Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane THP 1-Makrophagen mit hoher Zellviabilität und ohne Zellaktivierung zuverlässig zu transfizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst 48 Stunden lang THP 1-Monozyten vordifferenziert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die vorzeitigen TP-1-Makrophagen abzulösen.

Der dritte Schritt besteht darin, die Zellen mit IRNA oder Plasmid-DNA zu transfizieren, wobei die Nukleofaktor-Technologie von Lonza verwendet wird. Die letzten Schritte sind die Neuaussaat und weitere Differenzierung der Zellen. Letztendlich kann ein erfolgreicher Gen-Knockdown oder eine Überexpression durch quantitative Echtzeit-PCR, Western Blot zurück und so weiter nachgewiesen werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Transfektionsansätzen wie der Lipofektion besteht darin, dass wir eine hohe Transfektionseffizienz bei gleichzeitig hoher Zellviabilität erreichen können und dass wir die Funktion und das Verhalten der Mikrophagen nicht verändern. Leider ist diese Technik nicht für Anwendungen mit hohem Sput geeignet, da für dieses Protokoll keine intensivere Transfektion auf einmal durchgeführt werden kann. Lassen Sie 24 Stunden vor der Transfektion THP 1-Zellen in RPMI 1640 mit 10 % FCS und mit 1 % Streptokokken L-Glutamin kultivieren, die Zellen spalten und ihnen frische Medien zur Verfügung stellen.

Am nächsten Tag. Differenzieren Sie die Zellen vor, indem Sie nach 48 Stunden 10 bis 15 Millionen Zellen in einen 75 Quadratzentimeter großen Gewebekolben mit den folgenden Zusätzen zum ergänzten RPMI-Medium, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1 % Natriumpyruvat, 10 Nanogramm pro Milliliter, PMA und 50 mikromolares Beta-Mercaptoethanol säen, das Medium aspirieren und durch sechs Milliliter Accutane ersetzen. Eine erwärmte sich auf 37 Grad Celsius, um die Zellen abzulösen.

Inkubieren Sie sie während der Inkubation 30 Minuten lang. Bereiten Sie ausreichend Transfektionsmedium und Kultivierungsmedium für die Nachsorge der Zellen nach der Nukleoerkrankung vor. Überprüfen Sie nach 30 Minuten, ob sich die Zellen gelöst haben und schauen Sie sich um.

Wenn noch Zellen anhaften, pumpen Sie den Kolben vorsichtig mit einer Mikropipette oder lösen Sie sie durch einfaches Rühren. Verwenden Sie keinen Schaber. Die Suspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 300 G und Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand durch Aspiration entfernt und das Zellpellet wieder suspendiert.

In einem Milliliter RPMI, Medium auf 37 Grad Celsius vorwärmen, die Zellen zählen und Mikroabfallröhrchen-Aliquots mit zwei bis zweieinhalb Millionen Zellen für die sofortige Transfektion herstellen. Eine schnelle Ausführung dieses Protokolls ist unerlässlich. Um einen Verlust des Zelltodes zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass Sie alle Materialien im Voraus vorbereitet haben Zuerst zentrifugieren Sie alle Transfektionsaliquote für 10 Minuten bei 250 GS und bei Raumtemperatur, während sie sich drehen, beladen Sie alle Nukleoeffektor-Tierärzte mit einem halben Mikrogramm Plasmid-DNA oder einem Mikrogramm SI-RNA Verwenden Sie eine hochkonzentrierte Verdünnung, so dass sie ein minimales Volumen des Tierarztes einnehmen.

Aspirieren Sie nun den Überstand aus nur einem der Zellaliquots resus. Suspendieren Sie die Zellen auf 100 Mikroliter in Nukleofaktorlösung. Lassen Sie die Zellen nicht länger als 15 Minuten der Lösung ausgesetzt bleiben.

Übertragen Sie die Zellen in den Q Vet und mischen Sie sie mit sanftem Klopfen um. Transfizieren Sie dann die Zellen mit dem Programm Y 0 0 1 an einem B-Nukleofaktor des Modells zwei. Bewegen Sie die elektroporierten Zellen mit einer Einwegpipette in ein Reaktionsgefäß und geben Sie sofort einen halben Milliliter vorgewarntes Transfektionsmedium in die Zellen.

Wiederholen Sie nun den Vorgang mit jedem Aliquot der Zellen nacheinander, bis sie alle transfiziert sind. Nach Abschluss der Nukleobektion wird jede Transfektion von Zellen in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 2,5 Millilitern warmem Transfektionsmedium übertragen. Mischen Sie jede Vertiefung gründlich mit einer Mikropipette.

Nachdem Sie alle geladenen Platten vier Stunden lang inkubiert haben, überprüfen Sie den Zustand der Zellen unter einem Mikroskop. Nach vier Stunden sollten die meisten Zellen bei Bedarf auf die Platte geklebt werden. Höchstens.

Eine weitere Stunde Inkubation wird ausreichend Zeit bieten, indem Sie einen Brunnen nach dem anderen arbeiten. Aspirieren Sie das Transfektionsmedium von den verklebten Zellen und ersetzen Sie es durch ein gleiches Volumen warmes Kultivierungsmedium. Achten Sie darauf, dass sich die Zellen während dieses Schritts nicht ablösen.

Inkubieren Sie nun die Zellen so lange wie nötig. Tauschen Sie das Medium bei Bedarf alle 48 Stunden aus und planen Sie die Behandlungen, so dass sie enden, wenn die transfizierte DNA oder RNA ihre maximale Wirkung erreicht hat. Bei der Behandlung der Zellen mit Effektoren ist ein serumfreies Medium ohne PMA und ohne Beta-Mercaptoethanol zu verwenden.

Achten Sie darauf, dass die Zellen nicht länger als 24 Stunden ohne Serum inkubieren. Das Protokoll wurde verwendet, um THP 1-Makrophagen mit IRNA-Zellmorphologie zu transfizieren. Nach durchflusszytometrischer Messung.

Die Apoptose- und Nekroserate in den Zellen war sowohl in transfizierten als auch in Kontrollkulturen gering. Sorgfältige Zählungen zeigten jedoch, dass sowohl die Apoptose als auch die Nekrose bei den transfizierten Proben etwas höher waren. Dies könnte daran liegen, dass transfizierte THP-1-Makrophagen schwieriger von den Platten zu lösen waren als UNT-transfizierte Zellen.

Insgesamt lagen die Transfektionsraten bei über 90 %, wie mittels Durchflusszytometrie analysiert wurde. Unter Verwendung von Fluoreszenz-S-I-R-N-A-Transfektionseffizienz wurde auch durch die Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Die Funktionalität der Transfektion wurde durch genetischen Knockdown der IL 10 RB-Expression gezeigt.

Verwendung kurzer interferierender RNA Einmal gemeistert, kann die Transfektion in ein bis eineinhalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist zu bedenken, dass das Nährmedium einen erheblichen Einfluss auf die Leistung hat. Dies ist im Textprotokoll beschrieben.