Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zielgenexpression in DCS durch SI-RNA-Transfektion zu unterbinden. Dies wird erreicht, indem zunächst der AM Maxin Nucleo-Effektor programmiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, DCS und siRNA miteinander zu mischen und die resultierende Zelllösung in Nucleo QVE-Module zu pipettieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Platte in das amaxa Shuttle-Tablett zu legen, um den Transfektionsprozess zu starten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen mit dem Virus zu infizieren, um die Interferonantwort zu aktivieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die einen Gen-Knockdown durch quantitatives R-T-P-C-R und Western Blot zeigen.

Diese Technik ist wertvoll für die Charakterisierung von Signalwegen in dendretischen Zellen und kann zur Entwicklung von dendretischen zellbasierten Immuntherapien beitragen. Um den Maxon 96 Well-Shuttle-Nukleofaktor für die DC-Transfektion zu programmieren, öffnen Sie eine neue Parameterdatei. Wählen Sie die Anzahl der Wells aus, die Sie für die Standardtransfektion verwenden möchten, indem Sie den Cursor über das 96-Well-Plattendiagramm ziehen.

Verwenden Sie mindestens drei Vertiefungen, um für jede Versuchsprobe zu poolen. Geben Sie nun den Programmcode in Teil eins ein, wählen Sie F, F und i Teil zwei, wählen Sie 1 68 aus den Pulldown-Menüs. Wählen Sie dann aus dem Lösungsfeld Monozyten Mensch als nächstes unter Kontrolloption Standard auswählen und klicken Sie dann auf Anwenden.

Um eine Kontrolle ohne Transfektion einzuschließen, wählen Sie zusätzliche Vertiefungen aus dem Diagramm aus. Wählen Sie dann aus der Steuerungsoption keine Programmsteuerung und klicken Sie erneut auf Übernehmen. Nachdem Sie die Nukleo-Affektionslösung gemischt haben, lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen.

Platzieren Sie die benötigte Anzahl von Nukleo-VETE-Modulen in der richtigen Ausrichtung, wie hier gezeigt, in die Nukleo-VETE-Platte, indem Sie das erste in die Rosa eins und zwei einführen und dann so weiter für alle folgenden Röhrchen. Übertragen Sie genügend DCS aus einem Zellkulturkolben in ein 50-Milliliter-Röhrchen, um 500.000 Zellen pro Vertiefung für die Transfektionszentrifuge zu erhalten, zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 400 G bei vier Grad Celsius und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Geben Sie als nächstes nukleare Affektionslösung in das Röhrchen und resuspendieren Sie das DCS, indem Sie einige Male vorsichtig auf und ab pipettieren.

Markieren Sie nun die DPH-Röhrchen entsprechend der spezifischen Behandlung, die durchgeführt werden soll, und teilen Sie dann die resuspendierten Zellen in die markierten Röhrchen auf. SI-RNA wird in einer Endkonzentration von 0,25 μg pro 500.000 Zellen in die entsprechenden Epi endorf-Röhrchen gegeben und dann die Zellsuspensionen durch Pipettieren gemischt. Verwenden Sie Nicht-Ziel-SI-RNA für die Kontrollprobe ohne Transfektion.

Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter der SI RA DC-Zellsuspension gemäß dem zuvor programmierten Versuchslayout in die Nukleo-Vete-Module, wobei Sie sicherstellen, dass die Flüssigkeit zum Boden der Vertiefung abgegeben wird, die Nukleo-Vete-Platte mit einem Deckel abdecken und die Platte einige Male auf eine harte Oberfläche klopfen, um die Entfernung von Luftblasen zur Transfizierung des DCS zu erleichtern. Setzen Sie die vorbereitete Nukleo-Yvette-Platte in das 96-Well-Shuttle-Tablett des Nukleoeffektors ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hochladen und Starten.

Verfolgen Sie den Fortschritt des Transfektionsprozesses auf dem Display. Ein schwarzes Kreuz auf grünem Hintergrund bedeutet eine erfolgreiche Transfektion in diesem Brunnen, während ein schwarzer Balken auf rotem Hintergrund bedeutet, dass sie während der Transfizierung der Zellen nicht erfolgreich war. DC-Wachstumsmedium nach Abschluss des Transfektionsprozesses vorwärmen, die Platte entfernen und 80 Mikroliter des vorgewärmten DC-Wachstumsmediums in jede Vertiefung geben.

Mit einer Mehrkanalpipette inkubieren Sie die Platte nun 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Während der Inkubationszeit werden 100 Mikroliter des vorgewärmten DC-Wachstumsmediums in die Matrixröhrchen gegeben, die in der gleichen Ausrichtung wie die aufgebaute Nukleoküvettenplatte angeordnet sind. Nach der Inkubationszeit werden alle 100 Mikroliter der Zellsuspensionen aus den Nukleo-CVEs in die vorgefertigten Matrixröhrchen überführt.

Entfernen und entsorgen Sie dann die Röhren, bei denen keine Transfektion stattgefunden hat. Zum Schluss inkubieren Sie die Matrizenröhrchen für 24 Stunden oder ein anderes gewünschtes Zeitintervall. Beschriften Sie einor-Röhrchen für jedes der Inkubationsmatrixröhrchen.

Übertragen Sie dann die Matrixröhrchen aus dem Inkubator in eine Zellkulturhaube und poolen Sie die Matrixröhrchen für jede experimentelle Probe in das vormarkierte eend dfs. Pelletieren Sie anschließend die Zellen vorsichtig, indem Sie die eend DPH-Röhrchen 10 Minuten lang in einer Desktop-Zentrifuge drehen. Bei 400 G wird die Snat entfernt und die Zellen in einem serumfreien Wachstumsmedium resuspendiert, das das Newcastle-Disease-Virus oder NDV bei einem MOI von eins enthält.

Decken Sie die Epi-Endorphine steril ab und inkubieren Sie die Eileiter dann 45 Minuten lang. Fügen Sie nach dieser Inkubationszeit 900 Mikroliter DC-Wachstumsmedium hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen für weitere acht bis 10 Stunden. Um die transfizierten und infizierten DCs zu ernten.

Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie die Einor-Röhrchen wie zuvor in einer Desktop-Zentrifuge drehen und die Snat-Monozyten entfernen: dcs wurden entweder mit IRNA, das auf RIG I abzielt, oder mit unspezifischer Glüh-Irna transfiziert und mit NDV infiziert, wie durch ein Pluszeichen angezeigt, oder sie blieben nicht infiziert, wie durch ein Minuszeichen angezeigt, wie durch einen quantitativen R-T-P-C-R-A-Knockdown von R RGA um 75% nachgewiesen. Auf Transkriptionsebene wurde eine ähnliche Verringerung der Expression von Interferon beta. Ein nachgeschalteter Effektor von RGA in der Interferon-Signalkaskade wurde ebenfalls beobachtet. Darüber hinaus war die Expression von Interferon beta in nicht-infizierten Kontrollzellen nicht nachweisbar.

Während die von MXA und Interferon beta Downstream-Response-Gen minimal war. Hier. In diesem Experiment sind Daten aus einer zweiten Transfektion von DCS mit rigi targeting irna zu sehen, die wie in der vorherigen Abbildung durchgeführt wurde. Alle Zellen sind jedoch mit NDV infiziert und es wurde eine zusätzliche Kontrolle mit nicht reseziertem Monozyten-DCS eingebaut.

Die Ergebnisse des Gen-Silencings waren ähnlich wie in der vorherigen Abbildung. Ein Western Blot, der auf RGA untersucht wurde, zeigte, dass die Proteinexpression dieses Gens vollständig blockiert worden war. Die Spuren eins und zwei zeigen Daten für Lysate aus nicht resezierten Zellen.

Die Spuren drei und vier zeigen Lysate von Glow-Irna-transfizierten Zellen, und die Spuren fünf und sechs zeigen Lysate von Zellen, die mit RIG I transfiziert wurden, das auf S Irna abzielt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in einer Stunde durchgeführt werden, einschließlich des gleichzeitigen Ausschaltens vieler Gene.