Ein integrierter Workflow zur Identifizierung und Quantifizierung von FDR-Kontroll-basierten, ungezielten Metabolomen

Dieses Protokoll ermöglicht die qualitative und quantitative Analyse von nicht zielgerichteten Metabolomen auf der Grundlage der FDR-Qualitätskontrolle, wodurch die falsch positiven Ergebnisse der Metabolitenidentifizierung effektiv reduziert werden. Dieser Workflow integriert XY-Meta, das die Target-Decoy-Strategie verwendet, um FDR genauer für die Metabolomidentifizierung im qualitativen Analysemodul zu bewerten. Diese Maßnahme kann effektiv falsch positive Ergebnisse der ungezielten Identifizierung von Metabolomen filtern, was die Robustheit der Entdeckung von Biomarkern oder Schlüsselmolekülen verbessert.

Wir erwarten, dass Forscher die Ziel-Lockvogel-Strategie für die FDR-Kontrolle verstehen und beherrschen können und sollten versuchen, diese Pipeline mehrmals mit den Standardparametern des Protokolls streng auszuführen. Rufen Sie zunächst die Webseite der GNPS-Datenbank auf, und klicken Sie auf Datasets durchsuchen. Suchen Sie das Schlüsselwort in der Titelspalte, und klicken Sie dann auf die Datensatz-ID-Nummer.

Laden Sie den Datensatz per FTP herunter und speichern Sie die Rohdaten im entsprechenden Ordner. Um das Format von Rohdaten zu konvertieren, installieren Sie zunächst die ProteoWizard-Software. Geben Sie unter dem ProteoWizard-Installationspfad msconvert ein.

exe, gefolgt von den spezifischen Parametern zum Konvertieren des Rohdatenformats in das mzXML-Format. Auch hier wird msconvert verwendet. exe konvertiert diese Daten in das MGF-Format und speichert sie im MGF-Ordner.

Um die Referenzspektralbibliothek für die Metaboliten vorzubereiten, besuchen Sie die GNPS-Webseite. Suchen Sie nach dem Schlüsselwort NIST, klicken Sie auf Ansicht für die Details und laden Sie die Bibliothek herunter. Speichern Sie die Bibliothek im Datenbankordner.

Laden Sie das XY-Meta-Programm herunter. Suchen Sie die Parameterkonfigurationsdatei unter dem Ordner config und ändern Sie ihren Inhalt wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie den Addukttyp als Liste im Adduktordner fest.

Führen Sie die Metabolitenidentifizierung und die falsche Erkennungsrate mit dem Befehl XY-Meta.exe durch. Laden Sie das MetaX-Softwarepaket herunter und installieren Sie es. Bearbeiten Sie dann die Beispielliste.

txt-Datei, um die Probe und die entsprechenden Massenspektrometriedaten wie im Textprotokoll beschrieben anzugeben. Verwenden Sie die R-Datei, die mit dem Textprotokoll bereitgestellt wird, um das Skript zur Quantifizierung von Mock- und Wildtypgruppen mit der metaX-Software auszuführen. Überprüfen Sie den Ausgabeordner, in dem die Ergebnisse der quantitativen Analyse gespeichert sind, z. B. das PCA-Diagramm.

Ändern Sie als Nächstes die Parameter im R-Skript, um die Spitzen in der qualitativen und quantitativen Analyse mithilfe von Metabolitenidentifikationen zu kommentieren, um sowohl die Ergebnisse zu integrieren als auch das R-Skript auszuführen. Box-Plots quantifizierter Metaboliten zeigten, dass die allgemeine Verteilung von gesunden und Krankheitsproben bei geringer Fluktuation der Mittelwerte ähnlich war. Nur 3,39% der Metaboliten hatten mehr als 30% der fehlenden Werte.

Das Diagramm der Hauptkomponentenanalyse der Proben aus beiden Gruppen zeigte, dass metaX den Anteil der Metaboliten mit einem CV von weniger als 0,3 bemerkenswert erhöhte. Ein Venn-Diagramm von differentiell nachgewiesenen Metaboliten aus drei statistischen Testmethoden ergab 119 häufige Metaboliten. Die Retentionszeit und die Massenverteilung aller annotierten Metaboliten wurden mit einer Falschentdeckungsrate von weniger als 0,01 aufgezeichnet, wobei sechs signifikante und differentiell nachgewiesene Metaboliten gezeigt wurden.

Es ist wichtig, die Zeit für Workflowtests zu begrenzen. Denken Sie daran, nicht zu viele Proben für die Analyse auszuwählen und mindestens zwei Proben in jeder Gruppe aufzubewahren. Diese Technik ermöglicht die Qualitätskontrolle der metabolisierten Identifizierung aus datenunabhängigen Erfassungsdaten, wodurch eine robustere Referenzspektrum-Spektralbibliothek unter Verwendung der auf FDR-Kontrolle basierenden Spektrumanpassungsergebnisse erstellt wird.