufzeichnen.

Dadurch werden die fluktuierenden Nanoporenbedingungen auf die Proben verteilt. Jede Probe sollte dreimal in allen Finishs gemessen werden, indem die Probe nur der Kalibrierraupe erneut gemessen wird. Später. Verwenden Sie während der Datenanalyse eine Tabellenkalkulationssoftware, um Konzentrationsberechnungen durchzuführen.

Ein Rechenbeispiel ist im schriftlichen Protokoll enthalten. Extrazelluläre Vesikel wurden aus U 87 M-G-E-G-F-R-V drei Zellkulturen, die durch Ultrazentrifugation überstanden wurden, aufgereinigt und dann unter Verwendung des beschriebenen Protokolls mit 115-Nanometer-Kalibrierkügelchen gemessen. Es wurde eine Größenverteilung für die extrazellulären Vesikel erhalten.

Extrazelluläre Vesikel wurden auch direkt aus dem Glioblastom-Zellkulturüberstand quantifiziert, wobei der alternative Ansatz verwendet wurde, bei dem die Probe mit einem Standard aufgespießt wird. Es wurden zwei Nanopartikelpopulationen beobachtet. Die kleineren extrazellulären Vesikel und der größere bekannte Standard, die Größenschätzung der beiden Populationen auf der Grundlage des bekannten Standards, identifizierten die Vesikelpopulation als größer als 140 Nanometer.

Kleinere extrazelluläre Vesikel könnten mit einer kleineren Nanoporenöffnung nachgewiesen worden sein, aber es hätte mehr Verstopfung gegeben, sobald man sie beherrscht hätte. Diese Technik kann je nach Anzahl der analysierten Proben in ein bis vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass bei den Proben möglicherweise septale Anpassungen des Protokolls erforderlich sind.

Zum Beispiel können Proben, die aus größeren Vesikeln bestehen, die Verwendung größerer Nanoporen bei relativ großer Dehnung erfordern, und auch Messungen können erleichtert werden, indem unsere Zentrifugation von Proben gefiltert wird, um zelluläre Trümmer zu entfernen, die die Nanoporen takten können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie extrazelluläre Vesikel mit TRPS charakterisiert werden können. Abhängig von Ihrer extrazellulären Vesikelprobe können Sie das Standardprotokoll anwenden oder die angepasste Spike-in-Methode verwenden.