Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bildung von bakteriellen Streamern in einem mikrofluidischen Gerät mit Mikrosäulen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der mikrofluidische Chip hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die getesteten Bakterien, in diesem Fall die Pseudomonas-Fluoreszenz, zu kultivieren.

Die letzten Schritte bestehen darin, den Versuchsaufbau zusammenzubauen, die Bakterien in den Mikrofluidik-Chip zu injizieren und Daten zu sammeln. Letztendlich können die Ergebnisse die zeitliche Entwicklung von Streamern durch Grippefluoreszenzmikroskopie-Bilder zeigen. Die visuelle Demonstration dieses Metalls ist von entscheidender Bedeutung, da die verschiedenen Schritte schwer zu erlernen sind.

Aufgrund des interdisziplinären Charakters des Experiments erfordert dieses Verfahren Siliziumwafer mit tiefreaktivem Ionenätzen. Der Fotolack auf den Wafern sollte abgewaschen werden. Beginnen Sie mit dem Schweigen der Meisterform.

Geben Sie zwei oder drei Tropfen Trichlorethylen in ein Fläschchen und legen Sie es zusammen mit dem Formdesign nach oben daneben in ein Trockenmittel. In zwei oder drei Stunden ist die Form siloisiert. Bereiten Sie während der Siloisierung die PDMS-Mischung Zigarre 1 8 4 Silikonbasis mit einem Härter im Verhältnis 10 zu eins vor.

Anschließend entgasen Sie das PDMS etwa zwei Stunden lang unter Vakuum. Übertragen Sie nun einen siloisierten Wafer auf einen Holder und gießen Sie das PDMS darüber, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Blasen bilden. Lassen Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius auf dem Wafer aushärten.

Dadurch wird aus der gescheimten Silikonform ein A-P-D-M-S-Stempel hergestellt. Wenn die Aushärtung abgeschlossen ist, ziehen Sie den PDMS-Stempel mit Hilfe eines Cutters ab. Schneide dann den Stempel mit dem Cutter in einen mikrofluidischen Chip.

Bohren Sie nun mit einem Schneidkern Löcher am Einlass und an den Außenpositionen des Stempels. Der nächste Schritt besteht darin, den Stempel auf Glas zu kleben. Belichten Sie einen 24-Millimeter-Deckglas und den PDMS-Stempel 30 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma.

Befestigen Sie nach der Belichtung den Deckglas an der Unterseite des PDMS-Stempels und es bildet sich eine Verbindung. Stellen Sie die Montage für 10 Minuten in einen 70 Grad Celsius heißen Ofen. Um den Prozess für dieses Protokoll abzuschließen, bereiten Sie LB-Platten vor, die mit Reinstwasser hergestellt und mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin dosiert werden, das bei 50 bis 55 Grad Celsius zugesetzt wird.

Beim Gießen der Platten können Blasen durch Abflammen zum Platzen gebracht werden. Die abgekühlten und erstarrten Platten sollten datiert und bei vier Grad Celsius in einer Alufolie gelagert werden. Haben Sie auch LB-Brühe mit ultrareinem Wasser zubereitet und mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin dosiert.

Lagern Sie die Brühe bei vier Grad Celsius und ebenfalls in Folie eingewickelt. Nun werden die bei minus 80 Grad Celsius auf den LB-Platten gelagerten Pseudomonas-Fluoreszenzbestände kultiviert, die Platten in einem Zickzackmuster durchstreift und über Nacht bei 30 Grad Celsius im Dunkeln inkubiert. Nehmen Sie am nächsten Tag eine Kolonie vom Teller und impfen Sie einen Kolben mit frisch zubereitetem S one, der über Nacht bei 30 Grad Celsius und 150 U/min geschüttelt wurde.

Messen Sie die optische Dichte der Kultur nach der Inkubation. Machen Sie dann die S zwei Lösung. Geben Sie fünf Milliliter LB in ein Kunststoffröhrchen und fügen Sie dann genügend S eins-Lösung für einen OD bei 600 Nanometern von 0,1 hinzu, was typisch für ein Biofilmexperiment ist.

Richten Sie zunächst das Experiment mit einer Pinzette ein Verbinden Sie Kunststoffrohre mit einem Innendurchmesser von 0,20 Zoll mit den Ein- und Auslässen des vorbereiteten Chips. Die Rohre müssen flexibel und ausreichend lang sein. Hier sind sie etwa 20 Zoll groß.

Füllen Sie dann die Spritzen mit der S two-Lösung. Befestigen Sie 30 Gauge stumpfe Nadeln und entfernen Sie Blasen. Das Verhindern des Eindringens von Luftblasen in den Kanal ist ein kritischer Schritt, insbesondere aufgrund der Leitungsdauer des Experiments.

Blasen können die weichen Strukturen, die von den Bakterien gebildet werden, schädigen. Verbinden Sie dann die Spritzen mit den Einlaufschläuchen und verbinden Sie die Auslassschläuche mit Abfallbehältern. Setzen Sie nun die Spritzen in eine Spritzenpumpe ein und stellen Sie die Pumpe auf die gewünschte Durchflussrate ein, z. B. acht Mikroliter pro Stunde an einem Mikroskop, das mit einer auf die Inkubationstemperatur eingestellten Zellkammer ausgestattet ist.

Verwenden Sie vielleicht ein 40-fach-Objektiv, um den Mikrofluidik-Chip zu betrachten. Starten Sie nun die Pumpe. Wenn die Bakterien in die Kammer eingebracht werden, wird auch die Biofilmbildung eingeleitet.

Der Biofilm bildet sich und reift über Stunden, Tage, und nimmt Bilder auf, um seinen Fortschritt zu verfolgen. Mit SEMA wurde ein hergestellter mikrofluidischer Chip abgebildet. Der gabelähnliche Eingang dient dazu, den Druckkopf über das Gerät auszugleichen.

Zu erkennen ist auch, dass die Pfeilerwände fast senkrecht stehen. Um die Biofilmbildung zu untersuchen, wurden Fluoreszenz mit acht Mikrolitern pro Stunde in das Gerät injiziert. Die Biofilmbildung begann nach einigen Minuten der Infusion der verdünnten Bakterienkultur.

Nach einigen Stunden wurde jedoch das Auftreten von filamentösen Strukturen beobachtet, die sich zwischen Mikrosäulen in der Nähe des Mittelteils erstrecken. Die gestrichelte Ellipse grenzt einen sich bildenden Streamer ab, der an einem Ende mit dem Polbereich einer der Mikrosäulen verbunden ist. Luftschlangen waren auch entlang der Diagonale zwischen zwei Mikrosäulen zu sehen.

Die Dicke der Streamer nahm mit der Zeit aufgrund der Zellteilung sowie des Einbaus von Planktonbakterien zu. Sie vermehrten sich auch mit Zeitstreamern, die ein großes Volumen im Gerät einnahmen, was zur Bildung eines reifen Biofilms führte, der das Gerät verstopfen könnte. Eine mechanische Simulation der Strömung durch das Gerät zeigt, dass sich die Streamer zunächst entlang von Strömungslinien orientieren.

Darüber hinaus entstehen Streamer in der Anfangsphase an den Stellen mit der höchsten Strömungsgeschwindigkeit. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie sich Biofilm-Streamer in einer mikrofluidischen Umgebung bilden und entwickeln. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bakterien äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Biosicherheitsprotokolle getroffen werden sollten.