Name: Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Nukleofektionsprotokoll zur effizienten Transfektion humaner dendritischer Zellen mit siRNA oder Plasmid-DNA ohne Induktion der Zellreifung. Diese Methode ermöglicht zuverlässiges Gen-Silencing für Immunforschung.

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Das Projekt wurde vom NIH NIAID Contract No HHSN2662000500021C unterstützt. Wir danken Ming Chen für seine technische Unterstützung.

1. Programmieren Sie die Amaxa 96 well Shuttle Nucleofector <ol><li> Öffnen Sie eine neue Parameter-Datei. </li><li> Wählen Sie die Anzahl der Bohrlöcher Sie für Standard-Transfektion verwenden, indem Sie den Cursor über den 96-Well-Platte Diagramm wird. Verwenden Sie ein Minimum von 3 Brunnen zu bündeln für jede experimentelle Probe. </li><li> Geben Sie den Programm-Code: in part1 wählen 'FF' und in part2 wählen '168 'aus dem Pulldown-Menüs </li><li> Von Solution Box wählen Sie "Monozyten, Mensch ' </li><li> Under Control Option wählen "Standard". </li><li> Klicken Sie auf Anwenden. </li><li> Um einen nicht-Transfektion Kontrolle, wählen Sie weitere Bohrungen aus dem Diagramm nach Bedarf und wählen Sie dann "No Program Control" von Control Option und klicken Sie auf Anwenden. </li><li> Wählen Sie einen beliebigen unbenutzten Vertiefungen auf der Platte Diagramm und klicken Sie auf Undefine. </li></ol> 2. Bereiten DCs für die Transfektion <ol><li> Alle Arbeiten sind unter sterilen Bedingungen in einer Zellkultur Motorhaube wenn möglich durchgeführt werden. Bereiten Sie die Nukleofektion Lösung durch Zugabe von 96-Well-to Human Monozyten 96-well Nucleofector Lösung im Verhältnis von 450 bis 2025 zu ergänzen. Vermischen und auf Raumtemperatur aufwärmen. Sie werden 20 &amp;mgr; l der Nukleofektion Lösung pro Vertiefung benötigen. Machen Sie einen Überschuss von 10% bis zum Pipettieren Fehler erlauben. </li><li> Legen Sie die Anzahl der Nucleocuvette Module, die Sie in die Nucleocuvette Platte in der richtigen Ausrichtung, dh Einsetzen der ersten in die Zeilen 1 und 2. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der DCs für Ihr Experiment Berechnung auf 500.000 Zellen pro Well und Pellet durch Zentrifugation bei 400g für 10min benötigt. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Resuspendieren der Zellen in der Nukleofektion Lösung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren ein paar mal. </li><li> Teilen Sie die richtige Menge der resuspendierten Zellen in Eppendorfs für die jeweilige Behandlung zB GLO und RIG-I bezeichnet. </li><li> Add 0.25μg siRNA pro 500.000 Zellen und durch Pipettieren gründlich mischen. Verwenden Sie nicht-targeting siRNA in Ihrem no-Transfektion Kontrollprobe. </li><li> Pipette 20 &amp;mgr; l der oben genannten Mischungen in die Nucleocuvette Modulen nach Ihren experimentelle Anordnung ist die Gewährleistung der Flüssigkeit auf den Boden des Brunnens geliefert. </li><li> Decken Sie die Nucleocuvette Platte mit dem Deckel und tippen Sie auf die Platte auf eine harte Oberfläche ein paar Mal, um sicherzustellen, Entfernung von Luftblasen. </li></ol> 3. Transfizieren DCs <ol><li> Legen Sie Platte in die Nucleofector 96-well Shuttle Tablett, auf Upload klicken und dann starten. </li><li> Befolgen Sie die Fortschritte der Transfektion Prozess auf dem Laptop-Display, ein schwarzes Kreuz auf grünem Hintergrund bedeutet eine erfolgreiche Transfektion in die gut, während ein schwarzer Balken auf rotem Hintergrund bedeutet, dass es nicht erfolgreich war. </li><li> Nach Abschluss der Transfektion, entfernen Sie die Platte, und fügen Sie 80μl der DC Wachstumsmedium in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Inkubieren Platte für 10 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Übertragen Sie die 100 &amp;mgr; Volumen aus dem nucleocuvettes in Matrix Röhrchen mit 100 &amp;mgr; l vorgewärmtes DC Wachstumsmedium, so dass die richtige Orientierung. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie diese Röhren wo Transfektion nicht aufgetreten wäre. </li><li> Bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Stunden oder eine andere gewünschte Zeitintervall. </li></ol> 4. Infect Zellen mit NDV <ol><li> Nehmen Sie Matrix Rohre aus dem Inkubator in der Zellkultur Kapuze und Pool Röhrchen für jede experimentelle Probe in Eppendorfs </li><li> Pellet die Zellen vorsichtig durch Drehen in einer Tischplatte Zentrifuge für 5 min und entfernen Überstand. </li><li> Resuspendieren der Zellen in serumfreiem Wachstumsmedium mit NDV bei einer MOI von 1 und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 45 min, mit Eppendorfs lose in einer steril abgedeckt. </li><li> Fügen Sie 900μl der DC Nährmedium und re-Inkubation für 8-10 h. </li></ol> 5. Ernten Sie die Zellen <ol><li> Pellet-Zellen durch Spinnen Eppendorfs in einer Tischplatte Zentrifuge und Überstand entfernen. </li><li> Ernten Sie die Zellen für die RNA-oder Protein-Extraktion nach Ihren Protokoll. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Mit unseren optimierten Protokoll wir transfizierten DCs mit RIGI-targeting siRNA für 24 h und dann infiziert die Zellen mit NDV (a Paramyxovirus von RIG-I erfasst), die Interferon-Antwort-Weg anregen. Durch qRT-PCR-Analyse haben wir gezeigt, knock down des Gens um 75% auf der Ebene der Transkription. Wir beobachteten auch eine ähnliche Reduktion in der Expression von IFNβ, die einem nachgeschalteten Effektor von RIG-I wird in der IFN-Signalkaskade. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die Expression von IFNβ in nicht-infizierten, Steuer-transfizierten Zellen nicht nachweisbar war, während die von MxA, ein IFNβ nachgelagerten Reaktion Gen war minimal (Abbildung 1A). Eine zweite Transfektion von DCs mit RIGI-targeting siRNA erfolgte mit genügend Zellen zur Western-Blot-Analyse. Wo dieRT-PCR-Ergebnisse waren ähnlich, was wir sahen zuvor (62% bzw. 66% knock down von RIG-I und IFNβ Ausdruck bzw.) (Abbildung 1B), sondiert die Western-Blot für RIG-I zeigte, dass die Expression dieses Gens war vollständig blockiert (Abbildung 1C). <img src="/files/ftp_upload/2766/2766fig1.jpg" alt="Abbildung 1A" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1A"> Abbildung 1. (A) MoDCs wurden entweder mit siRNA transfizierten Targeting RIG-I oder unspezifische GLO siRNA und die Wirkung auf die Expression von RIG-I, IFNβ und MxA durch qRT-PCR bestimmt. (-) Die Transfektion verwendete Protokoll ein Monozyten-spezifische Puffer und nucleoporation Programm FF168 (Lonza Walkersville Inc.) Nach Inkubation für 24 h, wurden die transfizierten Zellen entweder mit NDV (+) oder links infizierten infiziert. Nach einer weiteren Inkubation für 10 h wurden die Zellen geerntet und RNA extrahiert Transcript Ebenen repräsentieren die Ergebnisse von zwei wiederholten Experimenten. Taken from Bowles et al 16. (B) MoDCs aus einer anderen Buffy-Coat erhalten, wie für Abbildung 1A verwendet wurden erneut mit transfizierten entweder RIG-I-targeting siRNA oder unspezifische GLO siRNA unter Verwendung der gleichen Transfektionsprotokolls wie oben. Eine zusätzliche Kontrolle über untransfizierte MoDCs war in das Experiment einbezogen. Nach einer 24 h Inkubation alle Zellen wurden mit NDV infiziert und inkubiert für weitere 10 h, bevor sie für beide RNA-und Protein-Extraktion geerntet. Transcript Ebenen der RIG-I, IFNβ und MxA durch qRT-PCR ermittelt stellen die Ergebnisse von zwei wiederholten Experimenten. Taken from Bowles et al 16. (C) Lysate von Zellen in Abbildung 1B oben beschrieben wurden mittels Western Blot analysiert. Spuren 1 und 2, Lysate von transfizierten Zellen, Bahnen 3 und 4, Lysate von GLO siRNA transfizierten Zellen, Spuren 5 und 6, Lysate von Zellen mit RIG-I-targeting siRNA transfiziert. Die Proben wurden für RIG-I untersucht und auch GAPDH (als Ladekontrolle) und wurden in doppelter Ausführung. Taken from Bowles et al 16.

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Effiziente Transfektion von primären naiven dendritischen Zellen ist für hohen Durchsatz-Analyse und Reverse Engineering von zellulären Entzündungswege in diesem wichtigen Zell-Vermittlung der angeborenen-adaptive Immunsystem Übergang wichtig. Allerdings finden die meisten Forscher, dass diese Zellen nur schwer effizient und ohne die Transfektion induzieren Zellreifung transfizieren bei der Verwendung von Standard-Transfektion Techniken sind. Wir untersuchten, ob diese Einschränkungen, die im Hochdurchsatz-Protokoll-Opt...

<table border="1"><tbody><tr><th> Equipment / Reagent </th><th> Firma </th><th> Katalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Seriennummer </td></tr><tr><td> Amaxa menschlichen Monozyten 96-well Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VHPA-2007 </td><td> Enthält der menschliche Monozyten 96-well Nucleofector Lösung, die 96-Well-Supplement und die Nucleocuvettes und Platten </td></tr><tr><td> RIG-I siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012511-00 </td><td></td></tr><tr><td> GLO siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> Ergänzt mit 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin zur DC Wachstumsmedium machen </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> HyClone </td><td> 3070,03 </td><td></td></tr><tr><td> Dendritische Zellen </td><td> New York Blood Center </td><td></td><td> DCs sind aus Buffy Coats mit einem Standard-Verfahren gereinigt </td></tr></tbody></table>

optimiertes protokoll für die effiziente transfektion von dendritischen zellen ohne zell-reifung

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritische Zellen (DCs) können als Wächter des Immunsystems, die eine kritische Rolle bei der Einleitung und Reaktion auf eine Infektion 1 sein. Nachweis von pathogenen Antigen, das durch naive DCs wird durch pattern recognition receptors (PRR), die in der Lage, bestimmte konservierte Strukturen bezeichnet als pathogen-associated molecular patterns (PAMPS) zu erkennen sind. Erkennung von PAMPs von DCs löst eine intrazelluläre Signalkaskade führt deren Aktivierung und Umwandlung zu reifen DCs. Dieser Prozess wird in der Regel durch die Produktion von Typ-1-Interferon gemeinsam mit anderen proinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet ist, Hochregulation von Zelloberflächenmarker wie MHCII und CD86 und Migration der reifen DC zu drainierenden Lymphknoten, wo die Interaktion mit T-Zellen löst die adaptive Immunantwort 2, 3. So verlinken DCs der angeborenen und adaptiven Immunsystem. Die Fähigkeit, die zugrunde liegenden molekularen Netzwerke DC Reaktion auf verschiedene Krankheitserreger sezieren ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Regulation dieser Signalwege und ihrer induzierten Gene. Es sollte auch dazu beitragen, die Entwicklung von DC-basierte Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten und Tumoren. Allerdings hat diese Linie der Forschung ist stark von der Schwierigkeit der Transfektion von primären DCS 4 behindert. Virus Transduktion Methoden, wie die lentiviralen Systems werden in der Regel verwendet, tragen aber viele Einschränkungen wie Komplexität und bio-Ex-Risiko (mit den damit verbundenen Kosten) 5,6,7,8. Darüber hinaus erhöht die Lieferung von viralen Genprodukte die Immunogenität dieser transduzierten DCs 9,10,11,12. Die Elektroporation wurde mit gemischten Ergebnissen 13,14,15 verwendet worden, aber wir sind die ersten, die Verwendung einer High-Throughput-Transfektionsprotokolls Bericht und schlüssig nachweisen seine Nützlichkeit. In diesem Bericht fassen wir ein optimiertes Protokoll für die kommerziellen High-Throughput-Transfektion von primären humanen DCs, mit begrenzten Zelltoxizität und das Fehlen von DC Reifung 16. Transfektionseffizienz (von GFP-Plasmid) und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden mehr als 50% bzw. 70%. FACS-Analyse wurde das Fehlen Erhöhung der Expression der Reifung Marker CD86 und MHCII in transfizierten Zellen, während qRT-PCR zeigte keine Hochregulation von IFNβ. Mit dieser Elektroporation Protokoll, bieten wir Beweise für eine erfolgreiche Transfektion von DCs mit siRNA und effektive knock down von gezielten Gen RIG-I, ein wichtiger viraler recognition receptor 16,17, sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

Wir präsentieren unsere optimierten High-Throughput-Nukleofektion Protokoll als eine effiziente Art der Transfektion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen entweder mit Plasmid-DNA oder siRNA, ohne dass Zellreifung. Wir fördern den Nachweis für die erfolgreiche siRNA-Silencing von gezielten Gen RIG-I sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritische Zellen (DCs) können als Wächter des Immunsystems betrachtet werden, die eine entscheidende Rolle bei dessen Initiierung und der Reaktion auf Infektionen spielen1. Der Nachweis ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression eines Zielgens in DCS mittels SI-RNA-Transfektion zu verringern. Dies wird erreicht, indem zunächst der AM Maxin Nucleo-Effektor programmiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, DCS und siRNA miteinander zu mischen und die resultierende Zellsuspension in Nucleo QVE-Module pipettieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Platte in das Amaxa-Shuttle-Behältnis einzusetzen, um den Transfektionsprozess zu starten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Infektion der Zellen mit dem Virus, um die Interferonantwort zu aktivieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Gen-Knockdown mittels quantitativer RT-PCR und Western Blotting zeigen.Diese Technik ist wertvoll zur Charakterisierung von Signalwegen in dendritischen Zellen und könnte zur Entwicklung dendritischer zellbasierter Immuntherapien beitragen. Um den Maxon 96-Well-Shuttle-Nukleofaktor für die DC-Transfektion zu programmieren, öffnen Sie eine neue Parameterdatei. Wählen Sie die Anzahl der Wells, die Sie für die Standardtransfektion verwenden werden, aus, indem Sie den Cursor über das Diagramm der 96-Well-Platt

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine auf kleiner interferierender RNA (siRNA) basierende Technik, um den autophagischen Fluss zu stören. Eine siRNA, die auf FIP200-mRNA abzielt, wird mittels Elektroporation in von Monozyten abgeleitete unreife dendritische Zellen (iDCs) eingeführt, was zu einem Knockdown der FIP200-Expression und zur Hemmung der nuklearen Laminstörung durch Autophagie führt. Bei Zugabe des Herpes-simplex-Virus (HSV) wird der Kernaustritt der viralen Nachkommen gehemmt, da keine Laminstörung...

siRNA-basierte Hemmung der Autophagie in Herpes-simplex-Virus-infizierten unreifen dendritischen Zellen

Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

Wir verwenden hier retrovirale Transduktion und Transfektion konkatemeren eine Zelllinie, die die Komponenten eines lentiviralen Vektors (LV) in der Abwesenheit von Tetracyclin Ausdruck zu erstellen. Das LV kodiert GFP und mit einem Glykoprotein, SVGmu, die spezifisch für einen Rezeptor auf dendritischen Zellen pseudotypisiert.

Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen

Dieses Protokoll stellt ein effizientes und zuverlässiges Verfahren zum humanen THP-1 Makrophagen mit siRNA oder Plasmid-DNA durch Elektroporation mit hohen Transfektionseffizienz transfizieren während eine hohe Vitalität der Zellen und Makrophagen volle Kapazität für die Differenzierung und Polarisation.

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

In diesem Artikel liefern wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark dendritische Zellen und Makrophagen abgeleitet. Die Methode basiert auf der Transduktion des Knochenmarks Stammväter mit retroviralen Konstrukten gefolgt von Differenzierung in Makrophagen und dendritischen Zellen in Vitro.

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Die Tranmmunisierung (TI) Gerät oder Platte und verwandte Protokolle wurden entwickelt, um die wichtigsten Merkmale der extrakorporalen Photochemotherapie (ECP) zu replizieren, in einem experimentellen Umfeld, die die Produktion von physiologisch aktivierten, tausenfähigen dendritischen Zellen (DCs) für die Krebs-Immuntherapie.

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming-regulatorischen T-Zell-Induktion vor. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen des aktiven Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und des aktiven VitaminS A (Retinoinsäure oder RA) de novo zu produzieren.

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die in vivo Reprogrammierung von Krebszellen der Maus in dendritisch-ähnliche Zellen vom Typ 1 innerhalb der Tumormikroumgebung durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren PU.1, IRF8 und BATF3.

Steuerbare in vivo Reprogrammierung von Tumorzellen zu konventionellen dendritischen zellähnlichen Zellen vom Typ 1

Lernen Sie ein optimiertes Nukleofektionsprotokoll zur effizienten Transfektion humaner dendritischer Zellen mit siRNA oder Plasmid-DNA ohne Induktion der Zellreifung. Diese Methode ermöglicht zuverlässiges Gen-Silencing für Immunforschung.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

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