Name: Verwendung Maßgeschneiderte Galvanotaxis Chambers zu Directional Migration Studie von Prostatazellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Lernen Sie die Galvanotaxis-Methode zur Untersuchung der gerichteten Migration von Prostatazellen in elektrischen Feldern. Diese Technik ermöglicht die Analyse unterschiedlicher Zelllinienverhalten.

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Die Prostata-Zelllinien werden freundlicherweise von Dr. Ling-Yu Wang und Dr. Hsing-Jien Kung bei Cancer Center, UC Davis zur Verfügung gestellt. Dieses Projekt wird von NIH Galvanotaxis Zuschuss 4R33AI080604 unterstützt.

1. Die Kultivierung Prostatazellen <ol><li> Kultur die PRNs-1-1 und PNT2 Prostata-Zellen auf 100 mm Kulturschalen in RPMI 1640 Medium mit 10% FBS und Antibiotika-Antimykotische ergänzt bei 37 ° C mit 5% CO 2. Aktualisieren Sie das Kulturmedium täglich, bis die Zellen bis zu 80% Konfluenz für die Galvanotaxis Experimente. </li></ol> 2. Montage Galvanotaxis Chambers <ol><li> Montage Unterkammern <ol><li> Wischen eines Kunststoff Galvanotaxis Kammer mit 2-Propanol. Übernehmen Sie die Meeressilizium Versiegelung rund um die kreisförmigen Öffnungen an der Unterseite einer Kammer mit einer Spritze und legen einen großen Deckglas (Abbildung 1). Verwenden Sie die Rückseite eines Baumwoll-Applikator, um das Deckglas nach unten drücken, und wischen Sie das überschüssige Kleber mit Wattestäbchen. Die kreisförmigen Öffnungen kann das Medium und elektrischer Strom über die Zellen zwischen den beiden inneren Medienspeicher zu fließen. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Deckglas 6 mm x 2 machen5 mm Abstandshalter mit einer Diamantspitze Marker. </li><li> Drehen Sie die Kammer. Auftragen von 2 Streifen aus dem Silikonkleber mit einer Spritze und / oder einem Metallspatel um eine 10 mm x 25 mm Kanaloberfläche für die Zellanheftung zwischen den kreisförmigen Öffnungen 2 an der unteren Glas erstellen. Kleben Sie zwei Stücke aus Glas Abstandhalter zwischen den zwei kreisförmigen Öffnungen. Benutzen Sie die Rückseite der Watte sich die Abstandshalter zu schieben und wischen Sie das überschüssige Kleber mit Wattestäbchen und / oder Zahnstocher. </li><li> Trocknen Sie die Kammer für 24 Stunden, bis die Silikonkleber ausgehärtet wird. Weichen Sie die Kammer mit destilliertem Wasser über Nacht, um die Essigsäure Rückstand aus der Kleber zu entfernen. Trocknen Sie die Kammer für den sofortigen Einsatz, oder die Kammer für eine spätere Verwendung gespeichert werden in einem sauberen Behälter. <img alt="Setup-Diagramm der Galvanotaxis-Kammer, das die Montage mit Glasabstandshaltern und unterem Abdeckglas detailliert beschreibt." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figur 1"> Abbildung 1: Montage des unteren Galvanotaxis Kammer. A) Eine große Deckglas wird auf den Boden eines Reinraums. B beigefügt) TWO Glasstücke Abstandshalter werden zwischen den kreisförmigen Öffnungen 2 verklebt, um eine 10 mm x 25 mm Kanal für Zellen zu befestigen erstellen. </li></ol></li><li> Seeding Zellen auf den Galvanotaxis Kammern <ol><li> Bereiten Sie die Anzahl der benötigen Galvanotaxis Kammern für das Experiment benötigt. Jede Zelllinie oder Behandlung erfordert einen einzelnen Galvanotaxis Kammer. Wischen Sie die Galvanotaxis Kammern mit 2-Propanol. Waschen Sie die Kammern mit sterilem PBS 3 mal und überprüfen Sie den Flüssigkeitsstrom zwischen den zwei kreisförmigen Öffnungen in den Kammern. </li><li> Umschließen die Kammern in sterile Zellkulturschalen, und es ihnen ermöglichen, bei 37 ° C für 15 Minuten äquilibrieren. Trennen der mit Prostatazellen aus ihrem Kulturschale mit 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 5 min. Neutralisieren die Trypsin-EDTA mit 5 ml 10% FBS in PBS. </li><li> Übertragen der Zellen auf 15 ml-Röhrchen und Zentrifugieren der Zellen 5 min bei 200 × g, 37 ° C. Saugt den Überstand und resuspendiere die Zellen in 1 ml Kulturmedium. </li><li> Nehmen Sie 20 μl der Zell-Lösung auf eine Zählkammer laden und berechnen Sie die Anzahl der Zellen. Stellen Sie die Zellkonzentration bis 8 × 10 4 Zellen / ml mit Kulturmedium. </li><li> Nehmen Sie die Galvanotaxis Kammern aus dem 37 ° C-Inkubator. Seed 350 ul der Zellsuspension auf jeder Kammer. </li><li> Die Zellen in der Kulturschale mit nassen Kimwipe oder in einer feuchten Kammer in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 inkubieren in den Kammern über Nacht. </li></ol></li></ol><img alt="Migrationsdiagramm der Prostatazellen mit Inkubatoraufbau für die experimentelle Analyse bei 37°C, 5% CO2." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Abbildung 2"> Abb. 2: Aussaat der Zellen in die Kammer der unteren Kammer wird getrocknet und gereinigt A) Prostata-Zellen trypsiniert, gezählt und in die Kammer überführt und über Nacht inkubiert B) Ein Top Deckglas angebracht ist, um die Kammer bevor die Dreharbeiten zu versiegeln... <ol start="3"><li> Assembling die oberen Kammern <ol><li> Montieren Sie die obere Kammer vor den Dreharbeiten. Das Mikroskop ist nur Platz Abbilden eines einzigen Galvanotaxis Kammer zu einer Zeit. Warm up 10 ml Kulturmedium bei 37 ° C für jeden Galvanotaxis Kammer. Übertragen einer Galvanotaxis Kammer aus den Brutkästen zu einer 37 ° C Warmhalteplatte. </li><li> Spülen Sie die Zellen mit Kulturmedium, um die ungebundene Zellen zu entfernen. Leave 400 ul Medium in der Kammer. Mit einer Spritze Hochvakuumfett auf der Oberseite der beiden Glasabstandshalter anwenden. </li><li> Fügen Sie eine kleine Deckglas, um die Kammer zu versiegeln. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas mit der Rückseite eines Baumwoll-Applikator. Wischen Sie das überschüssige Medium mit Wattestäbchen. </li><li> Trocknen Sie die Glasoberfläche und gelten Hochvakuumfett, um die Lücke zwischen dem Deckglas und der Kammer zu versiegeln. Verwenden Sie eine Metallspachtel, um das Fett zu verbreiten. 4 ml des Kulturmediums zu den inneren Behälter und überprüfen Sie den Flüssigkeitsstrom zwischen den Stauseen. </li></ol></li><li> Stellen AgarBrücken <ol><li> Schneiden Sie ein Paar 2-Zoll-langen PVC-Schlauch (ID 503/16 x 16.5 mm x 16.1 Wand), Flip und fügen Sie sie in einen 100-ml-Becher. </li><li> Messung 200 mg Bacto-Agar und fügen in einem 50 ml-Kolben mit 10 ml Kulturmedium zu 2% Agargel machen. Mikrowelle für 30 Sekunden. Laden Sie die Agar-Gel auf den Kunststoffschlauch mit einer Transferpipette. Lassen Sie die Agar-Brücken bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um den Agar verfestigt. </li><li> 2 ml Kulturmedium zu den Außenbehälter des Galvanotaxis Kammer. Legen Sie die Agar-Brücken zu den inneren und äußeren Medienspeicher, um den Strom zu leiten. </li></ol></li></ol><img alt="Galvanotaxis-Experimentdiagramm, das den Kammeraufbau mit Agarbrücken und Gleichstrom für die Zellmigration zeigt." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figur 3"> Fig. 3: Dreh die Zellen an der Kammer ein Diagramm, um die Endmontage des Galvanotaxis Kammer demonstrieren. Die Kammer ist komplett mit Hochvakuumfett abgedichtet. Medium hinzugefügt to füllen die Stauseen und zwei Agar Brücken in die Kammer eingeführt wird. Dann wird die Galvanotaxis Kammer auf den Mikroskoptisch übertragen, und die Elektroden angebracht sind, um das elektrische Feld anzulegen. Seitenansicht des zusammengebauten Galvanotaxis Kammer gezeigt, um zu zeigen, dass der elektrische Strom in den Zellen durch die Agar-Brücken und der Raum zwischen dem Deckglas. 3. Zeitraffer-Imaging <ol><li> Einschalten der Klimakammer auf 37 ° C mit 5% CO 2 in der zirkulierenden Luft 2 h vor der Bilderzeugung. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop und starten Sie die Bilderfassungssoftware. Kalibrieren Sie den Mikroskoptisch und wählen Sie die 10X-Objektiv. </li><li> Übertragen Sie die Galvanotaxis Kammern mit dem Mikroskoptisch, sichern Sie die Kammer mit Klebeband und konzentrieren sich auf den Zellen. Setzen Sie die Galvanotaxis Elektroden an den Außenbehälter mit Kathode auf der rechten Seite. Sichern Sie die Kabel und die Elektroden mit Klebeband. </li><li> Schalten Sie die Strom box, ein elektrisches Feld an die Kammer anzuwenden. Die Ausgangsspannung mit dem Spannungsmesser über die Kammer auf 2,5 Volt für die 25 mm lange Kammer (100 mV / mm) erreichen. Pflegen Sie die Feldstärke während des Experiments durch Anpassung des Ausgangsstroms. </li><li> Wählen Sie 10 Punkte über die Kammer in der Software zu filmen zu zehn Zeitraffer-Filme erstellen. Richten Sie die Aufnahmebedingungen im 10-Minuten-Intervallen für 2 Stunden. </li><li> Starten Dreharbeiten und stellen Sie den Ausgangsstrom je nach Bedarf. </li><li> Am Ende des Experiments, entfernen Sie die Kammer von der Bühne aus und fixieren Sie die Zellen mit 95% Alkohol. Brechen Sie den offenen Kammer mit einer Rasierklinge zu reinigen und wieder verwenden. </li></ol> 4. Quantifizierung Galvanotaxis <ol><li> Drehen Sie die Zeitraffer-Filme und neu orientieren die Kathode an die Spitze der Bilder. Exportieren Sie die Filme auf die Zelle-Tracking-Software. </li><li> Manuell verfolgen die (x, y) Position 10-20 Zellen bei jedem Zeitpunkt von jedem Film (Abbildung 4 A, B).Die Migrationsabstände und die Winkel in Bezug auf die Nord-Süd-Richtung, die gleiche Ausrichtung des elektrischen Feldes in der Zelle Verfolgungssoftware (4C) berechnet werden. HINWEIS: Die durchschnittliche Wanderungsgeschwindigkeit wird von der Gesamtlaufstrecke und Gesamtdreharbeiten Zeit konvertiert. Die Laufrichtung wird von den quer zu dem Kosinus Wert umgewandelt. Wenn Zellen wandern mit zufälliger Ausrichtung, wird der Durchschnitt der Umlauf Cosinus nahe Null sein. Wenn die Zellen wandern direkt zu der Kathode, wird die Kosinuswert +1 sein. Wenn die Zellen wandern direkt zu der Anode wird der Cosinus-Wert -1 ist. </li></ol><img alt="Vergleich der Zellmigration, zufällige Migration vs. Galvanotaxis, Diagramm mit Kosinusgleichung für die Richtung." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="4"> Abbildung 4: Zellverfolgung zu Direktionalität messen A) Überlagerung der Spurlinien mit Zellbildern.. Die (x, y) -Positionen der Zellen manually im Zeitraffer-Filmen verfolgt. . Wenn die Zellen wandern zufällig ist die mittlere Kosinus nahe Null B) Wenn jedoch die Zellen wandern in Richtung der Kathode oder der Anode, ist der Wert des durchschnittlichen Cosinus nahe + (Kathode) - oder. (Anode) 1.0 C ) Die Laufrichtung wird durch den Kosinus-Wert, der aus den Migrationswinkel (θ) umgewandelt wird, dargestellt. Der Kosinus (θ) gleich dem Verhältnis des Abstandes a (die Migrationsdistanz) auf Abstand b (der Abstand zu der Richtung des elektrischen Feldes projiziert). <ol start="3"><li> Speichern Sie die Messungen. Importieren der Daten in eine Datenbankanwendung, die kombinierten Ergebnisse zu berechnen. </li><li> Exportieren Sie die kombinierten Daten der durchschnittlichen Wanderungsgeschwindigkeit und Durchschnitts Kosinuswert in eine Tabellenkalkulation, um die Balkendiagramme (Abbildung 5) zu zeichnen. </li></ol>

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<li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li>
<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Analyse der Galvanotaxis Reaktion einer Zelle ist ein wichtiger Funktionsanzeige für viele zelluläre Migrations oder Wachstumsprozesse 27, 28. Hier nutzen wir eine maßgeschneiderte Kammer mit Glasoberfläche, um zwei Prostata-Zelllinien zu filmen. Diese Zellinien zeigten unterschiedliche Grade der Galvanotaxis, und wir vermuten, dass die intrazelluläre Lokalisierung oder die Aktivierung der Galvanotaxis vermittelnde Proteine ​​könnte während des Prozesses der Erzeugung der unsterblichen Zelllinien, die die...

Endogene elektrische Felder in verschiedenen Geweben, wie der Haut 1, 32, 33 und Gehirn 2 detektiert. Die physiologischen elektrischen Feldes dient spezifische biologische Funktionen, einschließlich Leiten Embryonalentwicklung 3, 4, Führen des Auswachsen von neuronalen Prozessen 5, 6 und Förderung Epithel- und Hornhautwundverschluss 1, 7. In vitro-Anwendung eines elektrischen Gleichstromfeldes an kultivierte Zellen ahmt die physiologischen elektrischen Feld und induziert Richtungszellmigration oder Galvanotaxis. Galvanotaxis in Fibroblasten 8, Fisch Keratinozyten 9, humanen epithelialen und Hornhaut Keratinozyten 10-12 untersucht worden, Lymphozyten 13, Neuroblasten 2 und neuronale Vorläuferzellen 14. Wenn zu dem angelegten Feld ausgesetzt sind, die Mehrzahl der untersuchten Zellen wandern gerichtet in Richtung der kathodenseitigen Pol (-). Dennoch verschiedenen Krebszellen, einschließlich hochmetastatischmenschliche Brustkrebszellen, und der menschliche Prostatakrebs-Zelllinie PC-3M, zu bewegen, um die anodenseitige Pol (+) 15, 16. Verschiedene Mechanismen sind vorgeschlagen Galvanotaxis vermitteln oder die Fähigkeit der Zellen, um das elektrische Feld zu erfassen, einschließlich der Aktivierung erklären der EGF-Rezeptoren 12, die epithelialen Natriumkanals 17, PI3K und PTEN 18, und die Freisetzung von Calciumionen 15, 19. Der Mechanismus ist noch nicht vollständig verstanden, und es ist möglich, dass mehrere Signalwege in Galvanotaxis beteiligt. Die 2-dimensionalen Galvanotaxis Verfahren wir hier zeigen, ist nützlich, um die gerichtete Migration von adhärenten, bewegliche Zellen zu charakterisieren, auf einzelne Zellmigration 10, 12, 17 oder Migration einer Lage von zusammenhängenden Zellen 18, 20. Diese Technik ist aus modifizierten überwachen Peng und Jaffe 21 und Nishimura et al. 10 mit maßgeschneiderten, klarem PVC Kammern mit herausnehmbaren coverslips erlaubt eine einfache Zellentnahme nach Galvanotaxis für die Sekundäranalyse, wie zum Beispiel Immunfluoreszenz-Bildgebung. Die Glasoberfläche der Galvanotaxis Kammern optischen kompatibel, was die Filmbildung bei hoher Vergrößerung und mit fluoreszenzmarkierten Zellen erlaubt. Es ermöglicht auch das experimentelle Design mit Modifizierung der Glasoberfläche, wie die Änderung der Oberflächenbeschichtung oder Ladungen. Spacer aus No. 1 Abdeckglas gebildet in den Kammern verwendet, um den Stromfluss in den Zellen zu minimieren; damit die Joulesche Erwärmung, die proportional zu dem Quadrat des Stromflusses ist, würden die Zellen nicht während des Experimentes hitzen. Die Verbindungs ​​Agar Brücken verhindern einen direkten Kontakt der Elektroden mit den Zellen und Änderung des Mediums pH oder Ionenkonzentration während Galvanotaxis verhindern. Zwei nicht-tumorigene menschliche Prostata-Zelllinien wurden hinsichtlich ihrer Galvanotaxis Reaktion in dieser Studie untersucht. Die PRNs-1-1 22 und 23 sind beide PNT2 SV40 immortalisierte, Wachstumsfaktor-abhängigen Zelllinien, welche die epithelialen Marker Cytokeratin 5, 8, 18 und 19 mit geringer oder keiner Expression des Prostata-spezifisches Antigen (PSA). Beide Zelllinien halten die polygonale Morphologie von normalen Epithelzellen, aber Chromosomenanomalie in Karyotypisierung 22, 24 festgestellt. Obwohl PRN-1-1 und PNT2 teilen ähnliche Verhaltensweisen in den meisten Experimenten zeigen sie Unterschiede bei der Bildung der Struktur und in azinösen Galvanotaxis. In einem 3-D-Matrix, Matrigel, die PRN-1-1 Zellen bilden Hohl acinar Strukturen mit Lumen ähnlich der normalen Prostatagewebe 25. Allerdings sind die PNT2 Zellen bilden feste Kügelchen ohne Lumen oder polarisierten Epithel 26. Die PRNs-1-1-Zellen eine höhere galvanotactic Antwort als die PNT2 in der aktuellen Studie zeigen auch. Die Korrelation zwischen der Bildung von acinar Struktur und Galvanotaxis in PRNs-1-1 schlägt vor, dass die galvanotactic Signale können eine Rolle bei der Organisation der pr spielenostate Drüsengewebe Bewegungen als Reaktion auf endogene elektrische Felder, und stellt weitere Merkmale, um zwischen diesen 2 Zelllinien unterscheiden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 Prostatazellen</td><td></td><td></td><td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>PNT2 Prostatazellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">Medium and solutions</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>erwärmt sich auf 37 & Grad; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% in PBS, erwärmen auf 37 & Grad; C vor der Anwendung</td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>geben Sie 5 ml auf 500 ml Medium</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 und 1,5 mM KH2PO4 in 1.000 ml H2 O, pH bis 7,4 und autoklaviert, erwärmen auf bis zu 37 & Grad; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>erwärmt sich auf 37 & Grad; C vor dem Gebrauch, die Zellen 3-5 Minuten bei 37 μg behandeln; C</td></tr><tr><td colspan="4">Galvanotaxis-Gerät</td></tr><tr><td>Galvanotaxis-Kammern</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>Kundenspezifisch (1/4" x 2" x 3,5"), ungiftige, durchsichtige PVC-Kammern. Bitte wenden Sie sich an die Autoren, um die Designspezifikationen zu erhalten.</td></tr><tr><td>Galvanotaxis-Elektroden</td><td>UCD Elektrogeschäft</td><td></td><td>Platin-Spiralelektroden mit flexiblen Kabeln</td></tr><tr><td>Galvanotaxis Power Box</td><td>Substrate Engineering, CA</td><td></td><td>kundenspezifischer Gleichstromausgang mit Voltmeter</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas, groß, 45 x 50 mm, Nr. 1,5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas, klein, 25 x 25 mm, Nr. 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>Diamant-Punktmarkierer</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Silikonversiegelung in Marinequalität, klar</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Spritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Nichiryo Spritze, 1,5 ml</td><td>Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>Baumwollapplikatoren</td><td>Purtian Medical Products</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>Johnson & Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 PVC-Schlauch</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>make 2% agar solution</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Personna</td><td>74-0001<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Ausrüstungen und Software</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>betrieben mit einem A-4-62 Rotor</td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Zählkammern</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>Last 20 &#956; l Zelllösungen zum Zählen</td></tr><tr><td>der Kulturtemperatur Warmhalteplatte</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td>, <td>um die Galvanotaxis-Kammern bei 37 & Grad zu halten; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000 Mikroskop mit motorisiertem Tisch und Klimakammer</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0,30 Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX CCD-Kamera</td><td>Qimaging Gekühlte</td><td></td><td>CCD-Kamara, einfarbig, 12-Bit</td></tr><tr><td>Druckluft mit 5 % CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td>Sonderbestellung</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Bilderfassungssoftware</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Zellverfolgungssoftware und angepasst zur Messung von Migrationswinkeln</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 für Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung maßgeschneiderte galvanotaxis chambers zu directional migration studie von prostatazellen

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

Die physiologische elektrische Feld dient spezifische biologische Funktionen, wie zB die Leitung der Zellmigration in der Embryonalentwicklung, neuronale Auswachsen und epithelialen Wundheilung. Anlegen eines Gleichstromfeldes, um kultivierte Zellen in vitro induziert gerichteten Zellmigration oder Galvanotaxis. Die 2-dimensionalen Galvanotaxis Verfahren wir hier zeigen, wird mit maßgeschneiderten Poly (vinylchlorid) (PVC) Kammern, Glasoberfläche, Platin-Elektroden und der Verwendung eines motorisierten Tisch, auf dem die Zellen abgebildet werden modifiziert. Die PVC-Kammern und Platinelektroden eine geringe Zytotoxizität und sind erschwinglich und wiederverwendbare. Die Glasoberfläche und der motorisierten Mikroskoptisch zur Verbesserung der Qualität der Bilder und lassen mögliche Änderungen an der Glasoberfläche und Anwendungen zu den Zellen. Wir filmten die Galvanotaxis von zwei nicht-tumor, SV40-immortalisierten Prostata-Zelllinien, PRNs-1-1 und PNT2. Diese beiden Zelllinien zeigen ähnliche Migrationsgeschwindigkeiten und beide wandern zudie Kathode, aber sie zeigen ein unterschiedliches Maß an Richtwirkung in Galvanotaxis. Die über dieses Protokoll erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PRN-1-1 und die PNT2 Zelllinien können unterschiedliche intrinsische Eigenschaften, die ihren Richtungsmigrations Antworten zu regieren.

Zwei Linien der Prostatazellen (PRNs-1-1 und PNT2) wurden mit dieser Methode untersucht. Zellen in beiden Leitungen wandern bei ähnlichen Geschwindigkeiten von 1,0 +/- 0,3 um / min im Verlauf von 2-Stunden (5A). , Die Direktionalität zu dem elektrischen Feld ist jedoch 0,7 +/- 0,3 für das PRN-1-1 Linie und 0,2 +/- 0,8 für die PNT2 Leitung (5B). Die Ergebnisse zeigen einen signifikanten Unterschied in der Galvanotaxis dieser beiden Zelllinien (p &lt;0,01, 100-Zellen wurden verfolgt), was...

Wir stellen eine Methode vor, um ein physiologisches elektrisches Feld an wandernde, immortalisierte Prostatazellen in einer speziell angefertigten Galvanotaxiskammer anzulegen. Mit dieser Methode zeigen wir, dass 2 Linien von nicht-tumorigenen Prostatazellen im Feld unterschiedliche Grade der Migrationsrichtung aufweisen.

Verwendung Maßgeschneiderte Galvanotaxis Chambers zu Directional Migration Studie von Prostatazellen

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung von Galvan Axxis, einem Assay zur Beurteilung der gerichteten Migration von Zellen in einem angelegten elektrischen Feld. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Galvan axxis-Kammer mit den interessierenden Zellen zusammengebaut und dann besiedelt wird. Im zweiten Schritt wird die Kammer verschlossen und ein elektrisches Feld für die Zeitraffer-Bildgebung angelegt.Im letzten Schritt wird die Migrationsgeschwindigkeit einzelner Zellen und der Winkel relativ zum elektrischen Feld verfolgt. Letztendlich mitunterzeichnen. Mit ihnen lässt sich zeigen, wie die Zellen auf das elektrische Feld reagieren und ob sie gerichtet zur Kathode wandern.Der Hauptvorteil dieser Technik ist die einfache Zellentnahme nach Verabreichung von Texas für die Sekundäranalyse und die Leichtigkeit, mit der die Migration bei hoher Vergrößerung und mit fluoreszenzmarkierten Zellen gefilmt werden kann. Die Visualisierung dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Montageschritte einer Kammer ohne Demonstration schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, eine galvanische Axxis-Kammer aus Kunststoff mit zwei Propanol abzuwischen.Verwenden Sie dann eine Spritze, um Silikonversiegelung in Marinequalität um die kreisförmigen Öffnungen an der Unterseite der Kammer aufzutragen. Platzieren Sie ein großes Deckglas über dem Dichtmittel und drücken Sie es mit dem Ende eines Baumwollapplikators fest, wobei Sie den überschüssigen Kleber mit dem Wattestäbchen abwischen. Schneiden Sie dann mit einem Diamantmarkierer ein kleines Deckglas so aus, dass sechs mal 25 Millimeter große Lücken entstehen, und drehen Sie die Kammer um.Tragen Sie anschließend mit einer Spritze zwei Streifen Silikon auf, so dass zwischen den beiden kreisförmigen Öffnungen auf dem Bodenglas eine 10 x 25 Millimeter große Kanaloberfläche für die Zellbefestigung entsteht. Kleben Sie dann zwei Glasstellen zwischen die runden Öffnungen, drücken Sie die Zwischenräume mit einem neuen Baumwollapplikator nach unten und wischen Sie den überschüssigen Kleber ab, wie gerade gezeigt. Probieren Sie die Kammer 24 Stunden lang aus, bis der Silikonkleber ausgehärtet ist.Weichen Sie die Kammer am nächsten Tag über Nacht in destilliertem Wasser ein, um die Essigsäurerückstände vom Kleber zu entfernen, bevor Sie die Zellen in die Kammer säen. Trocknen und wischen Sie die Kammern mit zwei Propanol ab, wie gerade gezeigt. Waschen Sie sie mehrmals mit sterilem PB S3 und kontrollieren Sie anschließend den Flüssigkeitsfluss zwischen den beiden kreisförmigen Öffnungen in den Kammern.Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Kammern in gutem Zustand sind, schließen Sie sie in sterile Kulturschalen ein und stellen Sie die Kammern 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Während sich die Kammern ausgleichen, lösen Sie die Prostatazellen mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius aus ihrer Kulturschale. Nach fünf Minuten neutralisieren Sie die Reaktion mit fünf Millilitern 10%FBS.In PBS werden die abgelösten Zellen in 15-Milliliter-Röhrchen überführt und anschließend fünf Minuten lang zentrifugiert. Bei 200 mal G das Medium ansaugen und dann das Pellet in einem Milliliter Medium resuspendieren. Passen Sie dann nach dem Zählen der Zellen die Zellkonzentration auf acht x 10 für die vier Zellen pro Milliliter mit Kulturmedium und Saatgut an.350 Mikroliter der Zellsuspension auf jede Kammer geben. Inkubieren Sie die Zellen in der Kammer über Nacht in einer Kulturschale mit einem feuchten Kim-Tuch bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Beginnen Sie am nächsten Tag mit dem Zusammenbau der oberen Kammern, indem Sie zunächst 10 Milliliter Kultur bei mittlerer Temperatur auf 37 Grad Celsius für jede galvanische AXS-Kammer erwärmen.Während sich das Medium erwärmt, wird eine Galvan axxis Kammer aus dem Inkubator auf eine 37 Grad Celsius warme Warmhalteplatte umgefüllt und die Kammer mit Nährboden gespült. Um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen, lassen Sie 400 Mikroliter Medium in der Kammer und tragen Sie dann mit einer Spritze Hochvakuumfett auf beide Glasräume auf. Versiegeln Sie die Kammer mit einem Deckglas und einem Baumwollapplikator und trocknen Sie dann die Glasoberfläche.Tragen Sie anschließend das Hochvakuumfett mit einer Spritze auf, um den Spalt zwischen dem Deckglas und der Kammer abzudichten. Geben Sie dann das Nährmedium in die inneren Reservoirs. Entfernen Sie Blasen und überprüfen Sie den Flüssigkeitsfluss zwischen den Behältern.Um die Agarbrücken herzustellen, schneiden Sie ein Paar zwei Zoll große PVC-Röhren ab, drehen Sie sie um und legen Sie die Stücke dann in ein 100-Milliliter-Becherglas. Geben Sie als nächstes 200 Milligramm Bakterikto-Agar in einen 50-Milliliter-Kolben mit 10 Millilitern Nährmedium, um ein 2%-Agar-Gel herzustellen. Nachdem Sie 30 Sekunden lang in der Mikrowelle gehalten haben, verwenden Sie eine Transferpipette, um das Agargel in den Kunststoffschlauch zu laden, und lassen Sie die Agarbrücken 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den Agar zu verfestigen.Geben Sie dann zwei Milliliter Kulturmedium in die äußeren Reservoire der Galkammer und setzen Sie die Agarbrücken in das innere und äußere Mediumreservoir ein, um den Strom zu leiten und eine Zeitrafferbildgebung der Migration durchzuführen. Beginnen Sie damit, die Galvankammer in eine 37 Grad Celsius heiße Klimakammer auf dem Mikroskoptisch zu überführen, die Kammer mit Klebeband zu sichern und sich auf die Zellen unter einem 10-fach-Objektiv zu konzentrieren. Führen Sie anschließend die Galvan Axxis Elektroden mit der Kathode auf der rechten Seite in die äußeren Behälter ein und befestigen Sie den Draht und die Elektroden mit Klebeband.Schalten Sie dann die Powerbox ein, um ein elektrisches Feld an die Kammer anzulegen, und verwenden Sie ein Spannungsmessgerät, um die Ausgangsspannung in der gesamten Kammer zu messen, um 2,5 Volt für die 25 Millimeter lange Kammer zu erreichen. Wählen Sie nun 10 Punkte in der Kammer aus, um 10 Zeitrafferfilme zu erzeugen, und stellen Sie die Aufnahmebedingungen auf 10-Minuten-Intervalle für zwei Stunden ein. Beginnen Sie dann mit dem Filmen und passen Sie den Ausgangsstrom nach Bedarf an, um die Feldstärke während des Experiments aufrechtzuerhalten.Am Ende des Experiments nehmen Sie die Kammer vom Tisch und fixieren Sie die Zellen in 95%igem Alkohol. Brechen Sie dann die Kammer auf. Der Deckglas kann für später gespeichert werden.Färbung und Bildgebung. Reinigen Sie die Kammer für die kommenden Jahre. Um die Galvan Axxis zu quantifizieren, drehen Sie die Zeitrafferfilme, um die Kathode am oberen Rand der Bilder auszurichten.Exportieren Sie die Filme in die Zellverfolgungssoftware und verfolgen Sie manuell die XY-Position von 10 bis 20 Zellen zu jedem Zeitpunkt aus jedem Film, die Migrationsabstände und die Winkel relativ zur Nord-Süd-Richtung, die gleiche Ausrichtung des elektrischen Feldes wird in der Zellverfolgungssoftware berechnet. Speichern Sie abschließend die Messungen und importieren Sie die Daten in eine Datenbankanwendung, um die kombinierten Ergebnisse zu berechnen. In diesem repräsentativen Galvan Axxis Experiment wurde festgestellt, dass Linien von Prostatazellen im Laufe von zwei Stunden mit ähnlicher Geschwindigkeit wandern.Die Richtungsabhängigkeit des elektrischen Feldes betrug jedoch 0,7 plus minus 0,3 für das PRNS eine Linie und 0,2 plus minus 0,8 für das PNT mit zwei Linien, was auf einen signifikanten Unterschied in der Galvan-Achse dieser beiden Zelllinien hinweist, was darauf hindeutet, dass ihre zellulären Signalmechanismen nach der Entwicklung der Govan-Methode in Texas unterschiedliche Migrationsreaktionen auf das elektrische Feld steuern. Diese Technik hilft den Forschern, die Mechanismen der gerichteten Zellmigration im Elektrofeld zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zeitraffer-Aufnahme von 3D-Gewebekultur ermöglicht das Studium Zugverhalten von einzelnen Zellen, die aus ganglionären Eminenz in Reaktion auf fraktionierte Proteinextrakt aus Großhirnrinde.

Zugverhalten von Zellen in ganglionären Eminenz Kulturen Generated

Ein Ansatz, um die Migration von explantierten Zellen (Stamm Neuralleistenzellen) analysieren beschrieben. Dieses Verfahren ist kostengünstig, leicht, und in der Lage zu unterscheiden Chemotaxis sowohl Chemokinese und andere Einflüsse auf wandernde Polarität wie die von Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des primären Stamm Neuralleiste Zellkultur abgeleitet.

Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Ein quantitatives Verfahren zur spontanen Migration von Zellen in einem eindimensionalen beschränkt Mikro studieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt den Vorteil der mikrogefertigten Kanälen und kann verwendet werden, um die Migration der Vielzahl von Zellen unter verschiedenen Bedingungen in einzelnen Experimenten zu untersuchen.

Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

Zellmigration ist ein wichtiger Teil der menschlichen Entwicklung und des Lebens. Um die Mechanismen zu verstehen, die die Zellmigration verändern können, stellen wir ein planares Gradientendiffusionssystem zur Untersuchung der Chemotaxis in einer 3D-Kollagenmatrix vor, das es ermöglicht, die Einschränkungen moderner Diffusionskammern bestehender Assays zu überwinden.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

Viele mikrofluidische Geräte wurden für die Untersuchung von Elektrotaxis entwickelt. Keiner dieser Chips ermöglicht jedoch die effiziente Untersuchung der gleichzeitigen Auswirkungen chemischer und elektrischer Felder (EF) auf Zellen. Wir haben ein Gerät auf Basis von Polymethylmethacrylat entwickelt, das eine besser kontrollierte Koexistenz von EF und chemischer Stimulation für den Einsatz in der Elektrotaxieforschung bietet.

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

Visual-Chemotaxis-Assays sind für ein besseres Verständnis, wie eukaryotische Zellen steuern chemoattractant vermittelten Richtungszellmigration. Hier beschreiben wir detaillierte Methoden für: 1) in Echtzeit, hochauflösende Überwachung mehrerer Chemotaxis-Assays und 2) gleichzeitig die chemische Lockstoffe Gradienten zu visualisieren und die räumlich-zeitliche Dynamik der Ereignisse in Neutrophilen wie HL60-Zellen signalisiert.

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Dieses Protokoll Informationen eine anpassbare Methode Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Lockstoffe zu messen, die auch die Diffusionsgeschwindigkeit eines Arzneimittels verwendet werden kann, aus einer Polymermatrix zu bestimmen.

Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Hier beschreiben wir Leben-Zelle bildgebende Verfahren um die Migration und Invasion von Glioblastom Gehirn Tumor-Stammzellen im Laufe der Zeit und unter mehreren Behandlungsbedingungen quantitativ zu messen.

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Lernen Sie die Galvanotaxis-Methode zur Untersuchung der gerichteten Migration von Prostatazellen in elektrischen Feldern. Diese Technik ermöglicht die Analyse unterschiedlicher Zelllinienverhalten.

Verwendung Maßgeschneiderte Galvanotaxis Chambers zu Directional Migration Studie von Prostatazellen

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