Probenvorbereitung für die Metabolomik: Eine Methode zur Vorbereitung von Zellproben für das Metaboliten-Profiling

Metabolomik ist die Studie zur Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten, die in den Zellen vorhanden sind. Um die Probe vorzubereiten, beginnen Sie mit der Aussaat von Brustkrebszellen zusammen mit dem Wachstumsmedium in zwei Platten, die als Test und Kontrolle gekennzeichnet sind. Drei Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie nun das Medium und fügen Sie frisches Medium mit Östradiol in die Testplatte und reines Medium in die Kontrollplatte hinzu.

Das Östradiol bindet an den Östrogenrezeptor alpha in Brustkrebszellen, um bestimmte Expressionen zu induzieren, was zu einer Veränderung der Metabolitenzusammensetzung führt. Inkubieren Sie die Platten für die gewünschte Dauer. Ersetzen Sie das Medium durch eiskaltes Phosphat, gepufferte Kochsalzlösung oder PBS, um die Zellen zu waschen, und fügen Sie dann eiskaltes Aceton hinzu. Die eiskalten Reagenzien stoppen die Wirkung von Proteasen und verhindern so den Proteinabbau.

Lösen Sie nun mit einem Schaber die Zellen von den Platten und geben Sie sie mit Hilfe einer Pipette in Röhrchen. Nehmen Sie 20 Mikroliter dieser Zellsuspension auf ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der Zellen. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die weitere Analyse verwendet werden. Im folgenden Protokoll bereiten wir Proben aus MCF-7-Zellen für die Gaschromatographie und Massenspektrometrie vor.

Geben Sie unter Verwendung von MCF-7-Zellen, die gemäß dem Textprotokoll kultiviert wurden, fünf Milliliter eiskaltes 1x PBS auf die Platte. Kippen Sie dann die Platte mehrmals, bevor Sie das PBS entfernen. Wiederholen Sie dies noch zwei weitere Male und entfernen Sie nach der letzten Wäsche so viel PBS wie möglich. Geben Sie 750 Mikroliter vorgekühltes Aceton auf jede Platte und kratzen Sie die Zellen ab, dann kombinieren Sie die Zellen von zwei Platten in einem zwei Milliliter Röhrchen auf Eis.

Um die Zellen für die Normalisierung zu zählen, verwenden Sie für jede Behandlung zwei zusätzliche Platten für die Zellquantifizierung. Um die Zellen von den Platten zu lösen, fügen Sie 2 Milliliter HE-Puffer hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Mischen Sie die Zellen gründlich, indem Sie den HE-Puffer einpipettieren.

Verwenden Sie dann 20 Mikroliter der Zelllösung in einem Hämozytometer, um die Zellzahl unter einem Mikroskop zu zählen. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie die gaschromatographische Massenspektrometrie zur Identifizierung und Quantifizierung der Metaboliten verwenden. Führen Sie eine integrative Analyse gemäß dem Textprotokoll durch.