Name: Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Erfahren Sie eine schonende Transfektionsmethode für Luciferase-Reportergene in RAW264.7-Makrophagenzellen ohne Aktivierung der Immunantwort. Dieses Verfahren ermöglicht präzise Genexpressionsanalysen in ruhenden Zellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Studie wurde durch einen Zuschuss der Canadian Institutes for Health Research (CIHR) finanziert. STC ist Träger eines Doktorandenpreises des CIHR und der Michael Smith Foundation. Das EYS ist Stipendiat des CIHR. Das CIHR Transplantation Training Program vergab auch Graduiertenstipendien an STC, EYS und SS.

1. Plasmid DNA Purification <ol><li> Extrahieren von Plasmid-DNA unter Verwendung eines Maxiprep-Kit nach Vorschrift des Herstellers. Resuspendieren Plasmid-DNA in 500 ul TE Puffer. </li><li> Führen eine Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Extraktion und Isopropanol-Fällung Rest bakterielle Verunreinigungen zu entfernen. Die Anwesenheit von LPS stört Transfektion 9. <ol><li> Gib 500 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1, pH 8) mit der Plasmid-DNA und kräftig geschüttelt, für 15 sec. Phenol verursacht schwere Verätzungen der Haut und ist ein Narkosemittel so Verbrennungen sind nicht immer das Gefühl, bis es zu schweren Schäden. Führen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Extraktion in der Abzugshaube und seien Sie vorsichtig. </li></ol></li><li> Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT. Zentrifugieren bei 13.000 xg für 10 min bei RT. Übertragen Sie 350 ul der obere wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Collection-Tube. </li><li> Mit 350 ul TE-Puffer zu dem Rohr, das die untere organische Phase enthält. Kräftig schütteln für 15 Sekunden. Zentrifugieren bei 13.000 xg für 5 Minuten bei RT. Übertragen Sie 350 ul der oberen wässrigen Phase auf den gleichen 1,5-ml-Collection-Tube. </li><li> In 70 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und gut mischen. Add 700 ul 100% iges Isopropanol. Gut mischen und inkubieren 10 min bei RT. Zentrifuge bei 13.000 g für 10 MiNaT 4ºC. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l 75% Ethanol zu dem Pellet. Wirbel Proben bei 5000 xg mischen und Zentrifuge 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. DNA in dem Pellet. </li><li> Öffnen Sie den Deckel des Röhrchens und der Luft trocknen das Pellet bei RT 5 - 10 min. Das Pellet sollte durchscheinend. Gib 500 ul TE-Puffer, um das DNA-Pellet zu resuspendieren. Erwärmen bei 50 - 60 ° C für 10 min, um das DNA-Pellet zu lösen. </li><li> Die Absorption bei 260 nm (A260) und 280 nm (A280) mit einem Spektrometer. Berechnen Sie die Konzentration von DNA durch Multiplikation der A260-Wert von 50 ng / &amp; mgr; l. Bewerten Sie die Qualität der DNA durch calculating die A260 / A280-Verhältnis. 2.0 - DNA mit hoher Qualität sollte eine A260 / A280-Verhältnis von 1,8 zu ergeben. </li></ol> 2. Zellkultur und Seeding <ol><li> Kultur RAW264.7-Zellen in DMEM, ergänzt mit 9% fötales Kälberserum (DMEM / 9% FCS) in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Bei jedem Durchgang, nehmen die Zellen von der Platte durch kontinuierliches Pipettieren mit einer Pasteurpipette. Passage die Zellen alle 2 Tage, und Samen von 1,5 bis 2.000.000 Zellen auf einer 10 cm Gewebekulturschale behandelt als Lager. Tauwetter ein neues Lager von Zellen alle 5 - 6 wochen. </li><li> Am Tag der Transfektion wurden Samen 200.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen in einem Volumen von 500 &amp; mgr; l DMEM / 9% FCS. Inkubieren der Zellen für 4 Stunden in den 37 ° C-Inkubator. </li><li> Transfektion von Zellen, die entweder mit dem Lipid-Reagens (Schritt 3.1) oder dem Protein / Polyamin-Reagens (Schritt 3.2). </li></ol> 3. Transfektion <ol><li> Lipid basierende Transfektion: <ol><li> Aufwärmen der Transfektion reagent, um in der Dunkelheit auf RT. Warm up Serum-freien Medium und DMEM / 9% FCS auf 37 ° C. </li><li> Mit 0,5 ug Plasmid-DNA in 50 ul serumfreiem Medium in einem 1,5-ml-Röhrchen. Add 2 ul Transfektionsreagenz mit der Pipettenspitze unterhalb der Oberfläche der Flüssigkeit. Vortex 6 Sek. </li><li> Verlassen das Reagenz / DNA-Mischung im Dunkeln bei RT für 30 min. </li><li> Während der 30-minütigen Inkubation, entfernen Sie die Medien aus dem Brunnen und fügen Sie 250 ul frischem DMEM / 9% FCS in jede Vertiefung. </li><li> Nach 30 min, fügen 250 ul DMEM / 9% FCS zu dem Reagenz / DNA-Gemisch. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Werden 300 ul des verdünnten Gemisches in jede Vertiefung. Inkubieren für 2-4 h in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Entfernen Transfektionslösung und fügen Sie 500 ul DMEM / 9% FCS. Inkubieren für 24 bis 48 h in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator vor der Zellstimulation. </li></ol></li><li> Protein / Polyamin basierende Transfektion: <ol><li> Warm up Serum-freienmittlere und DMEM / 9% FCS auf 37 ° C. </li><li> Hinzuzufügen 0,75 ul Transfektionsreagenz auf 18,75 &amp; mgr; l serumfreies Medium. Vortex kurz mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Mit 0,5 ul 1 ug / ul DNA in die verdünnte Reagenz transfiziert. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Während der 10-minütigen Inkubation, entfernen Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und fügen Sie 250 ul frischem DMEM / 9% FCS in jede Vertiefung. </li><li> Nach 10 min, fügen 250 ul DMEM / 9% FCS in das Reagenz / DNA-Gemisch. </li><li> Add 270 ul der verdünnten Mischung auf das gut. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 2-4 Stunden. </li><li> Entfernen Transfektionslösung und fügen Sie 500 ul DMEM / 9% FCS. Inkubieren für 24 bis 48 h in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li></ol></li></ol> 4. Zellstimulation und Luciferase Assay <ol><li> Tauschen Sie Medien in den gut 250 ul frischem DMEM / 9% FCS. </li><li> In 50 ul LPS oder LPS + IL-10 In den gewünschten Konzentrationen zu der Bohrung. Gibt die Platte an die 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator. Regen Sie für 2 - 6 h. </li><li> Entfernen Stimulationslösung durch Absaugen, Waschen mit eiskaltem PBS, und fügen Sie 200 ul 1x Passive Lysis Buffer. Rock bei RT für 30 min. Kratzen und übertragen das Lysat auf 1,5-ml-Röhrchen und entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Transfer 40 ul geklärtes Lysat (Überstand), um einen weißen, clear bottom Platte mit 96 Vertiefungen für die Bestimmung der Luciferase-Signalen gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Lesen Sie das Luciferase-Signal mit einem Luminometer über das gesamte sichtbare Lichtspektrum. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Berechnung der Firefly Renilla Verhältnis durch Dividieren einzelnen Werte von Firefly Luziferase durch die Werte von Renilla-Luciferase aus jeder Vertiefung. </li><li> Berechnen Sie die fache Änderung durch Division der Glühwürmchen: Renilla Verhältnis der behandelten gutder unbehandelten gut. </li></ol>

<ol><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).</li>
<li>Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+transient+transfection+of+a+murine+macrophage+cell+line+RAW+264.7%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7.</a> Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).</li>
<li>Kim, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+ingest+and+are+activated+by+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA.</a> Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).</li>
<li>Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+activation+of+the+RAW264.7+macrophage+cell+line+by+transfected+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA.</a> Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).</li>
<li>Jiang, W., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+HMGB1+release+from+RAW+264.7+cells+by+transfected+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA.</a> Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).</li>
<li>Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+inducible+gene+expression+by+signal-dependent+transcriptional+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation.</a> Cell. 138 (1), 129-147 (2009).</li>
<li>Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+inhibits+lipopolysaccharide+induced+miR-155+precursor+stability+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation.</a> PLoS One. 8 (8), e71336(2013).</li>
<li>Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+technical+reports.+Effects+of+lipopolysaccharide+on+transfection+efficiency+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells.</a> Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).</li>
<li>Berghaus, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).</li>
<li>Fiszer-Kierzkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+DNA+carriers+may+induce+cellular+stress+response+and+change+gene+expression+pattern+in+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Protokoll nicht allein auf die Transfektionseffizienz zu konzentrieren, sondern zielt darauf ab, einen Ausgleich zwischen Effizienz und Erhaltung der physiologischen Zustände der Zellen zu schlagen. Insbesondere gelingt es unserem Verfahren bei der Minimierung der Toxizität von Transfektionsreagenz und Maximierung der Luciferase-Signal. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Gesundheit der Zellen. Wuchert Kulturen nicht geeignet sind für die Transfektion als ihre P...

Transfektion von Nukleinsäuren in Zellen hat eine vielfältige Anwendung in der wissenschaftlichen Forschung. Beispiele umfassen (1) Reportergene, die Rolle des anderen Gen Elemente Genexpression zu untersuchen, (2) Protein-Expressionsplasmiden, um das Protein von Interesse überexprimiert, und (3) kleine interferierende RNA die Genexpression herunterregulieren. Durch Manipulation des Expressionsniveaus bestimmter Gene und Messen des Differentialwirkung solcher Manipulationen können Forscher die Genfunktionen in den ausgewählten biologischen Systemen abzuleiten. Nicht alle Transfektionsverfahren die gleichen Transfektionseffizienzen und sogar die gleichen Transfektionsverfahren nicht alle Zelltypen ebenso 1 transfizieren. Daher verschiedene Transfektionsverfahren entwickelt worden, wie beispielsweise Calciumphosphat-Verfahren, DEAE-Dextran, kationische Lipid-Transfektion, kationische Lipid-Polymer nicht-Transfektion, Elektroporation und Nukleofektion 2,3. Transfektion in Makrophagen ist ESPEsondere schwierig aufgrund der Tatsache, dass Makrophagen sind professionelle Phagozyten, die sehr empfindlich gegenüber Fremdmaterialien einschließlich Bakterien stammt (methyliert) DNA 4 sind. Einführung fremder DNA aktiviert den Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) Weg führt zu der Produktion von Cytokinen und Stickstoffmonoxid 5,6. Diese aktivierten Makrophagen können dann weniger, die auf die Behandlung, die die Forscher beabsichtigen, zu untersuchen. Unser Labor routinemäßig transfiziert den RAW264.7 Makrophagen-Zelllinie mit Luciferase-Reporter-Gene, und wir haben ein Protokoll, das robust genug ist, um die Luciferase-Signal deutlich höher als Hintergrund zu haben ist auch sanft genug für Makrophagen an ihren Ruhezustand bleiben entwickelt, aber. Die Verhaltensweisen der transfizierten Zellen wurden durch ein Glühwürmchen-Luciferase-Reporter-Gen beherbergen, das die Promotorregion des IκBζ (pGL3- IκBζ) bewertet. IκBζ Expression durch die Bakterienzellwand-Komponente Lippe hochreguliertopolyssacharide (LPS) 7,8 und durch die anti-inflammatorische Cytokin regulierte, Interleukin-10 (IL-10) 8. Um für die Transfektion Variation unter Brunnen Konto, kooperieren wir Transfektion ein Steuer Plasmid, das das Renilla-Luciferase-Gen (zB phRL-TK) zur Normalisierung Zwecke. Das beschriebene Protokoll wird nach der Prüfung verschiedener Parameter einschließlich Timing Transfektion Typ Transfektionsreagenzien Mengen von Transfektionsreagenzien und von Plasmid-DNA sowie Verhältnis von Transfektionsreagenz Plasmid-DNA optimiert. Die beiden Transfektionsreagenzien in diesem Protokoll enthalten sind (1) eine auf Lipid basierenden Transfektionsreagenz, und (2) ein Protein / Polyaminbasis Transfektionsreagenz.

<table><tbody><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210007</td><td>Jedes Maxiprep-Kit funktioniert</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol</td><td>Life Technologies</td><td>15593-049</td><td>Molekularbiologische Qualität. Phenol ist giftig, also arbeiten Sie, wenn möglich, im Abzug. Verwenden Sie die untere durchsichtige organische Schicht, wenn sich zwei Schichten Flüssigkeit im Behälter bilden.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30243.01</td><td>Warm in 37 ° C Wasserbad vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td>Inaktiviert bei 56 μd; C Wasserbad für 45 min vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Vor Gebrauch mindestens auf Raumtemperatur erwärmen.</td></tr><tr><td>XtremeGene HP DBA Transfektionsreagenz</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.</td></tr><tr><td>GeneJuice</td><td>EMD Millipore</td><td>70967</td><td>Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.</td></tr><tr><td>5x Passiver Lysepuffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>30 ml ist im Dual Luciferase Reporter Assay System</td></tr><tr><td>enthalten Dual Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr></tbody></table>

transfizieren raw264.7-zellen mit einem luciferase-reportergen

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Die Transfektion von erwünschtem genetischem Material in Zellen ist ein unvermeidliches Verfahren in biomedizinischen Forschungsstudien. Obwohl zahlreiche Methoden beschrieben wurden, sind bestimmte Zelltypen gegen viele dieser Methoden resistent und führen zu einer geringen Transfektionseffizienz1, was die Forschung an diesen Zelltypen möglicherweise behindert. In diesem Protokoll stellen wir ein optimiertes Transfektionsverfahren vor, um Luciferase-Reportergene als Plasmid-DNA in die Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 einzuführen. Es werden zwei verschiedene Arten von Transfektionsreagenzien (lipidbasiert und polyaminbasiert) beschrieben, und im gesamten Protokoll werden wichtige Hinweise gegeben, um sicherzustellen, dass die RAW264.7-Zellen durch das Transfektionsverfahren minimal verändert werden und alle erhaltenen experimentellen Daten die direkten Ergebnisse der experimentellen Behandlung sind. Obwohl die Transfektionseffizienz im Vergleich zu anderen Transfektionsmethoden möglicherweise nicht höher ist, ist das beschriebene Verfahren robust genug, um das Luciferase-Signal in RAW264.7 zu detektieren, ohne die physiologische Reaktion der Zellen auf Reize zu verändern.

Figur 1 vergleicht die Transfektionseffizienz der beiden Transfektionsreagenzien in RAW264.7. Das Lipid-Reagens ergab typischerweise etwa 25% Transfektionsrate während das Protein / Polyamin-basierende Transfektion führte zu etwa 5% Wirkungsgrad (1A). Der Unterschied in der Transfektionseffizienz wurde auch in Luciferase Signale in RAW264.7-Zellen mit den pGL3-Promotorreporter IκBζ (1B) transfiziert beobachtet. Zugabe von LPS zu diesen transfizierten Zellen erhöhte Leuc...

Die Transfektion in die Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 ist aufgrund der natürlichen Reaktion der Zelle auf Fremdmaterialien schwierig. Wir haben hier ein schonendes und dennoch robustes Verfahren zur Transfektion von Luciferase-Reportergenen in RAW264.7-Zellen beschrieben.

Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Luciferase-Reporterkonstrukte in RAW 264.7-Zellen zu transfizieren, ohne die Zellen zu aktivieren. Dies wird erreicht, indem RAW 264.7-Zellen zunächst durch vorsichtiges Pipettieren von einer Starterplatte abgenommen und in eine 24-Loch-Zellkulturplatte ausgesät werden. Im zweiten Schritt erfolgt die Cotransfektion des Firefly-Luciferase-Reporterkonstrukts zusammen mit dem Kontrollplasmid für Renilla-Luciferase in die Zellen.Diese Plasmide müssen endotoxinfrei sein. Anschließend werden die Zellen mit den gewünschten Behandlungen stimuliert, gefolgt von Zelllyse und Übertragung in eine weiße 96-Well-Platte mit klarem Boden. Der letzte Schritt besteht darin, die Aktivität von Feuerfliegen-Luciferase zu bestimmen und anschließend die Renilla-Luciferase-Aktivität zu messen, um das Verhältnis von Feuerfliegen- zu Renilla-Luciferase zu berechnen.Schließlich wird die Fold-Change im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle verwendet, um den Effekt der Stimuli auf den Luciferase-Reporter darzustellen, der mit der Expressionshöhe des Gens von Interesse korreliert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen Übernacht-Transfektion besteht darin, dass die transfizierten Zellen in ihrem Ruhezustand gehalten werden und die Zellen nur minimal geschädigt werden. Die für die Transfektion verwendete Plasmid-DNA war zuvor mit einem kommerziell erhältlichen Maxi-Präp-Kit extrahiert und in 500 Mikrolitern TE-Puffer resuspendiert worden.Da die Anwesenheit der bakteriellen Zellwandkomponente Lipopolysaccharid oder LPS die Transfektion stören kann, müssen verbleibende bakterielle Kontaminanten im Abzug von der DNA entfernt werden. Geben Sie 500 µL Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zur Plasmid-DNA hinzu und schütteln Sie kräftig für 15 Sekunden. Seien Sie vorsichtig, da Phenol schwere Hautverbrennungen verursachen kann.Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, zentrifugieren Sie bei 13.000 ×g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und überführen Sie 350 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen. Geben Sie 350 Mikroliter TE-Puffer in das Röhrchen, das die untere organische Phase enthält. Schütteln Sie kräftig für 15 Sekunden.Zentrifugieren Sie bei 13.000 × g für fünf Minuten. Überführen Sie bei Raumtemperatur 350 µL der oberen wässrigen Phase in das gleiche 1,5-mL-Sammelröhrchen. Geben Sie 70 µL einer Natriumacetatlösung hinzu und mischen Sie gründlich.Gebe 700&nbsp;Mikroliter 100&nbsp;% Isopropanol hinzu. Gut mischen und 10&nbsp;Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann 10&nbsp;Minuten bei 13.000&nbsp;×&nbsp;g und 4&nbsp;°C zentrifugieren. Den Überstand entfernen und 500&nbsp;Mikroliter 75&nbsp;% Ethanol zum Pellet geben. Die Proben vortexen, um sie zu mischen, und 5&nbsp;Minuten bei 5.000&nbsp;×&nbsp;g und 4&nbsp;°C zentrifugieren, dann den Überstand entfernen.Die Plasmid-DNA befindet sich im Pellet. Öffnen Sie die Kappe des Röhrchens und trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten lang an der Luft. Das Pellet sollte durchscheinend werden.Geben Sie 500 Mikroliter TE-Puffer zum DNA-Pellet hinzu und erhitzen Sie die Probe 10 Minuten lang auf 50 bis 60 Grad Celsius, um das DNA-Pellet aufzulösen. Messen Sie abschließend die Absorption der DNA-Suspension bei 260 Nanometern und 280 Nanometern mit einem Spektrometer. Um die Konzentration der DNA zu berechnen und ihre Qualität zu beurteilen, werden die rohen 2 6 4 0.7 Makrophagenzellen in DMEM, ergänzt mit 9 % Fötales Kälberserum, in einem 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid-Brutschrank kultiviert und alle zwei Tage passagiert.Ersetzen Sie bei jedem Passagieren das alte Medium durch ein geringeres Volumen frischen Kulturmediums und lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges, kontinuierliches Pipettieren vom Boden der Platte ab. Säen Sie am Tag der Transfektion 1,5 bis 2 Millionen Zellen auf einer 10 cm großen, für Zellkultur behandelten Petrischale als Stammpopulation aus. Verwenden Sie 200.000 Zellen pro Vertiefung.In einer 24-Loch-Platte mit einem Volumen von 500 µL DMEM 9 %FCS die Zellen vier Stunden lang im 37 °C-Inkubator inkubieren. Um diesen Vorgang zu beginnen, erwärmen Sie das Transfektionsreagenz im Dunkeln auf Raumtemperatur, sowie das serumfreie Medium und DMEM 9 %FCS auf 37 °C. Geben Sie 0,5 µg Plasmid-DNA in 50 µL serumfreies Medium in einem 1,5-mL-Röhrchen hinzu.Geben Sie zwei Mikroliter Transfektionsreagenz mit einer Pipettenspitze unter die Oberfläche des Flüssigkeitswirbels und mischen Sie sechs Sekunden lang. Lassen Sie das Reagenz-DNA-Gemisch 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur stehen. Während der 30-minütigen Inkubation entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 24-Loch-Platte und geben jeweils 250 Mikroliter frisches DMEM mit 9 % FCS hinzu.Bringen Sie die Platte nach 30 Minuten erneut in den Inkubator zurück. Geben Sie 250 Mikroliter DMEM mit 9 % FCS zu der Reagenz-DNA-Mischung hinzu und mischen Sie gut durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Fügen Sie 300 Mikroliter der verdünnten Mischung in jedes Loch der 24-Loch-Platte hinzu und inkubieren Sie zwei bis vier Stunden lang in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach zwei bis vier Stunden entfernen Sie die Transfektionslösung und geben 500 Mikroliter DMEM mit 9 % FCS hinzu. Inkubieren Sie weitere 24 bis 48 Stunden in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie serumfreies Medium und DMEM mit 9 % FCS auf 37 Grad Celsius erwärmen. Geben Sie 0,75 µL des Transfektionsreagenz zu 18,75 µL serumfreiem Medium, wirbeln Sie kurz zur Vermischung und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie anschließend 0,5 µL einer DNA-Lösung mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zum verdünnten Transfektionsreagenz hinzu und inkubieren Sie zehn Minuten bei Raumtemperatur.Während der 10-minütigen Inkubation entfernen Sie das Medium aus jedem Well der 24-Loch-Platte und geben nach 10 Minuten 250 µL frisches DMEM mit 9 % FCS in jeden Well. Geben Sie 250 µL DMEM mit 9 % FCS in die Reagenz-DNA-Mischung. Geben Sie 270 µL der verdünnten Mischung in jeden Well der 24-Loch-Platte und inkubieren Sie zwei bis vier Stunden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Nach zwei bis vier Stunden die Transfektionslösung entfernen und 500 Mikroliter DMEM mit 9 % FCS zu jeder Probe hinzufügen. 24 bis 48 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren. 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion können die Zellen stimuliert und auf Luciferase-Aktivität analysiert werden.Ersetzen Sie das Medium in jedem Well durch 250 Freisetzungen frisches DMEM mit 9 % FCS. Geben Sie 50 Mikro-Freisetzungen LPS oder LPS zusammen mit dem antiinflammatorischen Zytokin IL-10 in den gewünschten Konzentrationen in die Wells. Stellen Sie die Platte zurück in den 37 °C, 5 % Kohlendioxid-Inkubator und inkubieren Sie zwei bis sechs Stunden. Entfernen Sie anschließend die Stimulationslösung durch Absaugen.Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS und geben Sie 200 Mikroliter eines x-Passivlysepuffers zu jeder Probe hinzu. Schütteln Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten schaben Sie die Zellen ab, überführen das Lysat in 1,5-Milliliter-Röhrchen und entfernen zelluläre Trümmer durch Zentrifugation bei 20.000 ×g.Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 40 Mikroliter des klaren Lysats in eine weiße, klare 96-Well-Platte und messen Sie das Luciferin-Signal mit einem Luminometer über das gesamte sichtbare Spektrum. Entsprechend der Herstelleranleitung zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse von Zellen, die mit einem GFP-exprimierenden Plasmid transfiziert wurden, dass das lipidbasierte Reagenz eine Transfektionsrate von etwa 25 % ergab, während die Transfektion mittels proteinbasiertem Polyamid eine Rate von etwa 5 % aufwies. Der Unterschied in der Transfektionseffizienz zeigte sich ebenfalls in den Luciferase-Signalen von Zellen, die mit dem Promotorbereich von I capa b Zeta transfiziert wurden. Die Zugabe von LPS erhöhte das Firefly-Luciferase-Signal. Üblicherweise werden die Zellen gleichzeitig mit einem Kontrollplasmid, das das ran-Luciferase-Gen enthält, transfiziert, und die Firefly-Luciferase-Signale werden auf das ran-Luciferase-Signal normalisiert.Der Vergleich der normalisierten Signale zwischen unbehandelten und behandelten Proben zeigte, dass LPS die Aktivität des Promotor-Reporters hochreguliert und IL-10 die Wirkung von LPS hemmt. Der Vergleich der Ruhezeitdauer zwischen Transfektion und Stimulierung ergab, dass die Luciferase-Signale im Laufe der Zeit abnehmen, was sich jedoch nur auf die Dateninterpretation auswirkte. Als das auf Proteinpolyaminen basierende Transfektionsreagenz verwendet wurde, um den Einfluss der einzelnen Transfektionsmethoden auf den Zelltod zu bewerten, wurden die Zellen lediglich mit Annexin V und Propidiumiodid gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert.Die lipidbasierte Transfektion erhöhte leicht den Anteil an Annexin-fünf-positiven Zellen. Die Immunoblot-Analyse zeigte, dass die lipidbasierte Transfektion den Anteil an gespaltenem Poly-ADP-Ribose-Polymerase-Protein leicht erhöhte. Während die proteinpolymerbasierte Transfektion dies nicht tat.Trotz der erhöhten Anzahl an apoptotischen Zellen veränderte sich die Morphologie der Zellen in der Lichtmikroskopie nicht. Wichtiger war, dass die biologische Antwort der lipidbasiert transfizierten Zellen identisch blieb mit der der nicht resezierten Zellen; beide produzierten ähnliche Mengen an TNF alpha als Reaktion auf LPS und wurden durch die Zugabe von IL-10 gehemmt. Es wurde kein TNF alpha gebildet, wenn die Zellen nicht stimuliert wurden, was darauf hindeutet, dass die Zellen nach der Transfektion naiv bleiben.Nach der Ansicht dieses Videos haben die Nutzer ein gutes Verständnis dafür, wie man rohe 2 6 4 0,7-Zellen mit Luciferase-Berichter-Plasmiden auf minimale invasive Weise translatiert, ohne die natürliche Reaktion der Zellen zu verändern.

transfecting-raw2647-cells-with-a-luciferase-reporter-gene

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir Verfahren für die Untersuchung von Veränderungen in Phagozytose-induzierte Genexpression mit einem Luciferase-basierten Reportergen-Ansatz mit dem Dual-GloTM Luciferase Assay System von Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Hier beschreiben wir die Methoden zu konstruieren, zu visualisieren und zu quantifizieren Biolumineszenzreaktionen sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Enzymen bei metastasierendem Brustkrebs-Zellen während deren Wachstum und Metastasierung...

In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Diese Methode beschreibt die hochgradige in vitro-Synthese von sowohl kapptem als auch nicht kapptem mRNA aus einem linearisierten Plasmid, das das Gaussia-Luciferase-Gen (GLuc) enthält. Die RNA wird gereinigt, und ein Teil der nicht kappten RNA wird enzymatisch mit dem Vaccinia-Virus-Capping-Enzym kappt. Im letzten Schritt wird die mRNA in HeLa-Zellen transfiziert, und die Kulturüberstände der Zellen werden auf Luciferase-Aktivität untersucht.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen. Nicht infizierte und virusinfizierte Zellen wurden mit mRNAs co-transfiziert, die für Glühwürmchen-Luziferase (Fluc) und Renilla-Luziferase (Rluc) ko-transfizieren, wobei die Fluc-mRNA eine 5'-Poly(A)-Leader-Sequenz enthielt. Nach dem Hinzufügen von biolumineszierenden Substraten zu lysierten Zellen messen Sie das Signal von beiden Luciferasen, um den translationalen Vorteil der Fluc...

Ein Luciferase-Reporter-Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

GL261 Gliomzellen stellen ein nützliches immunkompetentes Tiermodell des Glioblastoms dar. Die Ziele dieses Protokolls sind die Demonstration geeigneter Techniken zur Überwachung des intrakraniellen Tumorwachstums unter Verwendung von in vivo Biolumineszenz-Bildgebung und die Überprüfung des Nutzens von Luciferase-modifizierten GL261-Zellen für die Untersuchung der Tumorimmunologie und immuntherapeutischer Ansätze zur Behandlung von Glioblastomen.

Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

Wir legen ein Protokoll vor, um die mRNA-Übersetzungsverordnung in poxvirus-infizierten Zellen zu untersuchen, die in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter Assay verwendet werden. Der Test kann für das Studium der Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente einer mRNA verwendet werden, einschließlich 5 '-unübersetzter Region (UTR) und 3 '-UTR. Mit dieser Methode können auch verschiedene Übersetzungsinitiationsmodi untersucht werden.

In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Hier beschreiben wir eine Methode zur zellbasierten Visualisierung, subzellulären Lokalisierung und quantitativer Analyse von poly(ADP-ribose) (PAR)-angereicherten Fokussen in fixierten Säugetierzellen. Dieser Test ermöglicht die Quantifizierung von Stellen mit DNA-Schaden-induzierter PARP-Aktivierung, einschließlich derjenigen, die mit der Basen-Exzisionsreparatur oder der Reparatur eines Einzelstrangbruchs verbunden sind, in den Kkernen von genotoxin-exponierten Zellen.

Visualisierung und quantitative Analyse der durch Genotoxin induzierten PARP1/PARP2-Aktivierung in Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsprotein-basierten Reporter

Erfahren Sie eine schonende Transfektionsmethode für Luciferase-Reportergene in RAW264.7-Makrophagenzellen ohne Aktivierung der Immunantwort. Dieses Verfahren ermöglicht präzise Genexpressionsanalysen in ruhenden Zellen.

Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Weitere Videos entdecken