Name: Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung von Elektrotaxis bei Lungenkrebszellen mit einem Mehrkanal-Mikrofluidik-Chip. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Kinase-Inhibitoren auf die Zellmigration unter elektrischen Feldern.

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Diese Arbeit wird finanziell unterstützt vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (Vertrags-Nr. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) und dem Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.

1. Konstruktion und Herstellung der MDF-Chip <ol><li> Zeichnen Sie einen individuellen Acrylschicht Muster unter Verwendung kommerzieller Software wie AutoCAD, und speichern Sie das Muster. <ol><li> Überprüfen Sie die Gestaltung des Vier-Schicht-Acrylglas-Muster in 1A und bestätigen Sie die Durchkontaktierungen. </li></ol></li><li> Herzustellen alle Acrylglasplatten und das doppelseitige Klebeband durch Laserablation unter Verwendung eines CO 2 -Lasers scriber (1B, 2A und 2B). 16 <ol><li> Schalten Sie den Laser-Anreißer und schließen Sie das Gerät an die Steuerung Laptop. </li><li> Führen Sie das kommerzielle Software und öffnen Sie das Muster in Schritt 1.1 ausgelegt, indem Sie auf &quot;konzipiert Pattern-Datei.&quot; </li><li> Legen Sie ein Stück leere Acrylglas oder doppelseitigen Klebeband auf der XYZ-Bühne des Laser-Anreißer. </li><li> Einstellen des Fokus des Laserstrahls auf der Oberfläche der Acrylfolie oder doppelseitiges Klebeband mit einem Auto-alignment-Stick vom Hersteller des Laserreißnadel vorgesehen. </li><li> Senden die entworfenen Muster zum Laserritz zur direkten Bearbeitung der Acrylglasplatte oder doppelseitiges Klebeband. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Schutzpapier von der Acrylglasplatten mit einer Pinzette und blasen die Oberfläche sauber mit Stickstoffgas. </li><li> Ablegen der Acrylplatten und miteinander zu verbinden unter einem Druck von 2 kg / cm 2 in einem Thermobonder 45 min bei 110 ° C, um den Strom / elektrische Stimulation Kanalanordnung zu bilden. </li><li> Bereiten Sie die Mikroskop-Deckglas als Zellkultursubstrat im Chip. <ol><li> Legen Sie das Deckglas in Küvette und füllen das Glas mit einer zehnfachen Verdünnung des Waschmittels in der Materialliste aufgeführt. </li><li> Legen Sie das Deckglas und Küvette in einem Ultraschall-Steri-Reiniger und reinigen Sie das Deckglas 15 min. </li><li> Gießen Sie die verdünnten Reinigungsmittel aus der Küvette füllen Sie das Gefäß mit destilliertem Wasser, und wiederholen Sie Schritt 1.5.2 3 mal. </li><li> Trocknen des gereinigten Abdeckglas durch Ausblasen mit Stickstoff, bevor zu dem doppelseitigen Klebeband Ankleben. </li></ol></li><li> Halten Sie die gereinigte Deckglas auf das Fluss / elektrische Stimulation Kanalanordnung mit dem doppelseitigen Klebeband in Schritt 1.2 gemustert. </li><li> Anhaften 13 Stücke Acryl Adaptoren an die einzelnen Öffnungen in der Schicht 1 der MDF-Chip-Montage mit Sekundenkleber. Die MDF-Chip-Montage ist dann abgeschlossen (2D). </li><li> Sterilisieren Sie die komplette MDF-Chip-Montage mit 30 Minuten der UV-Bestrahlung vor der Verwendung. </li></ol> 2. Einrichten der Salzbrücke Netzwerk der MDF-Chip <ol><li> Vor der Verwendung zu sterilisieren alle Kunststoff-Rohre, fingerfest Muttern und Mikrozentrifugenröhrchen in 3B gezeigt ist, durch Einstellen einer Haltezeit von 15 min bei 121 ° C im Autoklaven. </li><li> Schließen Sie die Fluorkunststoffrohre (3B-i) auf die MDF-Chip-Montage über den Mitteleingangund Ausgangsadaptern in 1A gezeigt. </li><li> Verbinden Sie den Luer-Konus des Mediums Einlass- und Auslass-Kunststoffrohre in 3B-i an die 3-Wege-Hähne. </li><li> Nehmen 2,5 ml CO 2 -equilibrated phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter Verwendung einer 3 ml-Spritze und verbinden die Spritze mit dem 3-Wege-Hahn des Einlasskunststoffrohr. Schließen Sie eine leere 3-ml-Spritze mit dem 3-Wege-Hahn der Austrittskunststoffrohr. Die beiden Spritzen werden somit durch die MDF-Chip verbunden sind. HINWEIS: Inkubieren Sie die PBS in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturinkubator O / N zu erhalten, CO 2 -equilibrated PBS. </li><li> Verschließen Sie die Öffnungen der blauen und der grünen Adapter (Abbildung 1A) auf dem Layer 1 PMMA-Platte mit weißen Festhandfest Muttern (3B-III). </li><li> Füllen Sie die Salzbrücke Kanälen und Kulturkammern mit dem CO 2 -equilibrated PBS in der im Setup-Schritt 2.4 beschrieben Spritze. Vermeidendie Bildung von Blasen. </li><li> Als nächstes setzen Sie den CO 2 -equilibrated PBS-haltigen MDF-Chip in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturbrutschrank für O / N Inkubation. Dies ermöglicht die gelöste Luft in dem doppelseitigen Klebeband um Blasen in den Kammern bilden. </li><li> Wegspülen die Blasen in den Kanälen durch eine schnelle PBS Strömung im Kanal mit Hilfe der zwei Spritzen. Pumpen Sie den PBS hin und her, wenn nötig. </li><li> Ablassen PBS in den Kanälen über die 3-Wege-Hahn zum Medium Auslaßrohr verbunden ist. </li><li> Unter Verwendung einer neuen 3-ml-Spritze nehmen 2,5 ml CO 2 -equilibrated Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (siehe Schritt 3.5), und ersetzen Sie die Spritze mit dem Einlass mit dem neuen verbunden. Füllen Sie die Kanäle mit dem Medium. </li><li> Herstellung der Salzbrücke Netzwerk. <ol><li> Zeitlich entfernen Sie die Feststoffmuttern (3B-iii) auf den grünen Adapter (Abbildung 1A) und injizieren 3% heiß (&gt; 70 ° C) Agarose in die Salz briDGE Kanal durch die Öffnung in dem Grün Adaptern (1A). HINWEIS: Herstellung von heißen Agarose: Man löst 1,5 g Agarose-Pulver in 50 ml PBS. Sterilisieren durch Einstellen einer Haltezeit von 20 min bei 121 ° C im Autoklaven. </li><li> Das Einspritzen der Agarose, wenn die Flüssigkeit drei Viertel der Länge des Salzbrückenkanal ausfüllt. </li><li> Versiegeln der Poren auf die grünen Adapter (1A) durch Einschrauben der Feststoffmuttern (3B-iii) nach der Agarose-Injektion. </li><li> Ersetzen Sie die Feststoffmuttern an den blauen Adaptern (Abbildung 1A) mit den durchscheinenden Rohrhandfest Muttern (3B). </li><li> Laden der 3% Agarose in die Rohrmuttern (3B-iv) vorgewärmt. </li><li> Betten Sie die Ag / AgCl-Elektroden (3B-v) in die rohrförmigen Muttern (3B-IV), bevor dieVerfestigung der Agarose. </li></ol></li><li> Nach Abschluss der Einrichtung der Salzbrücke Netzwerk, injizieren die CL1-5 Lungenkrebszellen in die Kulturkammern, eine Kammer zu einer Zeit. </li></ol> 3. Herstellung von Krebszellen und zum beliebig Electrotactic Experiment <ol><li> Regelmäßige Kultur der Lungenkrebszelllinie CL1-5. <ol><li> Kultur die CL1-5 Lungenkrebszellen, von Prof. Pan-Chyr Yang, 17 in der Vollmedium in einem 75T Zellkulturflasche bei 37 erhalten ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Der komplette Medium besteht aus DMEM und 10% fötalem Rinderserum (FBS) zusammengesetzt ist. Subkultur der Zellen alle 3 bis 4 Tage. Die zur Durchführung electro Experimenten verwendeten Zellen sind weniger als 25 Passagen von der ursprünglichen Quelle. </li></ol></li><li> 2 ml 0,25% Trypsin-Puffer auf die exponentiell wachsenden Zellen CL1-5 und Inkubation für 2 min in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturbrutschrank zur Zell detachment. </li><li> Beenden des Ablöseprozesses mit 6 ml 10% FBS DMEM und zentrifugiere die Zellen bei 300 g für 5 min bei RT. Dann werfen Sie die mittlere und die Aussetzung der Zellpellet mit 5 ml PBS. </li><li> Zählen die Anzahl von Zellen in der PBS. Dann nehmen Sie 1 x 10 6 Zellen und Zentrifuge bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Entsorgen Sie die PBS. Aussetzung der Zellen mit vorgewärmtem CO 2 -equilibrated DMEM und stellen Sie die Zelldichte auf 1 × 10 6 Zellen / ml liegen. HINWEIS: Inkubieren Sie die Vollmedium in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturinkubator O / N, um das CO 2 zu erhalten -equilibrated DMEM. </li></ol> 4. Richten Sie für Electrotactic Experiment <ol><li> Von dem Auslaß der MDF-Chip injiziert 0,3 ml, 1 × 10 6 / ml, der Zellen in dem Chip. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen ausgesät MDF-Chip in der Zellkultur-Inkubator (bei 37 gesetzt ° C und 5% CO 2) für 2-4 Std. </li><li> Setup von MDF MikroFluidsystems. <ol><li> Installieren Sie die MDF mikrofluidischen System auf einen transparenten Indiumzinnoxid-Glas (ITO) Heizung. Messen Sie die Temperatur des MDF-Chip mit einer K-Typ-Thermoelement zwischen dem MDF-Chip und dem ITO-Glas abgeschnitten. Steuern Sie die ITO-Heizung mit einer Proportional-Integral-Differential (PID) Steuerung. Stellen Sie die MDF mikrofluidischen System Inkubationstemperatur auf 37 ° C mit dem PID-Regler. HINWEIS: Die Herstellung des ITO Heizer und der Aufbau der Zellkultur Heizsystem in früheren Berichten beschrieben 18,19. </li><li> Montieren Sie den temperaturgesteuerten MDF-Chip-Montage auf der computergesteuerten XYZ Motortisch auf einem inversen Mikroskop. Die Nutzung des motorisierten Stufe wird in Schritt 5.1 beschrieben. Pumpe das Vollmedium in die Kulturkammern durch die Einlässe mit einem Vierkanal-Spritzenpumpe. </li></ol></li><li> Pumpe das Vollmedium in die MDF-Chip mit einer Flussrate von 20 ul / h. Die Kultur Abfälle aus der auslässt sich in den Reaktionsgefäßen (als &quot;Abfall&quot; in 3A gezeigt) gesammelt. </li><li> Die Zellen für weitere 16-18 h bei 37 ° C in der MDF-Chip. </li><li> Um das Medium zu ersetzen, die Pumpe das Medium, das 50, 25, 5 und 0 &amp; mgr; M-Kinase-Inhibitor jeweils in jeder Kulturkammer mit einer Flussrate von 20 ul / min für 10 min. HINWEIS: Die Herstellung einer 10 mM Stammlösung des Rho-assoziierten Proteinkinaseinhibitor Y27632 durch Zugabe von 3 ml steriles Wasser zu der 10,6 mg-Kinase-Inhibitor. Verdünne die 10 mM Stammlösung zu 50, 25 und 5 &amp; mgr; M unter Verwendung von 10% FBS DMEM Medium. </li><li> Die Zellen in der Kinase-Inhibitor zur weiteren 60 min bei 37 ° C. Stellen Sie den mittleren Strömungsgeschwindigkeit auf 20 &amp; mgr; l / h. Verwenden Sie die gleiche Kultur Temperatur und Strömungs oben in späteren Schritten beschrieben Rate. </li><li> Verwenden elektrischer Drähte an eine Gleichstromversorgung an die MDF-Chip über die Ag / AgCl-Elektroden, die auf dem Chip zu verbinden. </li><li> Seriell verbinden ein Amperemeter in die elektrische Schaltung. Verwenden Sie das Amperemeter, um den elektrischen Strom in der MDF-Chips überwachen. </li><li> Schalten Sie die DC-Stromversorgung und den Strommesser Strom um 86,94 &amp; mgr; A durch Einstellen der Stromversorgungsspannung zwischen 15 und 19 V. BEMERKUNG: Die Größe des Ohmschen Gesetzes, E = I / (&amp; Sgr; A eff), wobei I der elektrische Strom durch das Schüttgut strömt, dh das Kulturmedium in electrotactic Kammer, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) ist das Leitfähigkeit des Kulturmediums A eff (= 0,21 mm 2 für eine 3 mm Breite · 0,07 mm Höhe) ist die effektive Querschnittsfläche des electrotactic Kammer und der elektrische Strom (I) erforderlich, um eine 300 mV / mm erzeugen EF in der MDF-Chip ist 86,94 &amp; mgr; A. </li></ol> 5. Aufnahme und Analyse von Zellbildern <ol><li> Steuern Sie den Motortisch mit Hilfe eines MATLAB GUI-Programm. Mit der MDF mikrofluidischen System auf der microsco montiertpe, bewegen Sie den Chip an den Beobachtungsbereichen mit Hilfe der motorisierten Bühne. </li><li> Rekordzelle Bilder mit einem digitalen Spiegelreflex (SLR) am Mikroskop montiert. </li><li> Nehmen mikroskopischen Bildern mit einem 4X Objektiv in Intervallen von 15 min für 2 Stunden. </li><li> Zellmigration Analyse. <ol><li> Führen NIH ImageJ 1,47 V. </li><li> Analyse der Abstand von der Anfangs- in die Endstellung des Schwerpunkts der Zelle. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Datei&quot; → &quot;Import&quot; → &quot;Bildsequenz&quot;, und importieren Sie neun Bilder für Zellmigration Analyse. Das erste Bild ist das Ergebnis der Zeit Null, und das letzte Bild ist das Ergebnis von 120 min. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Analyze&quot; → &quot;Messungen&quot; und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben &quot;Centroid&quot; </li><li> Klicken Sie auf das Symbol &quot;Freihand-Auswahl&quot;. </li><li> Stellen den Rand der ausgewählten Zellen in dem ersten Bild. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; → </em&gt; &quot;Auswahl&quot; → &quot;um-Manager hinzufügen&quot; </li><li> Zum neunten Bild und stellen den Rand der gleichen Zellen auf das erste Bild ausgewählt. Die Zellpositionen können mit dem zweiten bis achten Bilder zurückverfolgt werden. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; → &quot;Auswahl&quot; → &quot;um-Manager hinzufügen&quot; </li><li> Die Schritte 5.4.5 bis 5.4.9, um Daten von 90 bis 100 Zellen zu sammeln. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Analyze&quot; → &quot;Messen&quot;, um das Ergebnis der ersten und letzten Positionen der ausgewählten Zellen zu erhalten. HINWEIS: Die Migrationsgeschwindigkeit als der durchschnittliche Zellbewegung Länge pro Stunde definiert. Die Gerichtetheit wird als Cosinus, wobei der Winkel zwischen dem Vektor der dcEF (von der Anode zur Kathode) und der Vektor von dem Ausgangspunkt einer Zelle in ihre Endposition definiert. Die Gerichtet -1 ist für Zellen, die Migration in Richtung der Anode und +1 für Zellen migrieren zu der Kathode. Für eine Gruppe der statistisch miGitterzellen, die Gerichtetheit ist 0. 2 </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir haben den Prozess der haftenden Acryladapter auf Schicht 1 des MDF-Chip tricky sein. Der Einsatz von nur 1 bis 2 &amp; mgr; l Superkleber ist ausreichend, um fest zu halten den Adapter auf die MDF-Chip. Größere Mengen von Kleber führte zu einer unvollständigen Polymerisation der Superkleber und Misserfolg zu haften. Sobald die Acryl-Adapter wurden fest auf das MDF-Chip geklebt, Flüssigkeitsleckage in der mikrofluidischen System nur selten aufgetreten. Außerdem O / N Inkubation in der Vakuumkammer dazu beigetragen, d...

Das Verhalten von adhärenten Zellen sich in Richtung einer Anode oder Kathode unter einem elektrischen Gleichstromfeld (dcEF) als Elektrotaxis bezeichnet. Die electrotactic Verhalten von Zellen spielt eine wichtige Rolle in der Embryogenese, die Nervenregeneration und Wundheilung. 1-Tumorzellen wie Ratte Prostatakrebszellen, Brustkrebszellen, 2, 3 und Lungenadenokarzinomzellen 4-8 haben electrotactic Bewegung unter einem angelegten dcEF gezeigten . Die physiologische EF in Drüsengeweben gemessen. 9,10 electro wurde auch in Drüse assoziierten Tumorzellen berichtet. 2,3 Zusammen bilden die Elektrotaxis von Krebszellen wird als Metastasierung Faktor. 11 Steuerung der elektrischen Leitung von Krebszellen unter dcEF kann ein möglicher Ansatz für die zukünftige Behandlung von Krebs. Heute bleibt jedoch die detaillierte molekulare Mechanismus electro umstritten. Daher eine Untersuchung der influence der elektrischen Stimulation auf Krebszellmigration können die Entwicklung von Strategien für die Krebsbehandlung zu erleichtern. Vor kurzem haben Bio-Mikrofluidik-Vorrichtungen für die Untersuchung zellulärer Reaktionen in vitro fließen Scherkraft, 12 chemische Gradienten, 13 und elektrische Reize 4 hergestellt worden. Die Herstellung von Bio-Mikrofluidik-Vorrichtungen mit Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethylmethacrylat (PMMA, als Acryl bekannt) erfolgreich verringert die Ausfallrate solcher Experimente. Darüber hinaus mit Acrylbasis mikrofluidischen Vorrichtungen als Prototyp für die Untersuchung von biologischen Fächern ist einfacher als mit PDMS-Chips. Verschiedene Funktionen in Acrylbasis Geräte sind für die Elektrotaxis Studie entwickelt. Jedoch keine der vorgenannten Ausführungen sind in der Lage, gleichzeitig zu testen, die Auswirkungen von verschiedenen chemischen Bedingungen und die elektrische Feld auf Zellen für electro Studie. So eine Mikrofluidikvorrichtung-MU entwickelten wirltichannel Dual-elektrischen Feldes (MDF) Chip-haltigen vier unabhängige Kulturkanäle und acht verschiedenen experimentellen Bedingungen in einem Chip. Die auf Acrylbasis MDF-Chip, die zuerst von Hou et al berichtet., 8 integriert elektrische Stimulation und mehrere chemisch getrennte Kanäle. Diese chemisch isoliert Kanäle können zur Kultur verschiedene Arten von Zellen in einem Experiment verwendet werden. Die dcEF in den Kanälen wird durch eine elektrische Stromversorgung hergestellt wird. Zwei unabhängige elektrische Felder, eine mit angelegten elektrischen Feldstärke (EFS) und ein weiteres mit 0 EFS, sind in jedem chemisch isolierten Kanal durchgeführt. Auf diese Weise bietet der Chip besser gesteuert koexistierenden EF und chemische Stimulation. Ferner ergibt sich aus der numerischen Simulation der chemischen Diffusion innerhalb der MDF-Chips anzuzeigen, dass keine Kontamination zwischen den Kanälen nach 24 h Versuchsdauer aufgetreten. 8 Gegenüber dem Device von Li berichtet, et al., bietet 14 der MDF-Chip einen größeren Kulturbereich, der für die weitere biochemische Analyse der elektrisch stimulierten Zellen ermöglicht. Zusätzlich mit größeren Beobachtungsbereich der MDF-Chips, mehr Zellen können in dem Test beobachtet werden, so dass die Analyse der Migrationsgeschwindigkeit bzw. Gerichtetheit der elektrisch stimulierten Zellen ist genauer. Einkanal-Chip-Designs früherer Studien von Huang et al. 4 und Tsai et al. 15 berichtet erlauben nur einen Zelltyp oder zu testenden Chemikalie. Jedoch kann die MDF-Chip verwendet, um die Wirkungen von verschiedenen Chemikalien auf electro sowie die Wirkungen der elektrischen Stimulation auf verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. Mit anderen Worten ermöglicht die effiziente Untersuchung von chemischen Dosis Abhängigkeiten der MDF-Chip.

<table><tbody><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Basic Life</td><td>BL2651</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Hydrochlorid)</td><td>Cayman Chemical Co</td><td>10005583</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>LONZO, USA</td><td>SeaKem LE AGAROSE</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Terumo</td><td>3 ml mit Luer-Kegel</td><td></td></tr><tr><td>3-Wege-Absperrhahn</td><td>Nipro</td><td>mit Luer-Kegel</td><td></td></tr><tr><td>PMMA (Acryl)</td><td>HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan</td><td></td><td>Dicke 1mm, 2mm</td></tr><tr><td>Acryladapter</td><td>KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td><td>1/4-28 Anschluss, 10x10x6 mm</td><td>kundenspezifische</td></tr><tr><td>Mutter</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Deckgl&auml; ser, Deutschland</td><td>24x60 mm</td><td></td></tr><tr><td>doppelseitiges Klebeband</td><td>3M</td><td>PET 8018</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>3M</td><td>Scotch Liquid Plus Super Glue</td><td></td></tr><tr><td>TFD4 Reinigungsmittel</td><td>Franklab, Frankreich</td><td>TFD4</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall Steri-Reiniger</td><td>LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Bonder</td><td>KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td><td>kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Laser-Ritzer</td><td>LTT-Gruppe, Taiwan</td><td>ISL-II</td><td></td></tr><tr><td>Proportional-Integral-Derivat (PID) Controller</td><td>JETEC Electronics Co., Japen</td><td>TTM-J40-R-AB,</td><td></td></tr> <tr><td>K-Typ Thermoelement</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td></td></tr><tr><td>4-Kanal-Spritzenpumpe</td><td>KdScientific, USA</td><td>250P</td><td></td></tr><tr><td>DC-Netzteil</td><td>GWInstek, Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Y-Z Motortisch</td><td>TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan</td><td>kundenspezifisches</td><td></td></tr><tr><td>inverses Mikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>digitale SLR-Kamera</td><td>Canon, Japan</td><td>60D</td><td></td></tr></tbody></table>

electro studium der lungenkrebszellen unter verwendung eines mehrkanal-zwei elektrischen feldes mikrofluidik-chip

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Das Verhalten des Richtzellmigration unter einem elektrischen Gleichstromfeld (dcEF) als Elektrotaxis bezeichnet. Die bedeutende Rolle von physiologischen dcEF in Führungszellbewegung während der Embryonalentwicklung, Zelldifferenzierung und bei der Wundheilung wurde in vielen Studien gezeigt worden. Durch Anlegen Mikrofluidik-Chips mit einem electro Assay wird der Untersuchungsprozess verkürzt und experimentelle Fehler minimiert werden. In den letzten Jahren mikrofluidischen Vorrichtungen Polymersubstanzen (beispielsweise Polymethylmethacrylat, PMMA, oder Acryl) oder Polydimethylsiloxan (PDMS) wurden weithin bei der Untersuchung der Reaktionen von Zellen auf eine elektrische Stimulation verwendet wird. Im Gegensatz zu den zahlreichen Schritte erforderlich, um eine PDMS-Gerät herzustellen, macht jedoch den einfachen und schnellen Aufbau der Acrylmikro fluidischen Chip ist für beide Geräte Prototyping und die Produktion geeignet. Die effiziente Untersuchung der simultanen chemischen und dcE noch keiner der gemeldeten Geräten erleichternF Wirkungen auf Zellen. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Konstruktion und Herstellung eines Acrylbasierten Multichannel-Dual-elektrischen Feldes (MDF) Chip, um die gleichzeitige Wirkung der chemischen und elektrischen Stimulation auf Lungenkrebszellen zu untersuchen. Die MDF-Chip bietet acht Kombinationen von elektrischen / chemischen Reize in einem einzigen Test. Der Chip nicht nur stark verkürzt die erforderliche Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit in electro Studien.

Herstellung und Montage der Vorrichtung MDF Ein schematisches Diagramm des Acrylbasis MDF-Chip ist in 1A gezeigt. Vier Acrylplatten, einem Deckglas, 13 Acryl Adapter, und ein Stück doppelseitiges Klebeband wurde bei der Montage des fertig gestellten MDF-Chips (2D) verwendet. Es gibt nur vier unabhängige Kulturkanäle in der MDF-Gerät. Jedoch die On-Chip-Salzbrücke Netzwerk erze...

Viele mikrofluidische Geräte wurden für die Untersuchung von Elektrotaxis entwickelt. Keiner dieser Chips ermöglicht jedoch die effiziente Untersuchung der gleichzeitigen Auswirkungen chemischer und elektrischer Felder (EF) auf Zellen. Wir haben ein Gerät auf Basis von Polymethylmethacrylat entwickelt, das eine besser kontrollierte Koexistenz von EF und chemischer Stimulation für den Einsatz in der Elektrotaxieforschung bietet.

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Das übergeordnete Ziel dieses mikrofluidischen Experiments besteht darin, die Wirkung von Kinaseninhibitoren auf die Migration von Tumorzellen unter einem direkten elektrischen Feld zu untersuchen. Diese Methode kann daher helfen, zentrale Fragen in der zellulären Elektrotaxis zu beantworten, beispielsweise, welche Signalwege bei der elektrischen Feld-gesteuerten Migration von Krebszellen entscheidend sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es sich um eine hochgradig reproduzierbare und zeitsparende Elektrotaxis-Analyse handelt, die leicht umzusetzen ist.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Diagnose der Metastasierungspotenz von Krebs. Da die Beweglichkeit magnetischer Krebszellen durch ein elektrisches Feld erhöht werden kann, kann diese Methode einen intrazellulären, elektrischen Test der Tumorzellen ermöglichen.Es kann auch bei Prozessen der Hautregeneration, wie der Wundheilung, angewendet werden. Beginnen Sie damit, mithilfe eines Zeichen- und Konstruktionsprogramms ein individuelles Muster für die Acrylschicht zu entwerfen. Speichern Sie das Muster und schalten Sie dann den Laserschreiber ein.Verbinden Sie den Schreiber mit dem Steuerungslaptop und klicken Sie auf die entworfene Musterdatei, um das Muster für die Acrylschicht zu öffnen. Legen Sie anschließend ein blankes Acrylblatt auf die X-, Y-, Z-Bühne des Laserschreibers und verwenden Sie den entsprechenden automatischen Ausrichtungsstab des Laserschreibers. Stellen Sie damit die Fokusebene des Laserstrahls auf die Oberfläche des Blattes ein.Schicken Sie das entworfene Muster an den Laserschreiber, um die Acrylplatte direkt zu bearbeiten. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette das Schutzpapier von den Acrylplatten und reinigen Sie die Oberflächen mit Stickstoffgas. Stapeln Sie nun die Platten und verbinden Sie sie unter einem Druck von zwei Kilogramm pro Quadratzentimeter in einem thermischen Bondgerät für 45 Minuten bei 110 Grad Celsius, um die Fluss-Elektrostimulationskanalbaugruppe zu bilden.Nachdem doppelseitiges Klebeband auf die gleiche Weise vorbereitet wurde, befestigen Sie die saubere Deckglasplatte an der Fluss-Elektrostimulationskanalanordnung. Anschließend verwenden Sie Sekundenkleber, um 13 Acryladapter an den einzelnen Öffnungen der ersten Schicht der Multikanal-Doppelfeld- oder MDF-Chip-Anordnung zu befestigen, um das Salzbrückennetzwerk des MDF-Chips aufzubauen. Beginnen Sie damit, Boden-Kunststoffschläuche über die mittleren Zulauf- und Ablaufadapter mit der MDF-Chip-Anordnung zu verbinden.Verbinden Sie anschließend den Luer-Anschluss der Kunststoffschläuche für den Medium-Zulauf und -Ablauf mit einem Dreiweghahn. Befestigen Sie eine 3-Milliliter-Spritze, die 2,5 Milliliter mit Kohlendioxid equilibriertes PBS enthält, am Dreiweghahn des Zulauf-Schlauchs und eine leere 3-Milliliter-Spritze am Dreiweghahn des Ablauf-Schlauchs. Versiegeln Sie die Öffnungen der blauen und grünen Adapter auf der Acrylplatte der ersten Schicht mit weißen festen, handfesten Muttern. Füllen Sie dann die Salzbrückenkanäle und die Kulturkammern mit dem mit Kohlendioxid equilibrierten PBS, wobei Sie darauf achten sollten, Luftblasen zu vermeiden.Überführen Sie den Chip über Nacht in einen Zellkulturschrank mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, damit die im beidseitigen Klebeband gelöste Luft am nächsten Morgen Blasen in den Kammern bilden kann. Verwenden Sie die beiden Spritzen, um einen schnellen PBS-Fluss zu erzeugen, um die Blasen herauszuspülen, wobei PBS nach Bedarf hin und her gepumpt wird. Sobald alle Blasen entfernt sind, nutzen Sie den Drei-Wege-Hahn, der mit dem Medium-Auslassschlauch verbunden ist, um das PBS aus den Kanälen abzulassen.Danach die mit dem Einlass verbundene Spritze durch eine Drei-Milliliter-Spritze ersetzen, die 2,5 Milliliter mit Kohlendioxid gesättigtes DMEM enthält, und die Kammern mit dem Medium auffüllen, bis die Kammern voll sind. Die festen Muttern von den grünen Adaptern entfernen und 3 % Agar, der auf mindestens 70 Grad Celsius erhitzt wurde, in den Salzbrückenkanal injizieren. Durch die Öffnungen in den Adaptern hindurch den heißen Agar für die Bildung der Salzbrücke injizieren und dabei sicherstellen, dass die mittlere Reihe zwischen den Kulturkammern blockiert wird.Beenden Sie die Injektion der Agros, sobald die Verbindung drei Viertel der Länge des Salzbrückenkanals ausgefüllt hat, und verschließen Sie die Poren erneut mit den festen Muttern. Ersetzen Sie nun die festen Muttern an den blauen Adaptern durch durchsichtige, tubförmige, handfeste Muttern und füllen Sie Aros in die tubförmigen Muttern ein. Danach setzen Sie Silber-Silberchlorid-Elektroden in die tubförmigen Muttern ein, bevor das Aro erstarrt.Um ein elektrotaktisches Experiment einzurichten, injizieren Sie 0,3 Milliliter Zellen über die Auslassleitung in den MDF-Chip und stellen den Chip anschließend in den Zellkulturtrockenschrank zurück. Nach zwei bis vier Stunden montieren Sie das MDF-Mikrofluidiksystem auf eine transparente Indium-Zinn-Oxid-Glasheizung und befestigen ein Thermoelement vom Typ K zwischen dem MDF-Chip und dem Indium-Zinn-Oxid-Glas. Um die Temperatur des Chips zu messen, verwenden Sie einen proportional-integrierenden-differenzierenden Regler (PID-Regler), um die Inkubationstemperatur des MDF-Mikrofluidiksystems auf 37 °C einzustellen, und montieren die temperaturgeregelte MDF-Chip-Anordnung auf die computerkontrollierte motorisierte XYZ-Positionierbühne eines invertierten Mikroskops.Danach mithilfe einer Vierkanal-Spritzenpumpe komplettes Medium über die Zulauföffnungen in die Kulturgefäße mit einer Flussrate von 20 Mikrolitern pro Stunde abgeben. Das Kulturabfallmedium an den Ablauföffnungen in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln. Die Zellen weitere 16 bis 18 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium in jeder Kammer durch frisches Medium, das mit der geeigneten Konzentration eines Kinaseinhibitors ergänzt wurde, und inkubieren Sie 60 Minuten lang. Schließen Sie dann eine Gleichstromquelle über die Silber-Silberchlorid-Elektroden seriell an den MDF-Chip an. Schließen Sie ein Amperemeter an die elektrische Schaltung an, um den elektrischen Strom im MDF-Chip zu überwachen.Schalten Sie schließlich die Stromversorgung ein und stellen Sie die Spannung auf einen Wert zwischen 15 und 19 Volt ein. Stellen Sie den Strom des Amperemeters auf 86,94 Mikroampere ein. In diesem repräsentativen Experiment mit einem mikrofluidischen MDF-System wurden Lungenkrebszellen mit verschiedenen Konzentrationen des Kinaseninhibitors behandelt.Y 2 7 6 3 2 zeigte keine Veränderungen der Zellwanderungsgeschwindigkeit mit oder ohne elektrische Stimulation. Allerdings verringerte die Behandlung mit Y 2 7 6 3 2 unter Anlegen eines elektrischen Feldes signifikant die Geradlinigkeit der Wanderung der Krebszellen. Tatsächlich unterband der ROCK-Inhibitor bei einer Konzentration von 50 µM die geradlinige Bewegung der Zellen vollständig, ohne deren Migrationsgeschwindigkeit zu beeinflussen.Außerdem bestand eine dosisabhängige Korrelation zwischen den applizierten chemischen Konzentrationen und dem Gerichtetheitsindex, was die Zuverlässigkeit und Effizienz des MDF-Mikrofluidiksystems als Methode zur Untersuchung von Axonen bestätigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in sieben bis acht Stunden abgeschlossen werden, sofern sie nach ihrer Entwicklung ordnungsgemäß durchgeführt wird. Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Elektrophysiologie neue Möglichkeiten, um Nervenfasern in der Haut zu untersuchen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Laserschaber äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Biotechnik

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