Name: Multi-Schritt-Technik zur Vorbereitung mehrere Metabolite Verbindungsklassen für In-Tiefe und Informative Metabolomic Analyse Recover (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Lernen Sie eine mehrstufige Methode zur Metabolitextraktion aus biologischen Flüssigkeiten für die Metabolomik. Diese Technik verbessert die Reproduzierbarkeit und die Abdeckung von Lipiden erheblich.

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Die vorgestellte Tutorial wurde am National Jewish Health durchgeführt und innerhalb der Core Facility Massenspektrometrie entwickelt. Die NJH MS-Anlage wird zum Teil durch CCSTI UL1 TR000154 unterstützt. Finanzierung durch Zuschüsse NIH P20 HL-113445 und R01 HL-095432 auch diese Arbeit unterstützt.

1. Erste Überlegungen, Vorbereitung der Instrumente und Standards <ol><li> Immer Glas zum Speichern (Glaskulturröhrchen, Glasflaschen Autosampler) oder die Übertragung (Glas-Pipetten) Lipide und organische Lösungsmittel. </li><li> Einwirkung aller Lipid Proben und Standards in die Luft. Seal Polytetrafluorethylen (PTFE) Kappen fest an Luft ausgesetzt und Verdunstung zu vermeiden. Unmittelbar resuspendieren getrockneten Lipide in der nächsten Lösungsmittel oder halten sie in einem stetigen Strom von Stickstoff. </li><li> Verwenden Sie 100 ul der Probe. In Fällen, in denen mehr (oder weniger) Probe vorhanden ist, entsprechend anpassen Bände. Doch während der Lipid-Fraktionierung an der NH 2 SPE-Säule, erklärte Volumina müssen bleiben, wie angegeben. </li><li> Schalten Sie Zentrifuge und auf 0 ° C vor der Probenvorbereitung zu beginnen. </li><li> Diese Technik nutzt viele flüchtige Lösungsmittel so halten alle Lösungsmittel bei der Probenvorbereitung begrenzt. </li><li> Bereiten Sie zwei Arten von Standards pro Empfehlung. </li><li> Bereiten Sie eine negative Kontrolle von Stachel-Standards in allen umfasste bei konstanter Konzentration. Dies wird in allen Proben sowie einer Sammelprobe, die als Batch-QC (versetzt Sammelprobe verwendet werden, um die Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung an unterschiedlichen Tagen zu überwachen) und Gerät ist gespickt QC (versetzt Mischproben vorher vorbereitet, Unter aliquotiert und verwendet überwachen Gerätebedingungen / Schwankungen während der Analyse und an unterschiedlichen Tagen). <ol><li> Für Positivkontrollen an 1x, 2x, 4x und Standard-Spikes. Die positiven Kontrollen werden auf alle Proben sowie einer gepoolten Plasmaprobe aufgenommen und werden als Qualitätskontrolle Verbindungen sowohl für die Probenvorbereitung und instrumentelle Analyseschritte zu analysieren und die Unterschiede fache Veränderung während der Datenanalyse verwendet werden, um sicherzustellen, dass alle Aspekte der Vorbereitung und instrumentelle Analyse korrekt durchgeführt wurden. </li></ol></li><li> Shop-Standards bei -20 ° C und Lagerung von Proben bei -80 ° C Bestimmte StandinnenStandards, die nach Langzeitlagerung sind anfällig für Abbau sollte bei -80 ° C gelagert werden </li><li> Dieses Verfahren erfordert die Verwendung von gefährlichen, brennbaren oder flüchtigen Lösungsmittel wie MTBE. Führen Sie alle Schritte in einer Abzugshaube. </li></ol> 2. Interne Standards <ol><li> Wählen internen Standards (ISTD) auf Basis einzelner Projekte und ihre spezifischen experimentellen Designs. Für Körperflüssigkeiten, wie Plasma, BALF oder Urin, isotopenmarkierten istDs, die ähnlich zu denen in der Natur biologisch in diesen Proben gefundenen wäre ideal. Diese würden umfassen, sind aber nicht auf Aminosäuren, Lipide, Hormone oder begrenzt. Für die Pflanzen metabolomic Proben konnten markierten Standards wie Flavonoide, Carotinoide oder verwendet werden. Das gleiche gilt für andere Metabolom-Studien, wobei der Prüfer sollte einen internen Standard, die repräsentativ für die Probe, die analysiert Typ wählen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die gewählte ISTD deckt einen weiten Bereich des Chromatogramms; beispielsweise wenn ter Akquisitionszeit beträgt 20 min, Standards, die alle 5 min zu eluieren verwendet werden könnten. </li><li> Erstellen philen Stammlösungen mit 2 mg / ml unter Verwendung einer Vielzahl von isotopenmarkierten Standards und / oder anderen polaren Verbindungen, die exogen der Probe, die analysiert werden. Von jeder Stammlösung, erstellen Sie eine Lösung in 1:1-Methanol: Wasser mit allen Standards, um einer endgültigen Konzentration von 25 ug / ml Kreatinin-D 3, 100 ug / ml Lysin-D 4 und 200 ug / ml Valin-D 8 . </li><li> Erstellen hydrophoben Stammlösungen mit einer Vielzahl von isotopenmarkierten Standards und / oder andere nicht-polare Verbindungen, die exogen der Probe, die analysiert werden; Lager Konzentrationen von 17.00 Fettsäure (4 mg / ml), 19.01 Fettsäure (4 mg / ml), 17.00 Ceramid (2 mg / ml), 17.00 PE (1,75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml) und Testosteron-D 2 (1 mg / ml). Von jedem Lager, erstellen Sie eine Lösung in 1.01 Chloroform: Methanol mit allen Standards, um eine endgültige Konzentration von 50ug / ml 17.00 Ceramid, 100 ug / ml 15.00 PC, 100 ug / ml Testosteron-D-2, 200 &amp;mgr; g / ml 17.00 Fettsäure, 200 ug / ml 19.01 Fettsäure und 200 ug / 17.00 ml PE in der Standard-Mix. </li><li> Testen des Grads der Ionisation jeder Standard Voraus mit mindestens fünf unterschiedlichen Konzentrationen für jeden Standard, um die Nachweisgrenze, und die Linearität des Instruments für diese Verbindungen zu bestimmen. Die Konzentration der Stammlösung für jedes einzelne Standard wird je nach Versuchsanordnung variieren, und die Konzentration von jedem Standard in der kombinierten Stachel Norm von 20 ug / ml bis 2 mg / ml, je nachdem, wie gut sie ionisieren reichen. </li><li> Erstellen Sie eine Mischung aus Spitzen positive Kontrollen und fügen Sie sie zu den Proben in 1x, 2x, 4x oder Konzentration quantitativ zu überwachen, die Stärke der Probenvorbereitung und der Genauigkeit der instrumentellen Daten. Endgültige Konzentration von positiven Kontrollen könnensein: 2 mg / ml D-Glucose, 100 &amp;mgr; g / ml Alanin-D-3, 200 ug / ml Methylmalonsäure-D 3, 20 &amp;mgr; g / ml Triglycerid-D 5, und / oder andere hydrophobe und hydrophile Standards. Einstellen der Standardkonzentrationen auf der Basis der Empfindlichkeit der für die Analyse verwendet MS-und HPLC-Instrumentierung. </li></ol> 3. Protein Niederschlag <ol><li> Tau-Proben auf RT und Spike 10 ul ISTD zu jeder Probe, wie unten beschrieben. </li><li> Spike 10 ul der beiden hydrophilen und hydrophoben Standardlösungen (aus dem Lager in den Schritten 2.3 und 2.4 erstellt) zu jeder Probe. Stellen Sie die auf der Basis der Empfindlichkeit der für die Analyse verwendet MS und HPLC-Instrumentierung Standardkonzentrationen wie nötig <ol><li> Spike 10 ul entweder 1x, 2x, 4x oder positive Kontrolllösung (aus dem Lager in Schritt 2.6 erstellt) zu jeder Probe. Stellen Sie die auf der Basis der Empfindlichkeit der MS und HP Standardkonzentrationen wie nötigLC-Instrumenten für die Analyse verwendet </li><li> Wirbel jede Probe für 10 Sekunden vor der Protein-Fällungsschritt </li></ol></li><li> Werden 400 &amp;mgr; l eiskaltem Methanol (bei -20 ° C gelagert) zu jeder Probe. </li><li> Vortex für 10 Sekunden pro Röhre. </li><li> Zentrifuge bei 0 ° C für 15 min bei 18.000 x g. </li><li> Übertragen Sie alle den Überstand in ein neues Glaskulturröhrchen, und dann unter N 2 trocken. </li><li> Wenn die Analyse der Proteinpellet-Fraktion, Schritte von 3,8 bis 3,11 gehen. Wenn nicht die Proteinpellet analysieren, gehen Sie zu Abschnitt 4. Hinweis: Die Protein-Pellet kann Verbindungen mit hoher Hydrophobie, die nützlich sein würde, bei der Durchführung von Arzneimittelstudien enthalten 18, Lebensmittelanalysen mit hydrophoben Flavonoide 19 oder Metabolom-Studien zu Krankheiten, bei denen sehr hydrophoben Verbindungen akkumulieren, wie neuronale Ceroid-Lipofuszinosen 20 und lysosomale Lipidspeicherbezogenen 21 Erkrankungen. </li><li> 1 ml MTBE zu ter weiß (oder weiß) Proteinpellet, Vortex für 30 Sekunden pro Röhrchen, dann bei 0 ° C zentrifugieren für 15 min bei 18.000 x g. Dekantiert die MTBE-Schicht auf eine neue Glaskulturröhrchen. Dies ist ein wichtiger Schritt, da Fehler hier wird drastische Auswirkungen auf Ergebnisse (siehe Abbildung 5 in repräsentative Ergebnisse). <ol><li> Konsequent abzusaugen die gleiche Menge an MTBE für alle Proben, da die Größe des Pellets wird unter den Proben variieren. Deshalb, wenn nur 900 ul für die Probe mit der geringsten Menge an Überstand dekantiert, dann dekantiert 900 ul für alle Proben. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 3,9, und verbinden die organische Schicht auf dem gleichen Glaskulturröhrchen in Schritt 3.7 vorbereitet. </li><li> Trockene Proben von N 2-Strom und Resuspension in 200 &amp;mgr; l von 1:1 Chloroform: Methanol. Vortex kurz. </li><li> Übertragen in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 0 ° C für 15 min bei 18.000 g, dann Überstand in Schraubverschluss Fläschchen Autosampler mit GlasPipetten. </li></ol> 4. Flüssig-Flüssig-Extraktion <ol><li> Mit einer Glaspipette, 3 ml MTBE auf die getrocknete Rest Methanol (aus Kapitel 3, Schritt 6), Vortex 30 Sek., fügen Sie 750 ul Wasser, dann Wirbel 10 Sek. pro Röhre. </li><li> Spin ~ 200 g für 10 min in einer Zentrifuge bei RT. </li><li> Saugen Sie 2,5 ml der MTBE-Schicht (ohne zu Wasser) und die Übertragung auf eine saubere Glaskulturröhrchen. Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt, da hier Unterschiede werden die Ergebnisse beeinflussen. 2,5 ml MTBE sorgfältig von der oberen Schicht dekantiert werden, weil es ein festes Volumen ohne Pipettieren der wässrigen Schicht unter dekantiert werden. Wenn das Volumen der Probe zu Beginn des Experiments weniger als die angegebenen 100 ul für dieses Verfahren, skaliert das Volumen des MTBE proportional spiegeln diese Ausgangsprobenvolumens. </li><li> 3 ml MTBE zu dem verbleibenden Teil der Wasserprobe und Wirbel 10 sec pro Röhrchen. </li><li> Spin ~ 200g für 10 min in der Zentrifuge bei RT. </li><li> Saugen Sie 3 ml MTBE (ohne sich Wasser) und verbinden sich mit MTBE Röhre. </li><li> Konzentrieren des verbleibenden wässrigen Schicht durch Trocknen unter N 2. </li><li> Resuspendieren Rückstand in 100 ul Wasser. </li><li> In 400 ul eiskaltem MeOH an die Glaskulturröhrchen, Vortex kurz, und dann übertragen auf Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Lassen Sie bei -80 ° C für 20-30 min. Spin bei 0 ° C für 15 min bei 18.000 x g. Anmerkung: Es wird empfohlen, die gesamte Probenträger in einem -80 ° C Gefrierschrank platzieren, da dies ermöglicht verbleibende Protein in der Methanol ausfällen. Wenn eine -80 ° C-Gefrierschrank nicht verfügbar ist, sind weitere Optionen: Lagerung bei -20 ° C, indem die Proben auf Trockeneis, oder halten sie in einem Eimer Eis. Es ist wichtig, die Proben in einer kalten Umgebung und bei gleicher Temperatur konstant zu speichern, um Präzipitation zu erlauben. </li><li> Saugen Sie 450 ul des Überstandes und Übergabe anein sauberes Reaktionsgefäß. Trocknen in einem Vakuum Zentrifugenkonzentrator bei nicht mehr als 45 ° C (Gehzeit: ca. 1-2 h). </li><li> Resuspendieren getrocknete Überstand in 200 &amp;mgr; l von 5% Acetonitril / Wasser. Vortex kurz. Einfrieren bei -80 ° C </li></ol> 5. Festphasenextraktion <ol><li> Trocknen der MTBE-Fraktion unter Stickstoff bei 35 ° C mit einer guten Fluss von Stickstoff (dauert etwa 10-15 min). </li><li> Wenn vollständig trocken, stoppen Sie den Stickstoffstrom und schnell wieder zu suspendieren in 1 ml Chloroform (CHCl 3) mit einer Glaspipette. Vortex kurz. Hinweis: Lösungsmittel wie CHCl 3 haben niedrige Viskosität. Während Pipettieren, verursacht geringe Oberflächenspannung Lösungsmittelverlust aus der Pipette. Es wird empfohlen, dass die Pipettenspitze mindestens zweimal vorbenetzt werden, um ein Gleichgewicht zwischen dem Lösungsmittel ist pipettiert und der Raum in der Pipette zu ermöglichen. Eine gasdichte Spritze kann, wenn sie verfügbar werden. </li><li> Richten Sie eine SPE Vakuum Manifold und NH 2 </sub&gt; SPE-Säulen für die Fraktionierung. </li><li> Warm Proben auf RT und halten Sie immer unter einem stetigen Strom von N 2 aufgehängt. Erwärmen auf RT wird Lipid Aufwirbelung zu ermöglichen und der Stickstoff-Oxidation und Polymerisation von Lipiden zu verhindern. </li><li> Wash und Zustand SPE-Kartusche mit 2x 400 ul Hexan. Entsorgen Sie Abfälle und durch neue Glassammelröhrchen. </li><li> In Probe SPE-Säule, sammeln durch fließen in Glasröhrchen. </li><li> Mit Glaspipette 1 ml von 2:1 CHCl 3: IPA, sammeln durch fließen in derselben Glasröhren (das ist die neutrale Fraktion). </li><li> Trocknen der Neutralfraktion unter N 2-Oxidation (dauert etwa 10-15 Minuten) zu minimieren. </li><li> Mit Glaspipette 1 ml 5% Essigsäure in Diethylether, sammeln durch fließen in neue Glasröhren (das ist die Fettsäure-Fraktion). </li><li> Trocknen der Fettsäurefraktion unter N 2 auf Oxidation (dauert etwa 10-15 Minuten) zu minimieren. </li><li> Verwenden Sie Plastikspitzen bis 800 hinzufügen und# 181; l Methanol SPE-Kartusche, und sammeln Durchströmung in 15 ml konischen Kunststoffröhrchen (das ist die Phospholipid-Fraktion). </li><li> Übertragen Phospholipidfraktion in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Trocknen der Proben mit einer Vakuum Zentrifugenkonzentrator bei 45 ° C (Dauer ca. 1-1,5 h). </li><li> Resuspendieren jeder der Proben aus den drei Fraktionen in 200 &amp;mgr; l 100% igem Methanol, Wirbel und Transfer auf Phiolen Schraubverschluss zum Speichern Autosampler. </li></ol> 6. Probenlagerbedingungen <ol><li> Speichern Sie alle Proben bei -80 ° C bis bereit für Instrumentenanalyse. Hinweis: Die extrahierten Proben, in einem organischen Lösungsmittel rekonstituiert kann bei -20 ° C gelagert werden Dies wird jedoch nicht empfohlen, da potenzielle Metaboliten von Interesse wird bei dieser Temperatur verschlechtern. Lagerung in flüssigem Stickstoff wird auch nicht empfohlen, da Forscher haben Kontamination Ausgaben, Sonder-Speicherflaschen benötigt werden gemeldet, und es ist der Mangel an Homogenität in der Kammer causingen großen Temperaturschwankungen. </li><li> Wenn Probenvolumina sind klein (&lt;100 ul), verwenden Sie Einsätze in den Fläschchen auf Lösungsmittelverdampfung im Kopfraum während der Lagerung zu verhindern. </li><li> Vermeiden Frost der Proben. Tauen die Proben nur einmal, kurz vor der instrumentellen Analytik. Wiederholtes Einfrieren-taut führen Probe-Abbau. </li></ol> 7. Liquid Chromatography AGB <ol><li> Benutzen Sie einen C-18 2,1 mm x 50 mm (1,8 um) analytischen Säule mit einem C-18 2,1 mm x 12,5 mm (5 um) Schutzsäule, die hydrophobe Fraktion zu analysieren. </li><li> Stellen Sie die Temperatur auf 4 Autosampler &#160; ° C, die Kolonnentemperatur auf 60 &#160; ° C, die Einspritzmenge zu 2 ul und der Strömungsrate auf 0,25 ml / min. </li><li> Verwenden Sie 0.1% Ameisensäure in Wasser für mobile Phase A und 0,1% Ameisensäure in Isopropanol: Acetonitril: Wasser (60:36:4) für mobile Phase B </li><li> Führen Sie den folgenden Gradientenelution Profil: Einent 30% B und Erhöhung auf 70% B 0-1 min, dann auf 100% zu erhöhen B von 1 bis 15 min und halten Sie für 5 min, gefolgt von 5 min 10% B und 5 Wasch min nach Sicht. </li><li> Verwenden Sie eine HILIC 2,1 mm x 50 mm (2,6 um) analytischen Säule mit einer Wache Spalte, um die hydrophile Fraktion zu analysieren. </li><li> Stellen Sie die Temperatur auf 4 Autosampler &#160; ° C, die Kolonnentemperatur auf 20 &#160; ° C, die Einspritzmenge zu 2 ul und die Fließgeschwindigkeit auf 0,5 ml / min. </li><li> Verwenden Sie 50% Acetonitril in 10 mM Ammoniumacetat, pH 5.8 für mobile Phase A, und 90% Acetonitril in 10 mM Ammoniumacetat pH 5,8 für mobile Phase B </li><li> Führen Sie den folgenden Gradientenelution Profil: bei 100% B 0-2 min Start, dann auf 50% zu verringern B 2 bis 15 min, gefolgt von 5 min 0% B Waschen und 10 Minuten nach der Flucht. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Ein Ziel der klinischen Studien ist es, metabolomic Veränderungen im Metabolom, um Krankheiten oder Behandlungen im Zusammenhang zu identifizieren. Daher müssen Probenvorbereitungstechniken robuste, konsistente und vom Techniker bis zum Techniker und von Labor zu Labor 22 übertragbar zu sein. Die resultierenden Daten braucht, um Vertreter der Probe sein und identifiziert Veränderungen brauchen, um die Probe gesetzt, anstatt die Probenvorbereitung Fehler zu reflektieren. Deshalb genaue Pipettieren, richtige Temperatur, effiziente Umfüllen von nicht mischbare Schichten, Trocknen unter Stickstoff, und die Verwendung der gleichen Marken und Größen von Glaswaren und Tipps sind erforderlich. Während der Protein-Fällungsschritt, ist es entscheidend, dass die gleiche Menge der Lösung wird aus jedem Pellet dekantiert. Dies reduziert die Volumenänderung reduziert und als solche Variation in Beispieldaten. Diese Proteinfällung Schritt ist für Metabolom-Studien notwendig und können nicht übersprungen werden, da es entfernt Protein ausDie Proben vor der kleinen Moleküls Profilanalyse an dem Massenspektrometer. Es beseitigt Krankheitserreger und große Makromoleküle und löst gebundene Metaboliten von Proteinen 7. Mangel an Protein-Akkumulation in den Proben erweitert die HPLC-Säule, die Lebensdauer und erhöht die Genauigkeit und die Qualität der Ergebnisse. Fig. 5 ist eine Darstellung der Proteinpellet gebildet ist bei der Durchführung dieser Technik auf Plasmaproben. Dies ermöglicht die Erfassung von kleinen Molekülen, erhöht Ionenfluss und verringert Matrixeffekte von Proteinen in der Probe. Da außerdem angenommen wird, daß alle Proteine ​​sind in diesem Schritt entfernt, die Aminosäuren, die während der LC-MS-Analyse nachgewiesen werden würde von metabolischen Veränderungen statt von Proteinabbau stammen. Die Flüssig-Flüssig-Extraktionsschritt ist kritisch, da sie die hydrophilen und hydrophoben Metaboliten in zwei nicht mischbare Lagen trennt. Fig. 6 zeigt die LLE Verfahren und eine repRÄSENTATION der LLE-Schicht. Eine fehlerhafte Trennung der beiden Schichten führt zu Metaboliten entweder verloren gehen oder in beiden Fraktionen eluiert. Sorgfältige Anwendung dieses Schritts wird die Anzahl von hydrophilen Verbindungen, die in der hydrophoben Fraktion erscheinen. Die Ergebnisse für diese Verbindungen unzuverlässig, da nicht festgelegt, welche Fraktion die repräsentativen Ergebnisse enthält werden. Wenn es richtig gemacht wird Metabolit Überlappung reduziert. Einen oxidativen Abbau zu verhindern, insbesondere in Lipid sondern auch kleine Moleküle, die Thiolgruppen enthalten kann, zum Beispiel, hat Einwirkung von Sauerstoff auf ein Minimum gehalten werden. Daher ist dieses Verfahren immer unter Stickstoff, ausgeführt zu reduzieren / verhindern die Oxidation von Lipid-oder Thiolgruppen enthaltende Verbindungen. Darüber hinaus ist die Übertragung der Probe und / oder-Lösung (in der ersten Minute) schnelle um die Sauerstoffsättigung zu reduzieren, dann Proben werden schnell unter einem stetigen Strom von Stickstoff zum Trocknen nach unten. Einmal getrocknet, sind sie sofortfort durch 100% Methanol für den oben diskutierten Gründen resuspendiert. Laboratories kann von diesem umfassenden Verfahren in eine Reihe von Möglichkeiten zu profitieren; Forscher schauen, um eine Klasse von Verbindungen isolieren können den Teil des Verfahrens, die ihren Bedürfnissen am besten passt. Diejenigen, die nur eine Proteinfällung durchzuführen, um einen Pool von Metaboliten zu erhalten, kann dies tun. Wenn hydrophile Metaboliten gewünscht sind, wie viele pharmazeutische Wirkstoffe, Aminosäuren und Zucker, oder wenn nur hydrophobe Metaboliten gewünscht sind, wie Triglyceride, Epoxiden, fettlösliche Vitamine und Phospholipide beispielsweise dann können Forscher die Flüssig-Flüssig-Extraktion durchzuführen Schritt nach Proteinfällung und entsorgen Sie die unerwünschten Fraktion. Die Ermittler, die weitere Untergliederung der hydrophoben Verbindungen (neutralen Lipiden, Fettsäuren und Phospholipide) erfordern, um die Fraktionierung Schritt. Lagerung Überlegungen sind wichtig, maintaining der Lebensfähigkeit von Proben für die spätere Analyse. Werden die Proben nicht korrekt gespeichert werden, können Abbau oder Zersetzung auftreten. Idealerweise sollten die Proben in Schraubverschluss Bernstein Fläschchen weg von Licht gelagert werden, um den Abbau von lichtempfindlichen Arten zu verhindern. Die Proben sollten auch eingefroren bei -80 ° C gehalten werden, um Stoffwechselabbau 23-25 ​​verhindern. Obwohl hier nicht im Detail diskutiert werden Proben immer bei 4 ° C in den Autosampler Tray während LC-MS-Analyse gehalten. Dies stellt sicher, dass alle Proben bei einer konstanten Temperatur und Änderungen der Umgebungstemperatur sich nicht auf die Viskosität, Löslichkeit oder Stabilität der Proben aufbewahrt. Es wird empfohlen, dass die manuellen Aspekte dieser Verfahren, wie LLE und SPE, um das Vertrauen und Komfort mit den Schritten beteiligt zu gewinnen geübt werden. Ein paar Einschränkungen gibt es für diese Technik. Discreet Trennung der hydrophoben und hydrophilen Metaboliten ist nicht als bestimmte Verbindungen garantiert wird Inherständig in beiden Fraktionen aufzuteilen aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung und Ladezustand. Darüber hinaus, wie in Abbildung 4, falsche Technik bei der Proteinpellet Extraktionsschritt kann zu schlechter Reproduzierbarkeit Metaboliten sowohl in den Proben und führen Qualitätskontrollen gezeigt. Dies wirkt sich auf die Statistik, vor allem in kleinen Datenmengen, da die statistische Aussagekraft ist nicht verfügbar. Deshalb ist es wichtig, dass dieser Schritt genau das gleiche jedes Mal bei jeder Probe durchgeführt werden. Eine weitere Einschränkung ist die Zeit. Zwar gibt es Haltepunkte in diesem Protokoll, bei dem Proben eingefroren werden und die Vorbereitung am nächsten Tag fortgesetzt, sollte einen ganzen Tag nehmen, dieses Verfahren durchführen werden. Drittens ist nicht jede Verbindung innerhalb einer biologischen Probe kann für die Ionenunterdrückung ausgewertet werden. Da es nicht möglich ist zu erkennen, wie die Matrix jeder einzelnen Metaboliten zu beeinflussen, ist die aktuelle Option, um die internen Standards, die theoretisch zu imitieren einige Klassen von endogenou bewertens Metaboliten. Schließlich absolute Identifikationen können nicht allein mit dieser Methode durchgeführt werden. Für absolute Identifizierung von Metaboliten sind Tandem MS in Zusammenarbeit mit Datenbankrecherchen und Standards erforderlich. Ein wichtiger Teil der metabolomics ist die Identifizierung von Verbindungen. Obwohl hier nicht im Detail diskutiert wurden Qualitätskontrollproben mittels LC-MS analysiert. Mehrere Probenvorbereitung Rohlinge und Instrument Rohlinge wurden für den Einsatz als Hintergrund-Subtraktion vorbereitet, um die Rate der Fehlalarme von Schadstoffen zu reduzieren, was zu zuverlässigeren Metabolit Hits. Nach diesem Schritt wurde die Anzahl der &quot;molekularen Eigenschaften&quot; gruppiert, basierend auf m / z, Retentionszeit und Isotopenverhältnis und Addukte, eine Liste der aktuellen Verbindungen zu erzeugen. Obwohl die Liste der Verbindungen wurde stark reduziert, die Ergebnisse waren zuverlässiger, da sie nicht auf mehreren Addukte aus der gleichen Verbindung basiert. Der vollständige Verfahren ist umfassend und ermöglicht isolation hydrophober Metaboliten wie neutrale Lipide, Phospholipide, Fettsäuren, Triglyceriden und Steroide, aber auch hydrophile Trenn Klassen in der wässrigen Fraktion, die Eicosanoide, Zucker, Flavonoiden und Aminosäuren wurden identifiziert 12, 26.

Biologische Reaktionen erzeugen Metaboliten als Endprodukte von zellulären Prozessen. Metabolomics ist eine Auflistung aller in einem Organismus als Folge dieser Prozesse vorliegenden Verbindungen. Es liefert ein Bild der Physiologie von Zellen und spiegelt die Reaktion eines Organismus auf äußere oder innere Reize 1, 2. Solche Impulse könnten Umwelt-, toxikologische, pharmakologische Nahrungs, hormonelle oder im Zusammenhang mit Krankheit. Viele Metabolomics-Anwendungen haben und werden derzeit von den Forschern untersucht und sind Biomarker-Entdeckung 3, 4 Ernährungsstudien, Lebensmittelkunde 5, 6 und Drogentests. Unabhängig von der Anwendung, Variationen in der Daten, Verschmutzung, und die Anwesenheit von Fehlalarmen reduziert werden müssen oder vorzugsweise entfernt. In Biomarkern oder im Falle der Bestimmung Unterschiede zwischen einem Steuerelement und einer Krankheit Gruppe oder zu den Effekten von Medikamenten über Themen, die eine biologische fLUID wird auf der Grundlage der Fragen gestellt werden ausgewählt, und die Arten von Metaboliten untersucht 7. Wenn beispielsweise die Untersuchung der unmittelbaren Wirkung eines inhalierten Arzneimittels in den Lungen von Asthmatikern, und Proben, bevor Sie Metaboliten in der bronchoalveolären Lavage (BAL) und nach der Verabreichung wäre bevorzugt. Um sicherzustellen, dass beobachtet aufgrund der tatsächlichen biologischen Variation statt unsachgemäße Probenvorbereitung Unterschiede sind, ist standardisiert und konsequent Laborprotokoll wesentliche 8. Beispiel Informationen müssen sorgfältig dokumentiert werden, um sicherzustellen, dass Variablen wie biologische Flüssigkeit, Tierstamm, Sampling-Zeit, Betreff Alter, Geschlecht, um einige zu nennen, werden alle berücksichtigt und in der Studie 9 berücksichtigt. Darüber hinaus, um die Möglichkeit einer Kontamination oder Fehlalarme zu reduzieren, empfiehlt es sich, Lösungsmittel Rohlinge und Instrument analysiert Rohlinge 10 werden. Für dieses Protokolls wird der Begriff &quot;MetaboLites &quot;verwendet, um auf die tatsächlichen identifizierten Verbindungen zu beziehen. Mit Software-Anbieter, wird eine anfängliche Spitzenstellung Algorithmus verwendet, um Massenspektralen Spitzen zu erkennen. Diese Peaks werden auf der Grundlage von Masse zu Ladung (m / z)-Verhältnis und die Retentionszeit ausgerichtet. Ein zweiter Algorithmus wird dann verwendet, um mehrere Funktionen in einer einzigen Verbindung kombiniert. Diese Funktionen wie Natrium, Kalium oder Ammonium-Addukte in der positiven Ionisierungsart, und Chlorid im negativen Ionenmodus. Zusätzliche Optionen in der Software enthalten Features wie Dimere und andere Addukte. Verwendung von Glucose als Beispiel, mit Peaks bei 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH 4), 203,05261 m / z (M + Na), gäbe es drei Peaks, die die gleiche sein Verbindung unter Verwendung des ersten Algorithmus. Jedoch, wenn der zweite Algorithmus, der auf der Molekülformel basiert, angewendet wird diese drei Addukte werden zusammen gruppiert, was zu einer Verbindung. Metabolite können Störungen verursachen innerhalb samples aufgrund der Komplexität des vorliegenden Verbindungen. Die Anwesenheit von Tausenden von Metaboliten in einer Probe Ursachen signalisieren Unterdrückung besonders der unteren Fülle Metaboliten. Probe Bereinigung Entfernung störender Proteine, und anschließende Trennung in mehrere Fraktionen, die Komplexität der Probe dadurch Peaktrennung verbessert, wodurch die Auflösung und die Verringerung Metaboliten Koelution reduziert. Deshalb ist Probenaufreinigung und verbesserte Trennung von Verbindungen erforderlich. Es hat sich gezeigt, dass die Proteinfällung allein, auch mit der Verwendung von verschiedenen Lösungsmitteln Polarität gezeigt, kann dieses Problem nicht beheben 11, 12. Jedoch durch die Kombination einer starken organischen Lösemittel, wie MTBE mit einer anschließenden Fraktionierung Schritt wird der Metabolit Abdeckung erhöht. Yang et al. 12 verzeichnete einen Anstieg des Metaboliten von 1851 oder 2073 mit Methanol oder Methanol-Ethanol-Fällung jeweils allein, zu Metaboliten mit 3806 vereinigten MTBE-Lösungsmittelextraktiongefolgt von Festphasenextraktion (SPE) Schritte. Reduzierte Metaboliten überschneiden, verbesserte Peaktrennung und erhöhte Stoffwechselfluss wurde mit dieser Methode beobachtet. Die Kontamination von nicht-Metaboliten, wie Polymere, aus Musterkollektion, Lösungsmittel oder Instrument Störgeräuschen führen, und kann in Signalunterdrückung von potenziell bedeutende Metaboliten. Es wird empfohlen, dass der Techniker (n) und diejenigen, die die Proben zu sammeln, bevor die Probenvorbereitung nutzen konsequent die gleiche Marke, Typ und Größe der Probennahme Fläschchen, Pipettenspitzen und alle anderen Rohre während der Sammlung und Aufbereitung der Proben verwendet. Dies ermöglicht die Datenanalyst, um volles Vertrauen, dass die beobachteten Veränderungen real und nicht durch Hintergrund-Unterschiede zu anderen Quellen haben. Wirksamkeit der Behandlung kann Schwankungen zwischen Krankheit und Kontrollgruppen oder andere metabolische Analysen dann mit mehr Vertrauen sucht werden. Die Method hier diskutiert konzentriert sich auf die kombinierte Probenvorbereitungsverfahren, die zu 13-15 Plasma, BALF oder Rückenmarksflüssigkeit (CSF) Proben für nicht gezielte Metabolom-Profiling für die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LCMS) basierte Analyse angewendet werden kann. Sowohl Flüssigkeits-Chromatographie (LC) und ultra-Flüssigkeitschromatographie (UPLC) Trenntechniken können MS nach diesem Verfahren gekoppelt werden. Viele Forscher Durchführung von Metabolomics-Studien verwenden entweder eine Proteinfällung Technik und / oder eine Flüssig-Flüssig-Extraktionstechnik 16, 17. In unseren Studien führte dies zu weniger Metaboliten erfaßt. Das hier beschriebene Verfahren 12 ermöglicht die Detektion und Identifikation von einer größeren Anzahl von Metaboliten, auf einem breiteren Bereich von Metabolom. Dieser Anstieg ist auf die höhere Reinheit der Proben verringert und Matrixeffekten durch vorherige Trennung der Klassen Metaboliten verursacht. Eine erste protEin Fällungsschritt durchgeführt wird unter Verwendung von kaltem Methanol (MeOH), um Protein aus der Probe zu entfernen. Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) unter Verwendung von Methyl-tert-butylether (MTBE) und Wasser wird verwendet, um die hydrophilen und hydrophoben Verbindungen zu trennen. Fettsäuren, neutralen Lipiden, Phospholipiden und - dann auf der hydrophoben Schicht, um die hydrophoben Verbindungen in drei Klassen trennen Festphasenextraktion (SPE) durchgeführt. Die hydrophoben Fraktionen werden in 100% Methanol rekonstituiert, während die hydrophile Fraktion wird in 5% Acetonitril in Wasser rekonstituiert. Die Festphasenextraktion (SPE) Schritt sieht ein zusätzliches Maß an Vertrauen in die Ergebnisse durch die Reduzierung der Anzahl von Verbindungen, die sonst koeluierenden vorliegen hätte einen Trennschritt nicht durchgeführt wurde.

<table><tbody><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-6815</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td></td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34859</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49199-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Methyl tert-butylether</td><td>J.T. Baker</td><td>9042-03</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Honeywell Burdick Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>OA-SYS Heizsystem</td><td>Organomation Associates, Inc</td><td></td><td>Wird verwendet, um Proben unter einem konstanten Stickstofffluss zu halten, während sie bei 35 &#176; C</td></tr><tr><td>12-poliger Vakuumverteiler</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strata NH2 (55 & micro; M, 70&Aring;) 100 mg/ml SPE-Kartuschen</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S009-EAK</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td>Wird zum Transfer der Probe auf die SPE-Säule</td></tr> verwendet <tr><td>Pipettenspitzen aus Kunststoff</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td>Wird verwendet, wenn Glasspitzen nicht erforderlich sind</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Messpipetten aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27B</td><td>Wird zur Übertragung organischer Lösungsmittel während der Probenvorbereitung verwendet</td></tr><tr><td>Pyrex-Glaskulturröhrchen</td><td>Corning Incorporated</td><td>99499-16X</td><td>Wird zur Lagerung von wässrigen und Lipidfraktionen bis zum nächsten Schritt</td></tr><tr><td>verwendet Autosampler-Fläschchen</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0545</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen mit Schnappverschluss für Autosampler-Fläschchen</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0541</td><td></td></tr><tr><td>Glas Einsätze</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2085</td><td>Wird für kleine Probenvolumina verwendet</td></tr><tr><td>Mass Hunter Qualitative Analysesoftware</td><td>Agilent Technologies</td><td>Version B.06.00</td><td>Wird zur Überwachung von Retentionszeiten und Druckkurven verwendet</td></tr><tr><td>Mass Hunter Quantitative Analysesoftware</td><td>Agilent Technologies</td><td>Version B.05.02</td><td>Wird verwendet, um Qualitätskontrolle und Probendaten</td></tr><tr><td>zu analysieren Mass Profiler Professional Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>Version B.12.50</td><td>Wird verwendet, um Statistiken zu ermitteln, Faltungsänderungen durchzuführen und Metaboliten zu identifizieren</td></tr></tbody></table>

multi-schritt-technik zur vorbereitung mehrere metabolite verbindungsklassen für in-tiefe und informative metabolomic analyse recover

Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

Metabolomics ist ein aufstrebendes Gebiet, das Profiling von Proben aus lebenden Organismen, um Einblick in die biologischen Prozesse zu erhalten, ermöglicht. Ein wichtiger Aspekt der Metabolomics ist die Probenvorbereitung wobei inkonsistent Techniken erzeugen unzuverlässige Ergebnisse. Diese Technik umfasst Proteinfällung, Flüssig-Flüssig-Extraktion und Festphasenextraktion als Mittel zur Fraktionierung von Metaboliten in vier verschiedene Klassen. Verbesserte Anreicherung geringer Häufigkeit Moleküle mit einer resultierenden Zunahme der Empfindlichkeit erzielt wird, und schließlich zu sicherer Identifizierung von Molekülen. Diese Technik ist, um Plasma, bronchoalveoläre Lavage, und Liquorproben mit Volumina von nur 50 &amp;mgr; l angewendet. Proben können für mehrere Downstream-Anwendungen verwendet werden; Beispielsweise kann das Pellet von Proteinfällung erhaltene für eine spätere Analyse gespeichert werden. Der Überstand aus diesem Schritt durchläuft Flüssig-Flüssig-Extraktion unter Verwendung vonWasser und starke organische Lösungsmittel, die hydrophilen und hydrophoben Verbindungen zu trennen. Sobald fraktioniert, kann die hydrophile Schicht für eine spätere Analyse verarbeitet oder verworfen werden, wenn nicht benötigt. Der hydrophobe Anteil ist ferner mit einer Reihe von Lösungsmitteln während drei Festphasenextraktionsschritte, um sie in Fettsäuren, neutralen Lipiden, Phospholipiden und trennen behandelt. Dies ermöglicht dem Techniker die Flexibilität zu entscheiden, welche Klasse von Verbindungen für die Analyse bevorzugt. Es hilft auch bei zuverlässiger Identifizierung von Metaboliten seit einiger Kenntnis der chemischen Klasse existiert.

Die gesamte Probenvorbereitung wurde wie oben beschrieben durchgeführt und die wichtigste und / oder die relevanten Aspekte sind unten dargestellt. Hydrophilen und hydrophoben interne Standards wurden in gepoolten Plasmaproben versetzt, um direkte Vergleiche der internen Standards und endogenen Metaboliten Häufigkeiten mit verschiedenen Extraktionsmethoden durchzuführen. Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Daten wurden unter Verwendung von qualitativen und quantitativen Software analysiert und ergab ausgezeichnete Rückgewinnung und Trennung von sowohl endogenen Verbindungen und interne Standards. Fig. 1 zeigt die Wirksamkeit des MTBE-SPE-Verfahren bei der Gewinnung sowohl Lipidstandards (A) und endogene Verbindungen (B). Insgesamt wurden bessere Extraktion und Erfassung der Metabolite im Vergleich zu anderen Methoden wie Methanol-Extraktion, oder &quot;nur MTBE-Extraktion gewonnen, wenn die Zahl of-Funktionen wurde mit qualitativen und quantitativen Software folgende LC-MS-Analyse verglichen. Zum Beispiel, nur mit Methanol-Extraktion, die Variation für Kreatinin-D 3 betrug 15,2%. Doch mit MTBE LLE, wurde dies auf 1,04% CV reduziert. Verwendung von MTBE, die Reproduzierbarkeit von Lipiden und wässrige Verbindungen waren &lt;8% und &lt;5%, verglichen zu einem einfacheren Methanolextraktion, die in großer Variation von 29% bzw. 15% für Lipide und wässrige Verbindungen geführt. Die internen Standards verwendet werden, um Rückforderungen zu überwachen Lipid - Testosteron-D-2, C17-Ceramid, 15.00 PC, PE und 17.00 um 26%, 200%, 100%, 400% erhöht im Vergleich zur Verwendung von Methanol allein. Ähnliche Zuwächse wurden für die Fettsäure internen Standards und Phosphotidylcholin und endogenen Metaboliten phosphotidylethanolamine erkannt. Andere endogene Metaboliten wie Sphingosine, Ceramide, Diacylglycerine, Triacylglycerine, Cholesterin und Sphingomyelin wurden entweder nicht erkanntVerwendung von Methanol oder wurden bei vernachlässigbare Werte festgestellt. Allerdings sind diese endogenen Lipide wurden einfach mit MTBE-Extraktion festgestellt. In unserer Analyse den Vergleich von Standardprotokollen wurden die folgenden Ergebnisse erzielt: Methanol Niederschlag allein führte 1851 Metaboliten, gab Methanol-Ethanol-Fällung 2.073 Metaboliten, MTBE mit Flüssig-Flüssig-Extraktion gab 3125 und MTBE mit Flüssig-Flüssig-und Festphasen-Extraktion gewonnen 3.806 Metaboliten. Deshalb führt dieser Ansatz zu einer größeren Anzahl von Metaboliten extrahiert werden, wahrscheinlich aufgrund der reduzierten Ionenunterdrückung und sauberer Proben vor der LC-MS. Abbildung 2 zeigt die Effizienz bei der Trennung der hydrophoben Metaboliten in ihrer jeweiligen chemischen Klassen für mehr Vertrauen Identifizierung von Metaboliten. Eine minimale Überlappung der in den drei Lipidfraktionen folgenden SPE identifizierten Verbindungen. Unterstützung, Fig. 3die Erholung der internen Standards zeigt, dass ISTD wurden in der Fraktion, um ihre chemischen Klasse verwandt eluiert. Qualitätskontrollproben werden verwendet, um die Qualität der Probenvorbereitung auszuwerten, mögliche Auswirkungen Batch bestimmen, wenn mehrere Tage der Analyse sind für eine große Probensatz erforderlich ist, und Reproduzierbarkeit Instrument zu überwachen. Chromatogramme untersucht, um sicherzustellen, dass Stachel-Standards sind in mehr als 90% der Masse Fehler von weniger als ± 3 ppm und Retentionszeitfenster von weniger als ± 5% gewonnen. Wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind, werden die Ergebnisse verworfen und die Proben werden erneut analysiert. In einem Fall von Batch-Effekte, wodurch eine Verschiebung der Retentions für einen Batch zu beobachten, kann die Datenanalyse-Software für diese zu korrigieren. Ein zuvor hergestellten Charge von gepoolten Plasmaproben unterzogen Probenvorbereitung. Die Fraktionen wurden dann in Autosampler-Fläschchen sub-aliquotiert und bei -80 ° C für den Einsatz in Überwachungsinstrument Bedingungen gelagertgen während jeder Probenanalyse. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Spike-in-Standards. Die Fettsäure negativen Ionisierungsmodus Fraktion (Daten nicht in der Tabelle gezeigt) wurde für die Analyse verwendet werden, da die% CV der Spike-Standards in der QC-Probe mehr als 10% war. Der Datensatz für diese Fraktion wurde daher verworfen und das Instrument überprüft und gewartet. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von endogenen Metaboliten in den Proben nach drei Tagen der Probenvorbereitung und dreifach Instrument Injektionen. Die endogenen Metaboliten in den Probenvorbereitung QC-Proben sind reproduzierbar, was bedeutet, die Stärke der Probenvorbereitung sowie das Instrument Injektion Reproduzierbarkeit. Als Probenvorbereitungsschritte nicht richtig gefolgt, jedoch unzuverlässig und inkonsistente Ergebnisse erhalten. Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse, wenn die Proteinfällung Schritt des Verfahrensnicht befolgt wird, wie beschrieben. Drei Operatoren, A, B und C durchgeführt, die gleiche Probenvorbereitung auf gepoolten Plasmaproben. Ein Bediener, anstatt Pipettieren der erforderlichen Menge des Überstandes pro Versuchsprotokoll anstelle pipettiert&gt; 1 ml für beide wäscht mit etwas von dem Pellet. Dies führte nicht nur zu einer höheren Anzahl von Fehlalarmen zu diesem Bruchteil, erhöht aber die Variabilität der Daten. Die chromatographische Reproduzierbarkeit der Daten in Fig. 7 gesehen werden. Gepoolten Plasmaproben wurden in dreifacher Ausfertigung an unterschiedlichen Tagen unter Verwendung der Proteinfällung, Flüssig-Flüssig-Extraktion und Festphasenextraktion, wie in diesem Protokoll hergestellt. Jede Fraktion wurde mit der in Abschnitt 7 des Protokolls beschriebenen chromatographischen Trennung analysiert. Proben wurden dann in dreifacher Ausführung auf dem LC-MS-Instrument eingespritzt, um die Probenvorbereitung und Reproduzierbarkeit zu bewerten. Diese konsequente Überlappung zeigt sowohl die strength der Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung, wenn an drei verschiedenen Tagen hergestellt, ebenso wie die Stärke des chromatographischen Verfahrens in der Herstellung von reproduzierbaren Ergebnissen. Eine Erhöhung der chemischen Rauschens für die negative Ionisierung Modus der Fettsäurefraktion beobachtet. Dies kann durch Verunreinigungen in den LC-MS Lösungsmittel auftreten und in Widerspruch quantitative metabolomic Ergebnissen führen. Daher nur Metaboliten vor 9 min eluiert wurden, wurden analysiert. Bei der Ausführung lange Arbeitslisten kann ein Verlust der Geräteempfindlichkeit und Wandel in Pufferkonzentrationen über die Zeit was zu einer verringerten Signalintensität und Retentionszeitverschiebung auftreten. Wenn die Retentionszeit Überlappung Variation von weniger als 5% und die Signalintensitätsänderung weniger als 10%, sind die Daten immer noch in Standardlaborgrenzen. Analyse-Software lassen sich ausrichten und normalisieren die Daten für Gerät und Retentionszeit Drift zu korrigieren. Wenn jedoch die Abweichung LARGe, dann hat der Grund zu bestimmen. Sobald dies behoben, können die Proben erneut analysiert werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig1highres.jpg" width="500" /> 1. Die Fülle der Lipid istDs (A) und endogenen Metaboliten (B) nach der Extraktion und Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) 12. Die Extraktion wurde durchgeführt und die resultierenden Proben wurden unter Verwendung von RPC abgetrennt und mittels LC-MS im positiven und negativen Ionisierungsmodus analysiert. Diese Zahl wurde von Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013) modifiziert. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Ein Vergleich der MTBE-SPE-Fraktionen 12. Die in jeder fr identifizierten MetabolitenMaßnahme verglichen, um die Menge der Überlappung während des SPE Abschnitt der Zubereitungs identifizieren. Die Zahlen im Venn-Diagramm geben die Anzahl von Metaboliten in jeder Fraktion nachgewiesen. Hier geringfügige Überlappung zwischen den drei Fraktionen, die erfolgreiche Verbindung Extraktion und Metaboliten Klassentrennung während der SPE Schritt beobachtet. Diese Zahl wurde von Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013) modifiziert. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Die Erholung der istDs in den Fraktionen mit der MTBE-SPE-Methode 12. Die Extraktion wurde durchgeführt und die resultierenden Proben wurden unter Verwendung von RPC abgetrennt und mit LCMS im positiven und negativen Modus, wie in Text beschrieben analysiert. Diese Zahl wurde von Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013) modifiziert. &lt;/ P&gt; <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Ergebnisse aus dem Pellet-Fraktion durch drei Betreiber vorbereitet. Drei Probenvorbereitung Betreiber A, B und C durchgeführt, das gleiche Protein Vorbereitungsschritt auf gepoolten Plasmaproben. Die Zahlen im Venn-Diagramm geben die Anzahl der Metaboliten von jedem Betreiber detektiert. Operatoren B und C pipettiert das erforderliche Volumen pro Probenvorbereitung Protokoll während Operator A pipettiert die gesamte Überstand und einige der Pellet, was zu mehr als 500 Stoffwechselprodukte, die meisten davon Fehlalarme für diese bestimmte Fraktion. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Bildung von Proteinpellet während der Proteinfällungsschritt &lt;. / Strong&gt; (A) 100 &amp;mgr; l humanem Plasma vor der Probenherstellung, (B) Plasma nach Zugabe von eiskaltem Methanol, (C)-Protein-Pellet nach Zentrifugation bei 0 ° C für 15 min bei 18.000 x auf dem Boden des Röhrchens gebildet g. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig6highres.jpg" width="500" /> 6. Trennung der hydrophilen und hydrophoben Schichten während Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) Schritt. Das organische Lösungsmittel Methyl-tert-butylether (MTBE) und Wasser wurden verwendet, um die hydrophilen und hydrophoben Metaboliten trennen. Die MTBE-Schicht wurde unpolare Verbindungen gelöst und die Wasserschicht wurde polaren Verbindungen (a) gelöst Plasmaüberstand nach der Proteinentfernung;. (B) Plasma nach dem Trocknen unter Stickstoff, (C) Plasma nach Zusatz von MTBE; <str<html> ong&gt; (D) Zugabe von Wasser zu Plasma-und MTBE, (E) MTBE-Wasserschicht nach dem Zentrifugieren gebildet, (F) Entfernen der oberen MTBE Schicht, (G), vor allem nach Entfernung MTBE verbleibenden hydrophilen Schicht. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. Chromatogramme von Fraktionen aus einem ausgewählten Datensatzes. Probenvorbereitung wurde auf drei separaten gepoolten Plasma QC-Proben und jeder Probe durchgeführt wurde dreifach auf dem LC-MS-Gerät injiziert. Vertreten sind insgesamt Ionenchromatogramme der mit den in Abschnitt 7 des Methodenprotokoll angegeben LC-MS-Parameter erworbenen Plasmaproben. Die chromatographische Darstellung der anderen biologischen Flüssigkeiten wird aufgrund der Unterschiede in Metaboliten Zusammensetzung variieren.k &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="485"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;"> Fraktion </td><td style="width:72px;"> Ionisations-Modus </td><td style="width:127px;"> Internal Standard </td><td style="width:23px;"> n </td><td style="width:103px;"> Durchschnittliche Peakfläche </td><td style="width:77px;"> Peakfläche% CV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Wässrig </td><td> Positiv </td><td> Kreatinin-D 3 </td><td> 31 </td><td> 2217311 </td><td> 3,8% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Neutral Lipid </td><td> Positiv </td><td> Triglyceride-D 5 </td><td> 31 </td><td> 4837032 </td><td> 9,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td&gt; <td></td><td> C17 Ceramide </td><td> 31 </td><td> 12736707 </td><td> 7,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Phospholipid </td><td> Positiv </td><td> 15.00 PC </td><td> 32 </td><td> 1248929 </td><td> 9,3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 17.00 PE </td><td> 32 </td><td> 517234 </td><td> 7,9% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Qualitätskontrollergebnisse von Stachel internen Standards. Die gepoolten Plasmaproben von einem Emphysem Mausmodell-Datensatz wurden analysiert, um Gerätebedingungen auf einer täglichen Basis für diese Multi-Wochen-Studie zu überwachen. Quantitative Analyse-Software verwendet, um die Spitzenbereiche der internen Standards (n = Anzahl der Injektionen Instrument QC) zu bestimmen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="555"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;"> Fraktion </td><td style="width:76px;"> Ionisations-Modus </td><td style="width:212px;"> Endogene Metaboliten </td><td style="width:103px;"> Durchschnittliche Peakfläche </td><td style="width:80px;"> Peakfläche% CV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Wässrig </td><td> Positiv </td><td> Kreatinin </td><td> 2554574 </td><td> 2,3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Valin </td><td> 3712151 </td><td> 3,3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Glucose </td><td> 2669190 </td><td> 6,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Neutral Lipid </td><td> Positiv </td><td> 3-Dehydrosphinganine </td><td> 226644 </td><td> 3,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td&gt; DG (16.00 / 16.01 / 00.00 Uhr) </td><td> 11301 </td><td> 8,2% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> DG (P-14: 0/18: 1) </td><td> 364119 </td><td> 1,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Phospholipid </td><td> Positiv </td><td> PC (24:0 / 0:0) </td><td> 27599 </td><td> 0,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PC16: 0/22: 6) </td><td> 2873326 </td><td> 4,5% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PI (16.00 / 18.01 Uhr) </td><td> 112998 </td><td> 4,4% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Fettsäure </td><td> Positiv </td><td> 10-oxo-5 ,8-Decadiensäure </td><td> 1363284 </td><td> 2,3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 16-Oxo-Heptadecansäure </td><td> 83700 </td><td&gt; 2,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 2-Methylvaleriansäure </td><td> 285782 </td><td> 5,7% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Fettsäure </td><td> Negativ </td><td> 10-Hydroxy-8-Octadecensäure </td><td> 10042 </td><td> 4,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> (R)-Säure laballenic </td><td> 173929 </td><td> 6,5% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 2-Keto-Valeriansäure </td><td> 35488 </td><td> 6,0% </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Qualitätskontrollergebnisse aus endogenen Metaboliten. Pooled Plasmaproben von einer menschlichen Krankheit Datensatzes wurden analysiert, um die Probenvorbereitung Reproduzierbarkeit an unterschiedlichen Tagen zu überwachen. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung über drei Tage vorbereitet, (n = 9 prep QC Injektionen).

Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse in metabolomics Experimente abhängig von der Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung. Beschrieben ist eine strenge und gründliche Methode, die Extraktion von Metaboliten aus biologischen Flüssigkeiten können mit der Option, später die Analyse bis zu Tausenden von Verbindungen, oder einfach nur die Verbindungsklassen von Interesse.

Multi-Schritt-Technik zur Vorbereitung mehrere Metabolite Verbindungsklassen für In-Tiefe und Informative Metabolomic Analyse Recover

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine effektive Methode zur Fraktionierung von Metaboliten in komplexen biologischen Flüssigkeiten zu demonstrieren, um vereinfachte Proben für eine verbesserte Abdeckung des Metaboloms zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst jeder Probe interne Standards zugesetzt werden, um die Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung und der Gerätebedingungen zu überwachen. Der zweite Schritt besteht darin, jeder Probe eiskaltes Methanol hinzuzufügen, um die Proteine auszufällen, die andernfalls die nachfolgende Chromatographie und die Analyse mittels Massenspektrometrie stören könnten. Im nächsten Schritt trennt die Flüssig-Flüssig-Extraktion die hydrophilen von den hydrophoben Metaboliten. Der letzte Schritt ist die Festphasenextraktion, um die lipidischen Metaboliten weiter in Phospholipide, Fettsäuren und neutrale Lipide zu fraktionieren. Letztendlich dient diese kombinierte mehrstufige Methode dazu, eine effektive Trennung, hervorragende Reproduzierbarkeit und eine verbesserte Abdeckung des Plasma-Metaboloms nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie einer einfachen Methanolextraktion, liegt darin, dass wir eine verbesserte Abdeckung von Metaboliten erzielen, insbesondere von Lipiden, was wichtig ist, wenn Metabolomik-Profilierungsstudien durchgeführt werden oder wenn Lipide von besonderem Interesse sind. Vor der Proteinfällung bereiten Sie die Proben zunächst vor, indem Sie sie auf Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie danach vorab hergestellte interne Standards (ISTD) zu den Proben hinzu.Alle Standardkonzentrationen wurden gegebenenfalls basierend auf der Empfindlichkeit der verwendeten MS- und HPLC-Geräte angepasst. Für die Analyse jeweils 10 Mikroliter zu jeder Probe hinzufügen. Zu jeder hydrophilen und hydrophoben Standardlösung jeweils 10 Mikroliter entweder der 1×-, 2×- oder 4×-Positivkontrolllösung hinzufügen.Nachdem alle Proben mit internen Standards und positiven Kontrolllösungen versetzt wurden, jede Probe 10 Sekunden lang verwirbeln. Um die Proteinfällung zu beginnen, 400 Mikroliter eiskaltes Methanol zu jeder Probe hinzufügen. 10 Sekunden lang verwirbeln und dann 15 Minuten bei null Grad Celsius mit 18.000 × g zentrifugieren.Es sollte sich ein Proteinpellet am Boden des Röhrchens bilden. Nach der Zentrifugation den gesamten Überstand in ein neues Glaskulturröhrchen überführen und anschließend unter Stickstoff trocknen. Dieser getrocknete Rückstand wird später einer Flüssig-Flüssig-Extraktion unterzogen.Für die Analyse der Proteinpellet-Fraktion ein Milliliter Methyl-tert-butyläther oder MTBE zur weißen oder cremefarbenen Proteinpellet geben, 30 Sekunden pro Röhrchen vortexen und 15 Minuten bei null Grad Celsius mit 18.000 × g zentrifugieren. Die MTBE-Schicht in ein neues Glaskulturröhrchen abgießen. Da die Größe der Pellet zwischen den Proben variieren kann, ist es wichtig, für alle Proben stets die gleiche Menge an MTBE abzusaugen.Beispielsweise, wenn für die Probe mit der geringsten Menge an Überstand nur 900 Mikroliter abdekantiert werden können, dann dekantieren Sie 900 Mikroliter. Für alle Proben geben Sie weitere ein Milliliter MTBE zum Proteinpellet hinzu, wirbeln für 30 Sekunden und zentrifugieren anschließend bei null Grad Celsius für 15 Minuten. Zentrifugieren Sie mit 18.000 × g, saugen Sie wie zuvor die MTBE-Schicht ab und geben Sie sie zu den zuvor vorbereiteten Glaskulturröhrchen hinzu.Trocknen Sie die Proben durch Stickstoffstrom und resuspendieren Sie sie in 200 Mikrolitern eines ein-zu-eins-Chloroform-Methanol-Gemischs. Überführen Sie jede Probe in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei null Grad Celsius und 18.000 × g. Danach überführen Sie mit Glaspipetten den Überstand in verschraubbare Probengefäße für den Autosampler. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie mit einer Glaspipette drei Milliliter MTBE zu dem zuvor vorbereiteten getrockneten Methanol-Rückstand hinzu und wirbeln Sie 30 Sekunden lang im Vortex. Danach 750 Mikroliter Wasser zu jedem Röhrchen hinzufügen und 10 Sekunden lang vortexen. Zentrifugieren bei etwa 200 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur; nach der Zentrifugation sind zwei deutliche Schichten sichtbar. Vorsichtig 2,5 Milliliter der oberen MTBE-Schicht abpipettieren, wobei die darunterliegende wässrige Schicht nicht mitaufgenommen werden darf, und in ein sauberes Glasgefäß überführen. Fügen Sie drei Milliliter MTBE zum verbleibenden wässrigen Anteil jeder Probe hinzu.Und 10 Sekunden pro Röhrchen vortexen, dann 10 Minuten bei etwa 200 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Drei Milliliter MTBE unter Ausschluss von Wasser abpipettieren und mit dem vorherigen MTBE-Röhrchen vereinigen. Diese MTBE-Fraktion wird später einer Festphasenextraktion unterzogen.Konzentrieren Sie die verbleibende wässrige Phase durch Trocknen unter Stickstoff. Lösen Sie den Rückstand in 100 Mikrolitern von einem auf und geben Sie 400 Mikroliter eiskaltes Methanol zu jedem Röhrchen hinzu, wirbeln Sie gründlich und überführen Sie die Probe anschließend in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Lassen Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius 20 bis 30 Minuten lang stehen, um die Ausfällung eventuell noch vorhandener Proteine im Methanol zu ermöglichen.Zentrifugieren Sie anschließend bei null Grad Celsius 15 Minuten lang mit 18.000 × g. Nach der Zentrifugation sollte sich ein Präzipitat an der Röhrenwand absetzen. Aspirieren Sie 450 Mikroliter Überstand, ohne das Präzipitat aufzusaugen, und überführen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen. Trocknen Sie den Überstand vollständig in einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator bei höchstens 45 Grad Celsius innerhalb von etwa ein bis zwei Stunden. Lösen Sie das getrocknete Präzipitat in 200 Mikrolitern 5 %iger Acetonitril-Wasser-Lösung auf und wirbeln Sie es mit einem Vortex-Mischer.Überführen Sie die Proben kurzzeitig in Autosampler, Probengefäße und frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein. Um mit dem Verfahren zur Festphasenextraktion zu beginnen, trocknen Sie den zuvor erhaltenen MTBE-Anteil unter einem kräftigen Strom von Stickstoff bei 35 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Sobald die MTBE-Anteile vollständig trocken sind, stoppen Sie den Stickstoffstrom und resuspendieren Sie jede Probe schnell in einem Milliliter Chloroform unter Verwendung einer Glaspipette und eines Vortexers. Spülen und konditionieren Sie die Festphasen-Extraktions- oder SPE-Kartusche kurz zweimal mit jeweils 400 Mikrolitern Hexan. Entsorgen Sie die Waschflüssigkeit und ersetzen Sie das Sammelgefäß durch ein neues Glasröhrchen. Geben Sie die Probe auf die SPE-Säule, setzen Sie Unterdruck auf und sammeln Sie die Durchlauf-Fraktion.Mit einer Glaspipette ein Milliliter Chloroform-Isopropanol im Verhältnis 2:1 zur SPE-Säule geben und den Durchlauf in denselben Glasröhrchen auffangen. Dies ist die neutrale Fraktion. Die neutrale Fraktion unter Stickstoff 10 bis 15 Minuten trocknen.Um die Oxidation mit einer Glaspipette zu minimieren, fügen Sie ein Milliliter 5 %iger Essigsäure in Diethylether zur SPE-Säule hinzu und sammeln Sie den Durchlauf. Dies ist die Fettsäurefraktion. Trocknen Sie die Fettsäurefraktion unter Stickstoff für 10 bis 15 Minuten, um die Oxidation unter Verwendung von Kunststoffspitzen zu minimieren.Geben Sie 800 Mikroliter Methanol auf die SPE-Kartusche und sammeln Sie den Durchlauf in 15-Milliliter-Kunststoffkegelfläschchen; dies ist die Phospholipid-Fraktion. Überführen Sie die Phospholipid-Fraktion in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und trocknen Sie die Proben mit einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator bei 45 Grad Celsius für etwa eine bis 1,5 Stunden. Schließlich resuspendieren Sie jede der Proben aus den drei Fraktionen in 200 Mikrolitern 100 % Methanol, überführen Sie sie in Autosampler-Fläschchen und lagern Sie sie im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius.Die Wirksamkeit der M-T-B-E-S-P-E-Methode bei der Extraktion sowohl von Lipidstandards als auch von endogenen Metaboliten zeigt insgesamt eine bessere Extraktion und Abdeckung der Metaboliten im Vergleich zu anderen Methoden wie der Methanolextraktion oder der alleinigen MTBE-Extraktion, wenn die Anzahl der Merkmale mit qualitativer und quantitativer Software verglichen wird. Nach der LC-MS-Analyse zeigten die Vergleiche der M-T-B-E-S-P-E-Fraktionen eine minimale Überlappung zwischen den drei Fraktionen nach der SPE, was die Effizienz bei der Trennung der hydrophoben Metaboliten in ihre jeweiligen chemischen Klassen für eine zuverlässigere Identifizierung der Metaboliten belegt. Zusätzlich zeigte die Rückgewinnung der internen Standards in den Fraktionen mittels der M-T-B-E-S-P-E-Methode, dass NR 12 nachgewiesen wurde und die internen Standards in der Fraktion enthalten waren, die ihrer chemischen Klasse entspricht.Um die chromatographische Reproduzierbarkeit zu bewerten, wurde die Probenvorbereitung an drei separaten gepoolten Plasma-QC-Proben durchgeführt, und jede Probe wurde dreifach am LCM MSS-Gerät injiziert. Die konsistente Überschneidung demonstriert die Reproduzierbarkeit von Gerät und Probenvorbereitung. Der bei der negativen Ionisierungsart der Fettsäurefraktion beobachtete Anstieg der chemischen Störungen könnte auf Kontaminationen in den LCM S-Lösungsmitteln zurückzuführen sein.Daher wurden nur Metaboliten analysiert, die vor neun Minuten eluierten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform, MTBE, Diethylether und sogar den gebräuchlicheren Reagenzien, die in dieser Methode verwendet werden, äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels, von Handschuhen und Augenschutz sowie die Durchführung der Probenvorbereitung in einem Abzug getroffen werden sollten.

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