Verwendung Maßgeschneiderte Galvanotaxis Chambers zu Directional Migration Studie von Prostatazellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung von Galvan Axxis, einem Assay zur Beurteilung der gerichteten Migration von Zellen in einem angelegten elektrischen Feld. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Galvan axxis-Kammer mit den interessierenden Zellen zusammengebaut und dann besiedelt wird. Im zweiten Schritt wird die Kammer verschlossen und ein elektrisches Feld für die Zeitraffer-Bildgebung angelegt.

Im letzten Schritt wird die Migrationsgeschwindigkeit einzelner Zellen und der Winkel relativ zum elektrischen Feld verfolgt. Letztendlich mitunterzeichnen. Mit ihnen lässt sich zeigen, wie die Zellen auf das elektrische Feld reagieren und ob sie gerichtet zur Kathode wandern.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die einfache Zellentnahme nach Verabreichung von Texas für die Sekundäranalyse und die Leichtigkeit, mit der die Migration bei hoher Vergrößerung und mit fluoreszenzmarkierten Zellen gefilmt werden kann. Die Visualisierung dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Montageschritte einer Kammer ohne Demonstration schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, eine galvanische Axxis-Kammer aus Kunststoff mit zwei Propanol abzuwischen.

Verwenden Sie dann eine Spritze, um Silikonversiegelung in Marinequalität um die kreisförmigen Öffnungen an der Unterseite der Kammer aufzutragen. Platzieren Sie ein großes Deckglas über dem Dichtmittel und drücken Sie es mit dem Ende eines Baumwollapplikators fest, wobei Sie den überschüssigen Kleber mit dem Wattestäbchen abwischen. Schneiden Sie dann mit einem Diamantmarkierer ein kleines Deckglas so aus, dass sechs mal 25 Millimeter große Lücken entstehen, und drehen Sie die Kammer um.

Tragen Sie anschließend mit einer Spritze zwei Streifen Silikon auf, so dass zwischen den beiden kreisförmigen Öffnungen auf dem Bodenglas eine 10 x 25 Millimeter große Kanaloberfläche für die Zellbefestigung entsteht. Kleben Sie dann zwei Glasstellen zwischen die runden Öffnungen, drücken Sie die Zwischenräume mit einem neuen Baumwollapplikator nach unten und wischen Sie den überschüssigen Kleber ab, wie gerade gezeigt. Probieren Sie die Kammer 24 Stunden lang aus, bis der Silikonkleber ausgehärtet ist.

Weichen Sie die Kammer am nächsten Tag über Nacht in destilliertem Wasser ein, um die Essigsäurerückstände vom Kleber zu entfernen, bevor Sie die Zellen in die Kammer säen. Trocknen und wischen Sie die Kammern mit zwei Propanol ab, wie gerade gezeigt. Waschen Sie sie mehrmals mit sterilem PB S3 und kontrollieren Sie anschließend den Flüssigkeitsfluss zwischen den beiden kreisförmigen Öffnungen in den Kammern.

Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Kammern in gutem Zustand sind, schließen Sie sie in sterile Kulturschalen ein und stellen Sie die Kammern 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Während sich die Kammern ausgleichen, lösen Sie die Prostatazellen mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius aus ihrer Kulturschale. Nach fünf Minuten neutralisieren Sie die Reaktion mit fünf Millilitern 10%FBS.

In PBS werden die abgelösten Zellen in 15-Milliliter-Röhrchen überführt und anschließend fünf Minuten lang zentrifugiert. Bei 200 mal G das Medium ansaugen und dann das Pellet in einem Milliliter Medium resuspendieren. Passen Sie dann nach dem Zählen der Zellen die Zellkonzentration auf acht x 10 für die vier Zellen pro Milliliter mit Kulturmedium und Saatgut an.

350 Mikroliter der Zellsuspension auf jede Kammer geben. Inkubieren Sie die Zellen in der Kammer über Nacht in einer Kulturschale mit einem feuchten Kim-Tuch bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Beginnen Sie am nächsten Tag mit dem Zusammenbau der oberen Kammern, indem Sie zunächst 10 Milliliter Kultur bei mittlerer Temperatur auf 37 Grad Celsius für jede galvanische AXS-Kammer erwärmen.

Während sich das Medium erwärmt, wird eine Galvan axxis Kammer aus dem Inkubator auf eine 37 Grad Celsius warme Warmhalteplatte umgefüllt und die Kammer mit Nährboden gespült. Um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen, lassen Sie 400 Mikroliter Medium in der Kammer und tragen Sie dann mit einer Spritze Hochvakuumfett auf beide Glasräume auf. Versiegeln Sie die Kammer mit einem Deckglas und einem Baumwollapplikator und trocknen Sie dann die Glasoberfläche.

Tragen Sie anschließend das Hochvakuumfett mit einer Spritze auf, um den Spalt zwischen dem Deckglas und der Kammer abzudichten. Geben Sie dann das Nährmedium in die inneren Reservoirs. Entfernen Sie Blasen und überprüfen Sie den Flüssigkeitsfluss zwischen den Behältern.

Um die Agarbrücken herzustellen, schneiden Sie ein Paar zwei Zoll große PVC-Röhren ab, drehen Sie sie um und legen Sie die Stücke dann in ein 100-Milliliter-Becherglas. Geben Sie als nächstes 200 Milligramm Bakterikto-Agar in einen 50-Milliliter-Kolben mit 10 Millilitern Nährmedium, um ein 2%-Agar-Gel herzustellen. Nachdem Sie 30 Sekunden lang in der Mikrowelle gehalten haben, verwenden Sie eine Transferpipette, um das Agargel in den Kunststoffschlauch zu laden, und lassen Sie die Agarbrücken 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den Agar zu verfestigen.

Geben Sie dann zwei Milliliter Kulturmedium in die äußeren Reservoire der Galkammer und setzen Sie die Agarbrücken in das innere und äußere Mediumreservoir ein, um den Strom zu leiten und eine Zeitrafferbildgebung der Migration durchzuführen. Beginnen Sie damit, die Galvankammer in eine 37 Grad Celsius heiße Klimakammer auf dem Mikroskoptisch zu überführen, die Kammer mit Klebeband zu sichern und sich auf die Zellen unter einem 10-fach-Objektiv zu konzentrieren. Führen Sie anschließend die Galvan Axxis Elektroden mit der Kathode auf der rechten Seite in die äußeren Behälter ein und befestigen Sie den Draht und die Elektroden mit Klebeband.

Schalten Sie dann die Powerbox ein, um ein elektrisches Feld an die Kammer anzulegen, und verwenden Sie ein Spannungsmessgerät, um die Ausgangsspannung in der gesamten Kammer zu messen, um 2,5 Volt für die 25 Millimeter lange Kammer zu erreichen. Wählen Sie nun 10 Punkte in der Kammer aus, um 10 Zeitrafferfilme zu erzeugen, und stellen Sie die Aufnahmebedingungen auf 10-Minuten-Intervalle für zwei Stunden ein. Beginnen Sie dann mit dem Filmen und passen Sie den Ausgangsstrom nach Bedarf an, um die Feldstärke während des Experiments aufrechtzuerhalten.

Am Ende des Experiments nehmen Sie die Kammer vom Tisch und fixieren Sie die Zellen in 95%igem Alkohol. Brechen Sie dann die Kammer auf. Der Deckglas kann für später gespeichert werden.

Färbung und Bildgebung. Reinigen Sie die Kammer für die kommenden Jahre. Um die Galvan Axxis zu quantifizieren, drehen Sie die Zeitrafferfilme, um die Kathode am oberen Rand der Bilder auszurichten.

Exportieren Sie die Filme in die Zellverfolgungssoftware und verfolgen Sie manuell die XY-Position von 10 bis 20 Zellen zu jedem Zeitpunkt aus jedem Film, die Migrationsabstände und die Winkel relativ zur Nord-Süd-Richtung, die gleiche Ausrichtung des elektrischen Feldes wird in der Zellverfolgungssoftware berechnet. Speichern Sie abschließend die Messungen und importieren Sie die Daten in eine Datenbankanwendung, um die kombinierten Ergebnisse zu berechnen. In diesem repräsentativen Galvan Axxis Experiment wurde festgestellt, dass Linien von Prostatazellen im Laufe von zwei Stunden mit ähnlicher Geschwindigkeit wandern.

Die Richtungsabhängigkeit des elektrischen Feldes betrug jedoch 0,7 plus minus 0,3 für das PRNS eine Linie und 0,2 plus minus 0,8 für das PNT mit zwei Linien, was auf einen signifikanten Unterschied in der Galvan-Achse dieser beiden Zelllinien hinweist, was darauf hindeutet, dass ihre zellulären Signalmechanismen nach der Entwicklung der Govan-Methode in Texas unterschiedliche Migrationsreaktionen auf das elektrische Feld steuern. Diese Technik hilft den Forschern, die Mechanismen der gerichteten Zellmigration im Elektrofeld zu erforschen.