Name: Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Lernen Sie die Bildung bakterieller Streamer in einem Mikrofluidik-Chip mit Mikrosäulen. Diese Methode mit Pseudomonas fluorescens ermöglicht die Untersuchung von Biofilmdynamiken in porösen Medien durch Fluoreszenzmikroskopie.

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Die Autoren danken Professor Howard Ceri vom Biological Sciences Department der Universität Calgary für die Bereitstellung von Bakterienstämmen. A. Kumar dankt der Unterstützung durch das NSERC. T. Thundat bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch das Canada Excellence Research Chair (CERC) Programm. Die Autoren möchten sich auch bei Frau Zahra Nikakhtari für ihre Hilfe bei der Videografie bedanken.

Führen Sie die Versuchsprotokolle hier in der unten beschriebenen Reihenfolge. Mikro Protokolle zum Erzeugen der Mikrofluid-Plattform in Schritt 1. Schritt 2 beschrieben wird die Bakterienkultur Protokoll (2) und Schritt 3 betrifft die Anordnung der Versuchsaufbau (Figur 3). Schließlich wird die tatsächliche Versuchsschritt in Schritt 4 beschrieben. 1. Chipfertigungsverfahren HINWEIS: Die richtige Sicherheitsverfahren muss für die unten beschriebenen Verfahren befolgt werden. Wenden Sie sich an den institutionellen Sicherheitsbeauftragten für Details. <ol><li> Entwerfen Sie die Maske mit einer geeigneten Software (zB L-Edit). Der Kanal-Design besteht aus einem Hauptmikrokanal mit einer Breite von 625 um. Der zentrale Bereich des Kanals enthält ein Array von Mikrostellen 50 um Durchmesser, 25 um voneinander beabstandet sind (siehe Zusatzdateien). </li><li> Drucken Sie diesen Entwurf auf Glas (5 &quot;x 5&quot; Soda-Kalk-Glas), Die eine Dicke von 0,09 &quot;hat und von etwa 70 nm dicke Schicht aus Chrom (Cr) beschichtet, mit Maskierung, um eine Fotomaske vorzubereiten. Verwenden AZ400K Entwickler für 1 min. Dann Ätzen der Cr-Schicht mit Cr-Ätzmittel für ca. 1 min mit Azeton Streifen der Resist und reinigen Sie es mit kaltem Piranha-Lösung. (H 2 SO 4 und H 2 O 2 in einem Verhältnis von 3: 1). </li><li> Photolithographie <ol><li> Reinigen Sie ein Standard-4 &quot;Silizium-Wafer chemisch mit Piranha-Lösung für 20 min. </li><li> Spülen Sie die Wafer mit DI-Wasser und trocknen. </li><li> Heizen den Wafer auf einer heißen Platte (200 ° C für 15 min). </li><li> Beschichtung der Silizium-Wafer mit Fotolack. Hier ist der positive Photoresist AZ4620 wurde auf einem Siliziumwafer für 25 Sekunden Spin-beschichtet bei 2000 UpM auf eine 12,5 um dicke Schicht zu erhalten. </li><li> Entfernen des Lösungsmittels durch alle weichen Backen der Wafer auf einer heißen Platte durch Floaten der Wafer 90 s lang bei einem Stickstoffstrom bei 100 ° C aufweist. Dann halten Sie es im Vakuum bei ter dieselbe Temperatur für 60 Sekunden. </li><li> Legen Sie die Wafer in einem dunklen Kasten für 24 Stunden zur Entwässerung. </li><li> Setzen Sie das Wafer mit UV-Licht, um die entworfenen Muster auf den Fotolack übertragen. </li><li> Tauchen Sie die Wafer in Photoresist-Entwicklerlösung (AZ400K) für 240 Sekunden. Dann spülen Sie die Wafer mit Isopropyl-Alkohol und trocknen Sie es, indem Sie in einem Strom von Stickstoffgas. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (Induktiv gekoppeltes Plasma - Deep Reactive Ion Etching) Prozess <ol><li> Gelten DRIE Ätzen. Wählen Sie die entsprechende Ätztiefe nach Endtiefe für Gerät erforderlich (50 um in dieser Untersuchung). Photoresist wirkt als Maskierungsschicht während dieses Prozesses. </li><li> Das restliche Photolack mit Aceton und reinigen Sie den Wafer. </li></ol></li><li> PDMS (Polydimethylsiloxan) Casting <ol><li> Verwenden Trichlormethylsilan (TCMS) für Silanisierung des Silizium Master-Form. Gießen Sie 2 oder 3 Tropfen Trichlormethylsilan in einem Fläschchen und legen Sie sie in einem Exsikkator neben demSilizium Master-Form. Lassen Sie 2-3 Stunden für die Silanisierung Vorgang abgeschlossen ist. </li><li> In einem separaten Behälter, mischen die Sylgard 184 Silikonbasis mit Härter Gewichtsverhältnis von 10: 1 bis PDMS vorzubereiten. Entgasen PDMS, indem man es Bedingungen (etwa 2 h) Vakuum. </li><li> Setzen Sie den Silizium Master-Form in einer Halterung. Dann gießen Sie die PDMS auf dem Silizium-Master-Form, um die PDMS-Stempel zu bilden. Sicherzustellen, dass keine Blasen in dem PDMS bilden bei diesem Vorgang. </li><li> Heilen die PDMS für 2 Stunden bei 80 ° C. </li><li> Ziehen Sie die PDMS-Stempel von der Master-Form. Dann schneiden die PDMS-Stempel in separate Mikrochips. Schließlich verwenden einen Schneidkern, um Löcher für den Einlass (en) und Steckdose (n) zu bohren. </li></ol></li><li> Verklebung von PDMS zu Glass <ol><li> Setzen Sie das Deckglas und PDMS-Stempel Sauerstoffplasma für 30 Sekunden. Bond PDMS-Stempel auf das Deckglas. </li><li> Um eine einwandfreie Abdichtung zwischen der PDMS-Stempel und dem Deckglas zu erreichen, zu tempern das Gerät, indem es in einem Ofen bei 70 ° C für 10 min. </li&gt; </ol></li></ol> 2. Bakterienkultur HINWEIS: Das richtige Biosicherheit Protokolle müssen für die Schritte 2-4 befolgt werden. Wenden Sie sich an den institutionellen Sicherheitsbeauftragten für Details. <ol><li> Bereiten LB-Agar-Platten <ol><li> 20 g Luria-Bertani (LB)-Agar (Miller)-Pulver und 500 ml ultrareinem Wasser in einen 1-l-Kolben. Rühren, um das Pulver aufzulösen. </li><li> Sterilisieren durch Autoklavieren bei 15 psi, 121 ° C für 15 min. </li><li> Lässt man den Kolben auf 50-55 ° C auf einer Bank oder in einem Wasserbad in der Biosicherheit Haube abkühlen. </li><li> Hinzufügen des Antibiotikums Tetracyclin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml zu erreichen. Gut mischen durch Verwirbelung. </li><li> Gießen Sie die Mischung in Platten. Füllen Sie jede Platte bis 02.01 - 03.02 voll. </li><li> Flamme Luftblasen kurz zu Pop, wenn sie zu bilden. Erstarrten Luftblasen sind schwer zu Bakterienkultur über zu verbreiten. </li><li> Die Platten werden bei Raumtemperatur über Nacht abkühlen. </li><li> Wenn sie cool sind,legte Platten wieder in ihre Hülle, den Beutel, Etikett (Antibiotikum und Datum), und bei 4 ° C. HINWEIS: Decken Sie das Lager von Platten mit Alufolie als Licht deaktiviert viele Antibiotika. </li></ol></li><li> LB Broth Herstellung <ol><li> 20 g Luria Bertani (LB)-Medium (Miller) Pulver und 1 l Reinstwasser in einen Kolben. Rühren, um das Pulver aufzulösen. </li><li> Sterilisieren durch Autoklavieren bei 15 psi, 121 ° C für 15 min. </li><li> Ermöglichen Kolben auf 50-55 ° C auf einer Bank oder in einem Wasserbad in der Biosicherheit Haube abkühlen. </li><li> Hinzufügen des Antibiotikums Tetracyclin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml zu erreichen. Gut mischen durch Verwirbelung. </li><li> Wenn kühl, legen Sie die etikettierte Flasche bei 4 ° C. HINWEIS: Decken Sie die Flasche mit Alufolie als Licht deaktiviert viele Antibiotika. </li></ol></li><li> Kulturbakterien auf einer LB-Agarplatte (Dieses Protokoll verwendet Pseudomonas fluorescens) <ol><li> Nehmen Sie die bakterielle Lager aus dem Gefrierschrank (-80 °, C) und legen Sie es auf Eis. </li><li> Legen Sie die -80 ° C bakterielle Lager und eine LB-Agar-Platte in einem biologischen Sicherheits Kapuze. </li><li> Streifen der Bakterienstamm auf eine LB-Agar-Platte in einem Zickzackmuster. Decken Sie die Agar-Platte und Inkubation bei 30 ° C es über Nacht. Schließlich speichern Sie die Platte im Kühlschrank bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Bakterienlösung (S1) <ol><li> Gießen Sie 50 ml LB-Medium Medien zu einer autoklavierten Kolben. Führen Sie diesen Vorgang in einer biologischen Sicherheits Kapuze. </li><li> Übertragen einer einzelnen Kolonie von der LB-Agar-Platte in den Kolben. Dieser Vorgang sollte auch in einem biologischen Sicherheitshaube durchgeführt werden. </li><li> Setzen Sie den Kolben in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 150 rpm für eine ausreichende Zeit (4 h). </li></ol></li><li> Bereiten Sie die verdünnte Bakterienlösung (S2) <ol><li> Pour 5 ml LB-Brühe Medien in eine sterilisierte Kunststoffrohr. </li><li> Verdünnen S1 durch Mischen mit LB-Brühe Medien. Dann, Vortex die Lösung. Verdünnen Sie die Lösung zu dem gewünschten Optikal Dichte (OD bei 600 nm = 0,1 gemessen). HINWEIS: Biofilm Experimenten typischerweise OD-Werte in diesem Bereich. </li></ol></li></ol> 3. Bereiten Sie den Versuchsaufbau <ol><li> Mit einer Pinzette verbinden flexiblen Kunststoffrohren (0,20 &quot;ID) in den Einlaß (en) und Austrittsöffnung (en) des Mikrochips. Die Einlässe und Auslässe wurden zuvor in die PDMS Abschnitt der Mikrochip (Schritt 1.5.5) gebohrt. In dieser Untersuchung Der Mikrochip besteht aus zwei Eingängen und einem Ausgang. </li><li> Füllen Spritze (n) mit Bakterienlösung (S2-Lösung) und entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze (n). </li><li> Verbinden Spritze Spitze (n) (30 G 0,5 &quot;stumpfe Nadel) in Einlassrohr (en). Dann schließen Austrittsrohr (en) in den Behälter zu verschwenden. </li></ol> 4. Führen Sie das Experiment <ol><li> Die Spritze (s) an der Spitze der Spritze (s). </li><li> Ort und fix Spritze (s) auf die Spritzenpumpe. Dann legen Sie den Mikrochip unter einem optischen Mikroskop mit Objektiven von Desired Vergrößerung (zB 40x). Decken den Mikrochip mit einer lebenden Zelle Kammereinrichtung, um eine konstante Temperaturumgebung für das bakterielle Wachstum (30 ° C für P. fluorescens) aufrechtzuerhalten. </li><li> Stellen Sie die Pumpe auf den gewünschten Strömungsgeschwindigkeit der Pegel (zB 10 ul / h), und initiieren Flüssigkeitspump. </li><li> Wenn Bakterien in die Kammer eingeführt wird, wird auch die Biofilmbildung initiiert. Biofilmbildung und Reifung treten typischerweise über einen Zeitraum von mehreren Stunden oder sogar Tage. Beobachten und Bilder von Biofilmwachstum durch das Mikroskop. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben gezeigt, einen einfachen Mikrofluidik-Gerät, das poröse Medien für das Studium Biofilmentwicklung in komplexen Lebensräumen nachahmt. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die das Ergebnis der Experimente bestimmen. Sie enthalten Gerätegeometrie. Während die Post Geometrie variieren kann, ist ausreichend Platz für porenLuftSchlangen zu bilden notwendig. Darüber hinaus Valiei et al. 1 haben gezeigt, dass Streamer Bildung nur in einer bestimmten Durchflussbereich auftritt. Bei Flussraten niedrig...

Kürzlich haben wir gezeigt, bakterielle Biofilmbildung Dynamik in einem Mikrofluidik-Vorrichtung, die porösen Medien 1 nachahmt. Bakterielle Biofilme sind im Wesentlichen Kolonien von Bakterien, die Oberfläche aggregiert von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 2-4 eingeschlossen sind. Diese dünnen Schichten von Bakterien bilden können, in fast jede denkbare Nische, die von glatten Oberflächen auf die viel komplexer Lebensraum von porösen Medien. Valiei et al. 1 verwendet eine Mikrofluidik-Vorrichtung mit einem Array von Mikrosäulen, um eine poröse Struktur zu simulieren und Medien untersucht Biofilmbildung bei dieser Vorrichtung als eine Funktion der Fluidströmungsrate. Sie fanden, dass in einer bestimmten Strömungsregime begann Faden Biofilme als Luftschlangen bekannt, zwischen verschiedenen Säulen entstehen. Schlangen können sich in einem angebunden werden, oder an beiden Enden an festen Oberflächen, aber der Rest der Struktur ist in Flüssigkeit suspendiert. Streamer Bildung beginnt in der Regel nach einer ersten Schicht von Biofilm gebildet hat sein Format undIonen können die langfristige Entwicklung der Biofilm in solchen komplexen Lebensräume diktieren. Vor kurzem haben mehrere Forscher die Dynamik der Streamer Bildung untersucht. Yazdi et al. 5 zeigte, dass die Luftschlangen können in Wirbelströme aus einer oszillierenden Blase Ursprung zu bilden. In einem anderen Experiment Rusconi et al. 6 untersucht die Wirkung der Kanalkrümmung und Kanalgeometrie auf die Bildung von Streamern. Sie fanden heraus, dass die Luftschlangen in gekrümmten Abschnitten von Mikrokanälen zu bilden, und Streamer Morphologie an Beweglichkeit zusammen. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Luftschlangen können weitreichende Auswirkungen in verschiedenen natürlichen und künstlichen Szenarien haben, wie sie als Vorläufer zur Bildung von reifen Strukturen in porösen Schnittstellen fungieren können, führen zu schnellen und katastrophalen Biofilm Proliferation in einer biomedizinischen Systemen und auch zu erheblichen Fluss Struktur-Wechselwirkungen, etc 1,7-9. Luftschlangen bilden Biofilm ich oftn komplexen Lebensräumen wie poröse Medien. Verständnis Biofilmwachstum in porösen Medien-Umgebung relevant zu mehreren ökologischen und industriellen Prozessen wie der biologischen Abwasserbehandlung 10, die Aufrechterhaltung Bohrloch Integrität in Situationen, wie beispielsweise CO 2 Erfassung 11 und ein Verstopfen der Poren im Boden 12. Beobachten Biofilmbildung in solchen komplexen Lebensräumen oft schwierig sein, aufgrund der Opazität des porösen Mediums. In solchen Situationen können Mikrofluidik basierend porösen Medien Plattformen sehr vorteilhaft erweisen, da sie in Echtzeit und in situ-Überwachung zu ermöglichen. Ein weiterer Vorteil der Mikrofluidik ist die Möglichkeit, mehrere Bioreaktoren auf einem Bio-Mikrofluidik-Plattform zu bauen und gleichzeitig ermöglichen die Online-Überwachung und / oder Einbau von Sensoren. Die Flexibilität, mehrere Laborversuche in einem Gerät und die Fähigkeit, signifikante relevanten Daten für eine präzise statistische Analyse zu sammeln implementieren ist ein wichtiger advantage von mikrofluidischen Systemen 13,14. In Zusammenhang mit der obigen Diskussion würde das Verständnis Streamer Bildung Dynamik in einem porösen Medium Umgebung vorteilhaft, mehrere Anwendungen. In dieser Studie, entwickeln wir das Protokoll für die Untersuchung von Streamer-Bildung in einem Gerät, das imitiert porösen Medien. Herstellung von mikrofluidischen Plattform, sind notwendige Schritte für die Zellkultur und Experimente beschrieben. In unseren Experimenten wurde die Wildtyp-Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens beschäftigt. P. fluorescens, natürlich im Boden gefunden, spielt eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Bodenökologie 15. Der Bakterienstamm eingesetzt worden gentechnisch verändert, um das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren konstitutiv.

<table><tbody><tr><td>Leuchtstoffmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>suspendiert 40 g in 1 L gereinigtem Wasser</td></tr><tr><td>LB Brühe</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>suspendiert 20 g in 1 L gereinigtem Wasser</td></tr><tr><td>Biosicherheitshaube</td><td>Microzone Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>steril 100 mm x 15 mm Petrischale aus Polystyrol</td></tr><tr><td>Inkubatorschüttler</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 Inkubatorschüttler Serie</td></tr><tr><td>50 ml sterilisiertes Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polypropylen RNase-/DNase-frei</td></tr><tr><td>Tetracyclin freie Basis</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikon</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Elastomer Basis und Härter</td></tr><tr><td>Positiver Fotolack (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststofftube</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokoll für biofilm streamer formation in einem mikrofluidik-gerät mit micro-säulen

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Verschiedene Bakterienarten besitzen die Fähigkeit, an Oberflächen anzubringen und zu kolonisieren sie in Form von dünnen Filmen als Biofilme bezeichnet. Biofilme, die in porösen Medien wachsen relevant sind mehrere Industrie-und Umweltprozesse, wie die Abwasserbehandlung und die CO 2-Sequestrierung. Wir verwendeten Pseudomonas fluorescens, ein gram-negatives Bakterium Aerobic, um die Biofilmbildung in einem mikrofluidischen Gerät, ahmt porösen Medien zu untersuchen. Mikrofluidik-Vorrichtung besteht aus einem Array von Mikrostellen, die unter Verwendung von Soft-Lithographie hergestellt wurden. Anschließend Biofilmbildung in diesen Geräten mit Fluss wurde untersucht, und wir zeigen die Bildung von Biofilmen als Fadenluftschlangen in unserem Gerät bekannt. Die detaillierten Protokolle für die Herstellung und Montage der Mikrofluidvorrichtung sind hier zusammen mit den Bakterienkulturprotokolle bereitgestellt. Detaillierte Verfahren für Experimente mit der mikrofluidischen Vorrichtung sind auch zusammen mit Vertreter vorgestelltErgebnisse.

Unter Verwendung des oben erwähnten Mikro Protokoll wurde eine PDMS basierend mikrofluidischen Vorrichtung konstruiert. 1 zeigt die rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen der PDMS-Gerät. 1A zeigt die Eingangsabschnitt der Vorrichtung. Ein gabelförmigen Eingang wird erstellt, um Druckkopf über das Gerät auszugleichen. Weitere REM-Aufnahmen zeigten auch, dass die Säulenwände fast senkrecht (Abbildung 1b). Die kultivierten Bakterienlösung (2) wurde...

Protokolle zur Untersuchung der Biofilmbildung in einem mikrofluidischen Gerät, das poröse Medien nachahmt, werden diskutiert. Das mikrofluidische Gerät besteht aus einem Array von Mikrosäulen und die Biofilmbildung durch Pseudomonas fluorescens wird in diesem Gerät untersucht.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bildung bakterieller Strömungsgebilde in einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Mikrosäulen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der mikrofluidische Chip hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die zu testenden Bakterien, in diesem Fall Pseudomonas fluorescence, anzuzüchten.Die letzten Schritte bestehen darin, den experimentellen Aufbau zusammenzubauen, die Bakterien in den mikrofluidischen Chip einzubringen und Daten zu sammeln. Letztendlich können die Ergebnisse die zeitliche Entwicklung der Stromfäden anhand von Fluoreszenzmikroskopiebildern zeigen. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die einzelnen Schritte schwer zu erlernen sind.Aufgrund des interdisziplinären Charakters des Experiments erfordert dieses Verfahren Siliziumwafer mit tiefer reaktiver Iontiefätzung. Der Fotolack auf den Wafern sollte abgewaschen werden. Beginnen Sie mit der stummen Urform.Geben Sie zwei oder drei Tropfen Trichlorethylen in ein Gefäß und stellen Sie es zusammen mit der Form, deren Gestaltung nach oben weist, in einen Exsikkator. Innerhalb von zwei bis drei Stunden wird die Form silanisiert sein. Während der Silanisierung bereiten Sie die PDMS-Mischung vor, indem Sie den Silikonbasiszusatz „cigar 1 8 4“ mit einem Härter im Verhältnis 10 zu 1 mischen.Anschließend entgasen Sie das PDMS etwa zwei Stunden lang unter Vakuum. Danach übertragen Sie einen silanisierten Wafer auf einen Halter und gießen das PDMS darüber, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Blasen entstehen. Lassen Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius auf dem Wafer aushärten.Dadurch wird ein A-P-D-M-S-Stempel aus der dimensionierten Silikonform hergestellt. Nach Abschluss der Aushärtung den PDMS-Stempel mit Hilfe eines Cutters abziehen. Anschließend den Stempel mit dem Cutter zu einem mikrofluidischen Chip zuschneiden.Verwenden Sie nun einen Hohlschneider, um an den Einlass- und Auslasspositionen auf dem Stempel Löcher auszustanzen. Im nächsten Schritt wird der Stempel mit Glas verbunden. Exponieren Sie einen 24 mm Deckgläser und den PDMS-Stempel 30 Sekunden lang gegenüber Sauerstoffplasma.Nach der Exposition befestigen Sie den Deckgläser an der Unterseite des PDMS-Stempels, wodurch eine Bindung entsteht. Stellen Sie die Montage 10 Minuten lang in einen Ofen mit 70 Grad Celsius. Um den Vorgang für dieses Protokoll abzuschließen, bereiten Sie LB-Platten vor, die mit ultrareinem Wasser hergestellt und mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin versetzt wurden, das bei 50 bis 55 Grad Celsius zugegeben wurde.Beim Gießen der Platten können Blasen durch Flammenbehandlung zerstört werden. Die abgekühlten und erstarrten Platten sollten datiert und bei vier Grad Celsius in einer Alufolie verpackt gelagert werden. Bereiten Sie außerdem LB-Brühe vor, die mit ultrareinem Wasser hergestellt und mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin versetzt wurde.Lagern Sie die Brühe bei vier Grad Celsius und zusätzlich in Aluminiumfolie eingewickelt. Kultivieren Sie nun Pseudomonas-fluorescens-Stämme, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden, auf LB-Platten, bestreichen Sie die Platten im Zickzack-Muster und inkubieren Sie sie über Nacht bei 30 Grad Celsius im Dunkeln. Am nächsten Tag entnehmen Sie eine Kolonie von der Platte und impfen einen Kolben mit frisch zubereiteter S1-Flüssigkultur an, die über Nacht bei 30 Grad Celsius mit 150 U/min Schütteln inkubiert wurde.Messen Sie die optische Dichte der Kultur nach der Inkubation. Danach stellen Sie die S2-Lösung her. Geben Sie fünf Milliliter LB in ein Plastikröhrchen und anschließend so viel der S1-Lösung hinzu, dass ein Extinktionswert bei 600 Nanometern von 0,1 erreicht wird, was typisch für ein Biofilmmuster ist.Zuerst richten Sie das Experiment mit einer Pinzette ein. Verbinden Sie Plastikschläuche mit einem Innendurchmesser von 0,20 Zoll mit den Einlässen und Auslässen des vorbereiteten Chips. Die Schläuche müssen flexibel und ausreichend lang sein. Hier betragen sie etwa 20 Zoll.Füllen Sie dann Spritzen mit der S2-Lösung. Bringen Sie stumpfe Nadeln mit 30 Gauge an und entfernen Sie Luftblasen. Das Verhindern von Luftblasen, die in den Kanal gelangen, ist ein kritischer Schritt, insbesondere aufgrund der langen Versuchsdauer.Blasen können die weichen Strukturen schädigen, die von den Bakterien gebildet werden. Anschließend die Spritzen mit den Zulaufschläuchen verbinden und die Ablaufschläuche mit Abfallbehältern verbinden. Danach die Spritzen in eine Spritzenpumpe einsetzen und die Pumpe auf die gewünschte Fließgeschwindigkeit einstellen, beispielsweise acht Mikroliter pro Stunde, an einem Mikroskop, das mit einer Zellkammer ausgestattet ist, die auf die Inkubationstemperatur eingestellt ist.Verwenden Sie möglicherweise ein 40x-Objektiv, um den mikrofluidischen Chip zu betrachten. Starten Sie nun die Pumpe. Wenn die Bakterien in die Kammer eingeführt werden, beginnt ebenfalls die Biofilmbildung.Der Biofilm bildet sich und reift über Stunden, Tage; nehmen Sie Bilder auf, um seinen Fortschritt zu verfolgen. Unter Verwendung eines mit SEMA hergestellten mikrofluidischen Chips wurde eine Aufnahme angefertigt. Der gabelartige Eingang wird erzeugt, um den Druckgradienten über das Gerät hinweg auszugleichen.Es ist außerdem ersichtlich, dass die Wände der Säulen nahezu vertikal verlaufen. Zur Untersuchung der Biofilmbildung wurde Fluoreszenzfarbstoff mit einer Geschwindigkeit von acht Mikrolitern pro Stunde in das Gerät injiziert. Die Biofilmbildung setzte nach wenigen Minuten der Infusion der verdünnten Bakterienkultur ein.Jedoch wurde nach einigen Stunden das Auftreten fadenförmiger Strukturen beobachtet, die sich zwischen den Mikrosäulen im mittleren Bereich erstreckten. Die gestrichelte Ellipse markiert einen entstehenden Strudel, der an einem Ende im Polbereich einer der Mikrosäulen verankert ist. Strudel wurden ebenfalls entlang der Diagonale zwischen zwei Mikrosäulen gesehen.Die Dicke der Fäden nahm mit der Zeit aufgrund von Zellteilung sowie der Einbindung planktonischer Bakterien zu. Außerdem vermehrten sie sich im Laufe der Zeit, wodurch die Fäden ein großes Volumen im Gerät einnahmen und zur Bildung eines reifen Biofilms führten, der das Gerät verstopfen konnte. Eine mechanische Simulation der Strömung durch das Gerät zeigt, dass sich die Fäden anfangs entlang der Stromlinien des Fluids ausrichten.Außerdem entstehen Str&ouml;mungsfilamente in der Anfangsphase an Stellen mit der h&ouml;chsten Str&ouml;mungsgeschwindigkeit. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verst&auml;ndnis daf&uuml;r haben, wie sich Biofilm-Str&ouml;mungsfilamente in einer mikrofluidischen Umgebung bilden und entwickeln. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Bakterien &auml;u&szlig;erst gef&auml;hrlich sein kann, und w&auml;hrend der Durchf&uuml;hrung dieses Verfahrens stets Vorsichtsma&szlig;nahmen wie Biosicherheitsprotokolle getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

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