Patch-Clamp-Aufzeichnungen vom Dendriten eines dopaminergen Neurons in einem Hirnschnitt

Beginnen Sie mit einem elektrophysiologischen Aufbau mit einem immobilisierten Gehirnschnitt, der in eine künstliche Zerebrospinalflüssigkeit oder aCSF eingetaucht ist, die verschiedene Ionen enthält.

Der Aufbau besteht aus einer mit einer kaliumreichen Lösung gefüllten Patch-Pipette, die mit einer Aufnahmeelektrode und einem Verstärker verbunden ist.

Üben Sie positiven Luftdruck auf die Pipette aus, um ein Verstopfen zu verhindern. Positionieren Sie es dann in der Nähe eines Dendriten, der signalempfangenden Erweiterung eines dopaminergen Neurons.

Die resultierende Membranvertiefung bestätigt die Nähe zum Dendriten.

Lassen Sie den Überdruck ab, um einen Sog zu erzeugen, und bilden Sie eine dichte Abdichtung zwischen der Pipette und der dendritischen Membran.

Zeichnen Sie die anfängliche Ionenbewegung als Aktionsstrom bei der Basisspannung auf.

Einfließendes aCSF mit Natrium- und Kalziumkanalblockern, um die jeweiligen Kanäle zu blockieren und die Bewegung der Ionen durch sie zu verhindern.

Legen Sie eine negative Spannung an, um einen spannungsgesteuerten Kationenkanal zu öffnen.

Dieser Kanal ermöglicht es Kaliumionen, in das Neuron einzudringen, was den Aktionsstrom erhöht und auf eine Stimulation des Dendriten in einem dopaminergen Neuron hindeutet.

Bei diesem Verfahren wird ein Hirnschnitt in die Aufnahmekammer übertragen. Verankern Sie die Scheibe mit einem Platinring am Boden der Aufnahmekammer und stellen Sie sicher, dass die Scheibe von guter Qualität ist und eine glatte, ebene Oberfläche hat. Wählen Sie dann ein Neuron mit einem Dendriten aus, der sich über eine große Entfernung in derselben Ebene erstreckt, und stellen Sie sicher, dass der Dendrite von Interesse bis zu einem gut definierten Soma verfolgt werden kann. Füllen Sie anschließend die Patch-Pipette mit Elektrodenlösung.

Um den Dendriten im zellgebundenen Modus zu flicken, identifizieren und fokussieren Sie sich auf einen Teil des Dendriten. Üben Sie Überdruck auf die Pipette aus und senken Sie ihn mit dem Mikromanipulator. Positionieren Sie dann die Pipette nahe an der Membran und stellen Sie den Druck so ein, dass ein kleines Grübchen entsteht. Lassen Sie anschließend den Druck auf die Pipettenspitze los und flicken Sie den Dendriten, während Sie den Pipettenwiderstand kontrollieren. Versuchen Sie, einen Dichtungswiderstand größer als 1 Giga Ohm zu erhalten, bestenfalls zwischen 3 und 10 Giga Ohm für Zellenaufnahmen.

Ziehen Sie anschließend die Pipette um einige Mikrometer von der Membran weg, um eine Verformung des Dendriten zu vermeiden. Die hier zu sehenden Aktionsströme repräsentieren die spontanen Aktionspotentiale von nigralen Neuronen. Um die Aktionsströme zu unterdrücken, wenden Sie Kalzium- und Natriumkanalblocker auf ACSF an. Legen Sie dann einen Spannungsschritt von minus 90 Millivolt von einem Haltepotential von 0 Millivolt an, um den hyperpolarisationsaktivierten Kationenstrom hervorzurufen.