Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Luciferase reports-Konstrukte in rohe 2, 6, 4, 0,7 Zellen zu transfizieren, ohne die Zellen zu aktivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst rohe 2, 6, 4, 0,7 Zellen von einer Stammplatte durch schonendes Pipettieren und Aussäen von Zellen in eine mit 24 Vertiefungen behandelte Gewebekulturplatte geerntet werden. Der zweite Schritt besteht darin, den Firefly-Luciferase-Bericht des Plasmids zu transfizieren und die Kontrolle führte das Luciferase-Plasmid in die Zellen ein.

Diese Plasmide müssen frei von Endotoxinen sein. Anschließend werden die Zellen mit den gewünschten Behandlungen stimuliert, gefolgt von einer Zelllyse und dem Transfer auf eine weiße 96-Well-Platte mit klarem Boden. Der letzte Schritt besteht darin, die Luciferase-Aktivität von Glühwürmchen zu testen und dann die Luziferase-Aktivität auszuführen, um das Verhältnis von Glühwürmchen zu berechnen.

Letztendlich wird die Faltenänderung im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle verwendet, um die Wirkung von Reizen auf den Luzifer-Reporter zu zeigen, die mit dem Expressionsniveau des interessierenden Gens korreliert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen Transsektion über Nacht besteht darin, dass die Transektzellen in ihrem Ruhezustand gehalten werden, ohne die Zellen zu schädigen. Die karierte DNA, die für die Transfektion verwendet werden sollte, wurde zuvor mit einem kommerziell erhältlichen Maxi-Prep-Kit extrahiert und in 500 Mikrolitern TE-Puffer resuspendiert.

Da das Vorhandensein der bakteriellen Zellwandkomponente Lipopolysaccharid oder LPS die Transfektion stört, müssen verbleibende bakterielle Verunreinigungen in einem Abzug aus der DNA entfernt werden. Geben Sie 500 Mikroliter Phenylchloroform-Isoamylalkohol zur Plasmid-DNA und schütteln Sie sie 15 Sekunden lang kräftig. Seien Sie vorsichtig, da Phenol schwere Hautverbrennungen verursacht.

Inkubieren Sie das Gemisch fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 13.000 μg und übertragen Sie 350 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen. Geben Sie 350 Mikroliter TE-Puffer in das Röhrchen, das die untere organische Phase enthält. 15 Sekunden lang kräftig schütteln.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 13.000 mal G. Bei Raumtemperatur werden 350 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in das gleiche 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen überführt. Fügen Sie 70 Mikroliter einer Natriumacetatlösung hinzu und mischen Sie gut.

Fügen Sie 700 Mikroliter 100% Isopropanol hinzu. Gut mischen und 10 Minuten lang mit einer Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 13.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie das Supinat und fügen Sie 500 Mikroliter 75%iges Ethanol zum Pellet hinzu Mischen Sie die Proben und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, entfernen Sie den Überstand.

Die Plasmid-DNA befindet sich im Pellet. Öffnen Sie die Kappe des Rohrs und trocknen Sie das Pellet fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Das Pellet sollte durchscheinend werden.

Geben Sie 500 Mikroliter TE-Puffer zum DNA-Pellet und erhitzen Sie es 10 Minuten lang auf 50 bis 60 Grad Celsius, um das DNA-Pellet aufzulösen. Messen Sie abschließend die Absorption der DNA-Suspension bei 260 Nanometern und 280 Nanometern mit einem Spektrometer. Um die Konzentration der DNA zu berechnen und ihre Qualität zu beurteilen, wurden die rohen 2 6 4 0,7 Makrophagenzellen in DMEM mit 9 % fötalem Kälberserum in einem 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator ergänzt und alle zwei Tage durchgelassen.

Ersetzen Sie bei jeder Passage das alte Medium durch ein kleineres Volumen frisches Medium und lösen Sie die Zellen von der Platte, indem Sie das Saatgut schonend kontinuierlich pipettieren. 1,5 bis 2 Millionen Zellen auf einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale als Brühe am Tag des Transfektionssaatguts, 200.000 Zellen pro Well.

In einer 24-Well-Platte mit einem Volumen von 500 Mikrolitern DMEM 9%FCS inkubieren die Zellen vier Stunden lang im 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Um dieses Verfahren zu beginnen, erwärmen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur im dunklen Warmup, serumfreien Medium und DMEM 9 % FCS auf 37 Grad Celsius. Geben Sie 0,5 Mikrogramm Plasmid-DNA zu 50 Mikrolitern serumfreiem Medium in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie zwei Mikroliter Transfektionsreagenz mit einer Pipettenspitze sechs Sekunden lang unter die Oberfläche des Flüssigkeitswirbels. Lassen Sie das Reagenz-DNA-Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Entfernen Sie während der 30-minütigen Inkubation das Medium aus den Vertiefungen der 24-Well-Platte und fügen Sie jeweils 250 Mikroliter frisches DMEM 9 %FCS hinzu.

Nun, stellen Sie die Platte nach 30 Minuten wieder in den Inkubator. Geben Sie 250 Mikroliter DMEM 9%FCS in die Reagenz-DNA-Mischung und mischen Sie sie gut, indem Sie Auf und Ab reinigen, geben Sie 300 Mikroliter der verdünnten Mischung in jede Vertiefung der 24-Well-Platte, inkubieren Sie zwei bis vier Stunden lang in einem 37 Grad Celsius 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Entfernen Sie nach zwei bis vier Stunden die Transfektionslösung und fügen Sie 500 Mikroliter DMEM 9%FCS hinzu, inkubieren Sie 24 bis 48 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie das serumfreie Medium und DMEM 9% FCS auf 37 Grad Celsius erwärmen. 0,75 Mikroliter des Transfektionsreagenzes zu 18,75 Mikrolitern des Serum-Wirbels des freien Mediums kurz zum Mischen geben und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie anschließend 0,5 Mikroliter einer DNA-Lösung von einem Mikrogramm pro Milliliter für 10 Minuten in das verdünnte Transfektionsreagenz bei inkubierter Raumtemperatur.

Entfernen Sie während der 10-minütigen Inkubation das Medium aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und geben Sie nach 10 Minuten 250 Mikroliter frisches DMEM 9 %FCS in jede Vertiefung. Geben Sie 250 Mikroliter DMEM 9%FCS in die Reagenz-DNA-Mischung. Geben Sie 270 Mikroliter der verdünnten Mischung in jede Vertiefung des 24-Well-Platteninkubators und inkubieren Sie zwei bis vier Stunden lang in einem 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator.

Entfernen Sie nach zwei bis vier Stunden die Transfektionslösung und fügen Sie jeweils 500 Mikroliter DMEM 9%FCS hinzu. Inkubieren Sie 24 bis 48 Stunden lang in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und einem Kohlendioxidgehalt. 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion können die Zellen stimuliert und auf ihre Luciferase-Aktivität untersucht werden.

Ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch 250 Freisetzungen von frischem DMEM 9 %FCS. Geben Sie 50 Mikrofreisetzungen LPS oder LPS plus das entzündungshemmende Zytokin IL 10 in den gewünschten Konzentrationen in die Vertiefungen. Stellen Sie die Platte wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und stimulieren Sie zwei bis sechs Stunden. Entfernen Sie anschließend die Stimulationslösung durch Aspiration.

Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS und fügen Sie jeweils 200 Mikroliter eines x passiven Lysepuffers hinzu. Den Teller bei Raumtemperatur 30 Minuten gut schaukeln. Nach 30 Minuten das Lysat abkratzen und in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und Zelltrümmer durch 20.000-maliges Zentrifugieren entfernen.

G für 10 Minuten von vier Grad Celsius. Übertragen Sie 40 Mikroliter des klaren Lysats auf ein weißes klares. Die untere 96-Well-Platte misst das Lucifer-Signal mit einem Luminometer über das gesamte sichtbare Lichtspektrum.

Gemäß dem Protokoll des Herstellers ergab eine niedrige zytometrische Analyse von Zellen, die mit einem GFP-exprimierenden Plasmid transfiziert wurden, dass das lipidbasierte Reagenz eine Transfektionsrate von etwa 25 % ergab, während die Proteinpolyamid-basierte Transfektion zu einer Rate von etwa 5 % führte. Der Unterschied in der Transfektionseffizienz wurde auch bei Luciferase-Signalen in Zellen beobachtet, die mit der Promotorregion von I capa b Zeta transfiziert wurden. Die Zugabe von LPS erhöhte das Glühwürmchen-Luziferase-Signal. Typischerweise werden die Zellen mit einem Kontrollplasmid co-transfiziert, das das ran-Luciferase-Gen enthält, und die Glühwürmchen-Luciferase-Signale werden auf das ran-Luciferase-Signal normiert.

Der Vergleich der normierten Signale zwischen unbehandelten und behandelten Proben zeigte, dass LPS hochreguliert, die Aktivität des Promotorreporters und IL 10 die Wirkung von LPS hemmt. Der Vergleich der Ruhezeit zwischen Transfektion und Stimulation zeigte, dass die Luziferase-Signale mit der Zeit abnahmen, so dass dies nur die Dateninterpretation beeinflusste. Als das Protein Polyamin-basiertes Transfektionsreagenz verwendet wurde, um die Auswirkungen jeder Transfektionsmethode auf den Zelltod zu bewerten, wurden die Zellen mit Annexin fünf und Propidiumiodid gefärbt und nur durch Durchflusszytometrie analysiert.

Durch die lipidbasierte Transfektion stieg der Anteil von Annexin fünf positiven Zellen leicht an. Das Immuno-Blatting zeigte, dass die lipidbasierte Transfektion den Anteil des gespaltenen Poly-a-DP-Ribose-Polymerase-Proteins leicht erhöhte. Während die Transfektion auf Proteinpolybasis dies nicht tat.

Trotz der erhöhten Anzahl apoptotischer Zellen veränderte sich die Morphologie der Zellen durch Lichtmikroskopie nicht. Noch wichtiger ist, dass die biologische Reaktion der lipidbasierten transfizierten Zellen identisch mit der der nicht resezierten Zellen blieb, beide produzierten ähnliche Mengen an TNF alpha als Reaktion auf LPS und wurden durch die Zugabe von IL 10 gehemmt. Es wurde kein TNF alpha gebildet, wenn die Zellen nicht stimuliert wurden, was darauf hindeutet, dass die Zellen nach der Transfektion naiv bleiben.

Nach dem Waschen dieses Videos haben die Benutzer ein gutes Verständnis dafür, wie rohe 2, 6, 4, 0,7 Zellen mit Luzifer-berichteten Plasmen auf minimal-invasive Weise übersetzt werden können, ohne die native Reaktion der Zellen zu verändern.