Multi-Schritt-Technik zur Vorbereitung mehrere Metabolite Verbindungsklassen für In-Tiefe und Informative Metabolomic Analyse Recover

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein wirksames Mittel zur Fraktionierung von Metaboliten in komplexen biologischen Flüssigkeiten zu demonstrieren, um vereinfachte Proben für eine verbesserte Abdeckung des Metaboloms zu erhalten. Dies wird erreicht, indem jede Probe zunächst mit internen Standards versehen wird, um die Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung und der Gerätebedingungen zu überwachen. Der zweite Schritt besteht darin, jeder Probe eiskaltes Methanol zuzusetzen, um die Proteine auszufällen, die sonst die nachfolgende Chromatographie und Analyse durch Massenspektrometrie beeinträchtigen könnten.

Als nächstes trennt der Schritt der Extraktion der flüssigen Flüssigkeit die hydrophilen von den hydrophoben Metaboliten. Der letzte Schritt ist die Festphasenextraktion, um die Lipidmetaboliten weiter in Phospholipide, Fettsäuren und neutrale Lipide zu fraktionieren. Letztendlich wird diese kombinierte mehrstufige Methode verwendet, um eine effektive Trennung, eine hervorragende Reproduzierbarkeit und eine verbesserte Abdeckung des Plasmametaboloms zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. einer einfachen Methanol-Extraktion, besteht darin, dass wir eine verbesserte Metabolitenabdeckung erhalten, insbesondere von Lipiden, was bei der Durchführung von Metabolomik-Profiling-Studien oder wenn Lipide von besonderem Interesse sind, wichtig ist. Bereiten Sie die Proben vor der Proteinfällung vor und tauen Sie die Proben zunächst auf Raumtemperatur auf. Als nächstes spießen Sie die Proben mit internen ISTD-Standards, die zuvor erstellt wurden.

Alle Standardkonzentrationen wurden bei Bedarf angepasst, basierend auf der Empfindlichkeit der verwendeten MS- und HPLC-Instrumente. Für die Analyse jede Probe mit 10 Mikrolitern aufspießen. Jede der hydrophilen und hydrophoben Standardlösungen spießt jede Probe mit 10 Mikrolitern entweder einer x zwei x oder vier x Positivkontrolllösung.

Nachdem alle Proben mit internen Standards und Positivkontrolllösungen versetzt wurden, wird jede Probe 10 Sekunden lang vortext. Um mit der Proteinfällung zu beginnen, fügen Sie jeder Probe 400 Mikroliter eiskaltes Methanol hinzu. 10 Sekunden pro Röhrchen vortexen, 15 Minuten lang bei null Grad Celsius bei 18.000 Mal zentrifugieren.

G, Am Boden des Röhrchens sollte sich ein Proteinpellet bilden. Nach der Zentrifugation wird der gesamte Überstand in ein neues Glaskulturröhrchen umgefüllt und anschließend unter Stickstoff getrocknet. Dieser getrocknete Rückstand wird später einer flüssigen Flüssigextraktion unterzogen.

Für die Analyse der Proteinpelletfraktion geben Sie einen Milliliter Methylkäferether oder MTBE für 30 Sekunden pro Röhrchen in den weißen oder cremefarbenen Proteinpellet-Wirbel und zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei null Grad Celsius 18.000 Mal. G Dekantieren Sie die MTBE-Schicht in ein neues Glaskulturröhrchen. Da die Größe des Pellets von Probe zu Probe variiert, ist es wichtig, für alle Proben konsequent die gleiche Menge MTBE zu aspirieren.

Wenn z. B. nur 900 Mikroliter für die Probe mit der geringsten Menge an Überstand umgefüllt werden können, dann dekantieren Sie 900 Mikroliter. Geben Sie für alle Proben einen weiteren Milliliter MTBE für 30 Sekunden in den Proteinpellet-Wirbel und zentrifugieren Sie dann bei null Grad Celsius oder 15 Minuten. Geben Sie 18.000 Mal G wie zuvor zu, aspirieren Sie die MTBE-Schicht und geben Sie sie zu den zuvor vorbereiteten Glaskulturröhrchen.

Die Proben werden durch Stickstofffluss getrocknet und in 200 Mikrolitern Eins-zu-Eins-Chloroform-Methanol resuspendiert. Übertragen Sie jede Probe in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei null Grad Celsius bei 18.000 mal G. Danach verwenden Sie Glaspipetten, um den Überstand in Autos-Sampler-Fläschchen mit Schraubverschluss zu übertragen. Um diesen Vorgang zu starten, fügen Sie mit einer Glaspipette drei Milliliter MTBE zu dem zuvor vorbereiteten getrockneten Methanolrückstand hinzu und wirbeln Sie ihn 30 Sekunden lang ein.

Geben Sie danach 750 Mikroliter Wasser in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es 10 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie bei etwa 200-facher G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, zwei unterschiedliche Schichten sind sichtbar. Nach dem Zentrifugieren aspirieren Sie vorsichtig 2,5 Milliliter der oberen MTBE-Schicht, ohne die darunter liegende wässrige Schicht zu pipettieren, und geben Sie sie in eine saubere Glaskultur. Zwei. Geben Sie drei Milliliter MTBE in den verbleibenden Wasserteil jeder Probe.

Und 10 Sekunden pro Röhrchenzentrifuge bei etwa 200 mal G für 10 Minuten vortexen. Bei Raumtemperatur drei Milliliter MTBE ohne Wasser ansaugen und mit dem vorherigen MTBE-Schlauch kombinieren. Diese MTBE-Fraktion wird später einer Festphasenextraktion unterzogen.

Die verbleibende wässrige Schicht durch Trocknen unter Stickstoff konzentrieren. Resuspendieren Sie den Rückstand in 100 Mikrolitern von einem und fügen Sie 400 Mikroliter eiskaltes Methanol zu jedem Röhrchenwirbel hinzu und geben Sie es dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Lassen Sie es 20 bis 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius stehen, damit sich das verbleibende Protein im Methanol ausscheiden kann.

Als nächstes zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei null Grad Celsius bei 18.000 mal G, es sollte ein Niederschlag entlang der Seite des Röhrchens vorhanden sein, nach dem Zentrifugieren 450 Mikroliter Überstand aspirieren, ohne den Niederschlag anzusaugen, und in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Trocknen Sie in einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator bei maximal 45 Grad Celsius für etwa ein bis zwei Stunden vollständig ab. Den getrockneten Überstand in 200 Mikroliter 5%iges Acetylnitrilwasser resuspendieren und vortexen.

Übertragen Sie die Proben kurz in Autos, Probenehmer und Fläschchen und frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein. Um das Verfahren für die Festphasenextraktion zu beginnen, trocknet die zuvor erhaltene MTBE-Fraktion unter einem guten Stickstoffstrom bei 35 bis Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Wenn die MTBE-Fraktionen vollständig trocken sind, stoppen Sie den Stickstofffluss und resuspendieren Sie jede Probe schnell in einem Milliliter Chloroform mit einem Glaspipettenwirbel.

Waschen und konditionieren Sie die Festphasenextraktion bzw. SPE-Kartusche zweimal kurz mit 400 Mikrolitern Hexan. Entsorgen Sie den Abfall und ersetzen Sie ihn durch ein neues Auffangrohr aus Glas. Geben Sie die Probe in die SPE-Säule, legen Sie ein Vakuum an und sammeln Sie den Durchfluss.

Geben Sie mit einer Glaspipette einen Milliliter zwei zu eins Chloroform-Isopropylalkohol in die SPE-Säule und sammeln Sie den Durchfluss in denselben Glasröhrchen. Dies ist die neutrale Fraktion. Trocknen Sie die neutrale Fraktion 10 bis 15 Minuten unter Stickstoff

Um die Oxidation mit einer Glaspipette zu minimieren, geben Sie einen Milliliter 5%ige Essigsäure in Ethylether in die SPE-Säule und fangen Sie den Durchfluss auf. Dies ist die Fettsäurefraktion. Trocknen Sie die Fettsäurefraktion 10 bis 15 Minuten lang unter Stickstoff, um die Oxidation mit Kunststoffspitzen zu minimieren.

Geben Sie 800 Mikroliter Methanol in die SPE-Kartusche und sammeln Sie den Durchfluss durch In konischen 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen ist dies die Phospholipidfraktion. Übertragen Sie die Phospholipidfraktion in 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen, trocknen Sie die Proben mit einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator bei 45 Grad Celsius für etwa ein bis 1,5 Stunden. Zum Schluss wird jede der Proben aus den drei Fraktionen in 200 Mikrolitern 100 % Methanol suspendiert, in Autos, Probenehmer und Fläschchen überführt und im Gefrierschrank mit einer Temperatur von minus 80 Grad Celsius gelagert.

Die Wirksamkeit der M-T-B-E-S-P-E-Methode bei der Extraktion sowohl von Lipidstandards als auch von endogenen Metaboliten wird gezeigt: Insgesamt wurde eine bessere Extraktion und Abdeckung der Metaboliten im Vergleich zu anderen Methoden wie der Methanolextraktion oder der reinen MTBE-Extraktion erzielt, wenn die Anzahl der Merkmale mit qualitativer und quantitativer Software verglichen wurde. Nach der lc-MS-Analyse zeigte der Vergleich der M-T-B-E-S-P-E-Fraktionen eine minimale Überlappung zwischen den drei Fraktionen nach SPE, was die Effizienz bei der Trennung der hydrophoben Metaboliten in ihre jeweiligen chemischen Klassen für eine sicherere Metabolitenidentifikation zeigt. Darüber hinaus zeigte die Rückgewinnung der internen Standards in Fraktionen unter Verwendung der M-T-B-E-S-P-E-Methode, NR 12, dass die internen Standards in der Fraktion angegeben waren, die sich auf ihre chemische Klasse bezieht.

Um die chromatographische Reproduzierbarkeit der Daten zu bewerten, wurde die Probenvorbereitung an drei separaten gepoolten Plasma-QC-Proben durchgeführt, und jede Probe wurde in dreifacher Ausfertigung auf dem LCM MSS-Instrument injiziert. Die konsistente Überlappung zeigt die Reproduzierbarkeit der Geräte- und Probenvorbereitung. Die für den negativen Ionisationsmodus der Fettsäurefraktion beobachtete Zunahme des chemischen Rauschens kann auf Verunreinigungen in den LCM S-Lösungsmitteln zurückzuführen sein.

Daher wurden nur Metaboliten analysiert, die vor neun Minuten andeuteten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform, MTBE, Ethylether und sogar den gebräuchlicheren Reagenzien, die bei dieser Methode verwendet werden, äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels, Handschuhe und Augenschutz sowie die Probenvorbereitung in einem Abzug getroffen werden sollten.