Name: Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Lernen Sie eine hocheffiziente Ligation kleiner RNA-Moleküle zur genauen Quantifizierung von MicroRNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht die unvoreingenommene Analyse des gesamten Transkriptoms.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Yi-Labors, insbesondere Zhaojie Zhang, für die fruchtbaren Diskussionen über Linker-Design und Ligarationseffizienz, sowie der American Cancer Society für die Unterstützung dieser Arbeit durch ein Postdoktorandenstipendium (#125209) an J.E.L. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde auch vom National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health unter der Award-Nummer unterstützt R01AR059697 (an R.Y.) und ein Forschungsstipendium des Linda Crnic Institute for Down Syndrome. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

Hinweis: Es ist wichtig, RNase-freien Bedingungen während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten. 1. Adenylierung 3 &#39;Linker <ol><li> Verdünnte DNA-Oligonukleotid 3 &#39;Ligationsreaktionen bis 100 &amp; mgr; M in Nuklease-freiem H 2 O ausgebildet Hinweis: Das Oligonukleotid sollte eine 5&#39;-Phosphatgruppe, eine randomisierte Dinukleotid am 5&#39;-Ende und ein 3&#39;-Didesoxycytosin haben. Die 5&#39;-Phosphatgruppe ist eine Anforderung des Mth Enzym für effiziente 5&#39;Adenylierungs 10. Das Phosphat kann durch Vorbehandlung des Oligonukleotids mit einer Polynucleotid-Kinase mit der Modifikation direkt zugegeben werden, oder geordnet. Die randomisierte Dinukleotid am 5&#39;-Ende ist wichtig für die Minimierung der Sequenz Bevorzugung, die RNA Ligasen weisen bestimmte End-End-Verbindungsreaktionen über andere 6. Das 3&#39;-Didesoxycytosin stellt ein Sperrelement an dem 3&#39;-Ende des Oligonukleotids to hemmen die Bildung von Linker-Linker Concatemeren während der anschließenden Ligationsschritte und auch dazu dient, das 3&#39;-Ende des miRNA-Linker-Molekül am Ende der 3 &#39;ausgebildet Ligationsreaktion 11 blockieren. Die Oligonukleotid-Linker-Sequenz für die unvoreingenommene miR-Seq Methode gewählt ist wie folgt: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> Montieren Sie das folgende Reaktions Adenylierungs: 200 pmol 3&#39;-Linker-Oligonucleotid, 4 ul 10x 5 &#39;DNA Adenylierungs Puffer, 4 &amp; mgr; l 1 mM ATP, 4 &amp; mgr; M-ten RNA-Ligase, Nuklease-freiem H 2 O auf ein Endvolumen von 40 ul. </li><li> Inkubieren Reaktion bei 65 ° C für 1 Stunde. Beenden Reaktion durch Erhitzen auf 85 ° C für 5 min. </li><li> Auszufällen adenylierte Linker durch Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol und 1/3 Volumen von 10 M Ammoniumacetat, um Rest ATP zu entfernen und um unvorhergesehene Ligationen in zukünftigen Reaktionen zu vermeiden. <ol><li> Kurz gesagt, mischen die alkohol, Salz und Oligo-Lösung bis zur Homogenität, Spinnen bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge (~ 15.000 xg) bei 4 ° C für 20 min. Waschen des Pellets in 70% Ethanol, an der Luft trocknen, und resuspendieren in dem entsprechenden Volumen Nuklease-freies H 2 O auf 50-100 uM adenylierte Oligo ergeben. </li></ol></li><li> Adenylierung bestätigen, indem Sie einen 18% Polyacrylamid-Gel. <ol><li> Vorbereitung des Gels durch Vermischen der folgenden zusammen: 6,3 g Harnstoff, 6,75 ml 40% Acrylamid und 1,5 ml 10x TBE. H In 2 O auf 15 ml. </li><li> Mischen, bis der Harnstoff vollständig gelöst und mit 150 ul 10% (w / v) Ammoniumpersulfat (APS) und 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Sobald Gel, Vorlauf für 30 min mit 1x TBE-Laufpuffer bei Raumtemperatur eingestellt, bei 24 V / cm Gel Breite. Nachdem 30 min ist bündig Wells mit Laufpuffer. </li><li> Mischungs 5 ​​pmol der Oligonukleotide mit adenylierte und gleichen Volumen 2x denaturierenden RNA-Ladepuffer (95% (v / v) Formamid,0,02% (w / v) SDS, 0,02% Bromphenolblau (w / v), 0,01% (w / v) Xylencyanol, 1,0 mM EDTA), kurz erhitzen auf 75 ° C und rasten auf Eis gekühlt. Dispense gesamte Probe in die Vertiefung des Gels. Auch eine identische Menge an nicht-adenylierte Kontrolle und niedrige Standards Molekulargewicht Größe. </li><li> Die Elektrophorese bei 24 V / cm, bis das Bromphenolblau auf ¾ der bis zum Boden des Gels. Zerlegen Gerät, post-Fleck-Gel mit 1x SYBR-Gold-Lösung in 1x TBE und visualisieren auf UV-Transilluminator Feld (Abbildung 2). HINWEIS: Gel zur Reinigung des adenylierte oligo in einer ähnlichen Weise wie oben beschrieben, wenn &quot;kein Eingangs RNA&quot; Kontrollen, was zu einer hohen Menge an PCR-Produkt im Vergleich zu Proben, die mit Eingangs RNA. </li></ol></li></ol> 2. Linker-Ligation, um 3&#39;-Ende des miRNA <ol><li> 3 &#39;Die Ligation <ol><li> Montieren Sie folgende Komponenten auf Eis in der aufgeführten Reihenfolge: 1,0 ul 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 &amp;# 956; l 10x RNA-Ligase-Puffer (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT), 1,0 ul adenylierte 3&#39;-Linker (100 &amp; mgr; M), 0,5 ul RNase-Inhibitor, 0,5-8,0 &amp; mgr; g Gesamt-RNA, 0,5 &amp; mgr; l T4-RNA-Ligase 2, Nuklease-freiem H 2 O auf ein Endvolumen von 5 &amp; mgr; l. </li><li> Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren, wenn die Lösung zu viskos, um Wirbel aufgrund der hohen Konzentration von PEG 8000. Nachdem gründlich gemischt, legen die Reaktion in einem Thermocycler mit einem beheizbaren Deckel. Stellen Sie den Block auf 16 ° C, und Inkubation für 4 h. HINWEIS: Die Reaktion kann bis zu einem Endvolumen von 20 &amp; mgr; l ohne Verlust der Ligationseffizienz skaliert werden. Reaktion 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C, um im wesentlichen identische Ligationseffizienz zu erhalten. </li></ol></li><li> Gel Purification <ol><li> Folgende 3 &#39;Ligation, mischen die Reaktion mit einem gleichen Volumen 2x RNA-Ladepuffer. Hitze bis 70 ° C für 5 min, und Schnapp kühl auf Eis. </li&gt; <li> Führen Sie das Beispiel auf einem 15% Polyacrylamid-Gel für PAGE Reinigung. <ol><li> Vorbereiten einer 15% igen Polyacrylamidgel, enthaltend 7 M Harnstoff, in einer Weise ähnlich zu der zuvor in Schritt 1.5 beschrieben. </li><li> Vorlauf das Gel bei 24 V / cm Gel Breite für mindestens 30 min. Schalten Sie Stromversorgung, bündig Brunnen, Lastprobe und Lauf Gel bei gleichen Spannung wie Vorlauf. </li><li> Laden Sie die Probe und führen Sie den PAGE, bis die Bromphenolblau hat gerade das Gel verlassen. Das gewünschte Produkt migrieren wird in der Nähe des Xylencyanol. </li></ol></li></ol></li><li> Färbung, Visualisierung und Excision <ol><li> Zerlegen Sie Gel-Apparatur und Ort Gel in sauberen Tablett mit 1x Laufpuffer (TBE), 1x SYBR-Gold, und Rock für 15 min. </li><li> Entfernen Gel aus Färbeschale und visualisieren auf UV-Transilluminator Box mit sauberen Plastikfolie abgedeckt. Das Ligationsprodukt sollte etwa 45 Nukleotide lang sein. </li><li> Auszuschneiden die Region mit dem Ligationsprodukt mit einem sauberen razor Klinge und in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Produkt Isolierung und Niederschlag <ol><li> Pierce unten von 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 30 G-Nadel und legen Sie die durchbohrten Rohr in einem zweiten sauberen, Low-Retention, 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge 5 min bei ~ 15.000 x g. </li><li> Visuell zu bestätigen, dass die gesamte Gelscheibe hat durch das Loch in der inneren Röhre bewegt. Falls erforderlich, verwenden Sie ein sauberes Pipettenspitze, einige Gelfragmente näher an das Loch zu schieben. </li><li> Entsorgen Sie die leere 0,5-ml-Röhrchen und fügen 400 ul Hochsalzsäulenpuffer (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) an die Acrylamid Gülle. Rockröhre (n) bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Übertragen Aufschlämmung auf einen 0,22 Mikron Zelluloseacetat-Spin-Säule unter Verwendung einer großen Bohrung Pipettenspitze. Zentrifuge für 3 min bei Raumtemperatur bei ~ 15.000 xg, um weg von Acrylamid-Gel-Matrix sammeln alle Flüssigkeit. </li><li> Übertragen Sie die Flüssigkeit auf eine saubere, Low-Retention, 1,5-ml-Röhrchen enthaltening 1 ul 20 mg / ml Glykogen. Hinzufügen eines gleichen Volumens an Isopropanol und 1/10 Volumen Natriumacetat. Mix-Lösung durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals dem Niederschlag in -80 ° C Gefrierschrank für 20 min. </li><li> Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit bei 4 ° C für 20 min, um die Nukleinsäure zu pelletieren. Überstand entfernen und waschen in 70% Ethanol. Luft trocknen Pellet für 10 min bei Raumtemperatur und direkt zum 5 &#39;Ligationsschritt. </li></ol></li></ol> 3. Linker-Ligation zu 5&#39;-Ende der miRNA-3 &#39;Linker Hybrid <ol><li> Zu pelle Nukleinsäure, fügen die folgenden Komponenten: 2 &amp; mgr; l PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ul 10x-RNA-Ligase-Puffer, 0,5 ul ATP (10 mM), 0,5 &amp; mgr; l N, N-RNA-Oligo (100 &amp; mgr; M) und H 2 O auf ein Endvolumen von 4 &amp; mgr; l. HINWEIS: Die Zusammensetzung der &quot;NN-RNA-Oligo&quot; ist wie folgt: 5&#39;-invertierte Didesoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 &#39;und wurde von dem Hersteller über HPLC gereinigt. </li><li> Mischendiese Probe durch Auf- und Abpipettieren wiederholt. Dies für einige Zeit (bis zu 5 min), um zu gewährleisten, dass das Pellet wurde vollständig neu solubilisiert worden. Wenn erneute Solubilisierung ist problematisch, erwärmen die Probe kurz (3-5 min) bis 37 ° C und wieder Pipettieren gemischt. </li><li> Sobald das Pellet wieder in Lösung gebracht, wird der Inhalt in einen sauberen PCR-Röhrchen, enthaltend 1 &amp; mgr; l einer 1: 1 Mischung von RNase-Inhibitor und T4 RNA Ligase 1 (5 Einheiten). Wieder mischen und Abpipettieren. </li><li> Inkubieren der Reaktion in einem Thermocycler bei 37 ° C für 4 Std. Gehen Sie sofort zum cDNA-Synthese. </li></ol> 4. Reverse Transkription / cDNA Synthesis <ol><li> Fügen Sie die folgenden Komponenten in den 5 &#39;Ligation-Reaktion: 2 ul 5x RT-Puffer, 0,75 &amp; mgr; l 100 mM DTT, 1 ul Illumina RT Primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39; (1 &amp; mgr; M) und 0,5 ul dNTPs (10 mM). </li><li> Mischen durch Pipettieren und Wärme auf 65 ° C für 5 min. Dann langsam auf der Bank t abkühlenop. </li><li> Sobald Reaktion auf Raumtemperatur, das Röhrchen auf Eis gekühlt und mit 0,5 &amp; mgr; l jeweils von Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor. Mischen durch Pipettieren und in Thermocycler für die Erweiterung Schritt in den Anweisungen des Herstellers angegeben. </li><li> Sobald vollständige Add 5 ul Nuklease-freies H 2 O, um das Endvolumen der cDNA-Bibliothek bis zu 15 &amp; mgr; l zu bringen. </li></ol> 5. Bibliothek Vorbereitung <ol><li> Zur Indexierung PCR, montieren die folgende Reaktion auf Eis: 6 ul 5x Phusion Puffer, 1 ul dNTPs (10 mM), 0,9 &amp; mgr; l DMSO, 0,75 &amp; mgr; l 5&#39;-Primer (25 uM), 0,75 &amp; mgr; 3 &#39;Primer (25 uM), 3 &amp; mgr; l cDNA-Bibliothek (variabler Konzentration in Abhängigkeit von der Menge der Eingabe), 0,5 ul Phusion Polymerase (1 Einheit), Nuklease-freiem H 2 O auf ein Endvolumen von 30 ul. Wähle die Primer-Sequenzen, um die Kompatibilität mit der Schablone und der Sequenzierungsplattform gewährleistenWahl. <ol><li> Führen Sie die PCR-Reaktion mit den folgenden Einstellungen: anfängliche Denaturierung bei 98 ° C für 3 min, für die ersten 4 Zyklen Denaturierung 98 ° C für 15 sec, Temperung bei 50 ° C für 15 sec, erstrecken sich bei 72 ° C für 15 sec . HINWEIS: Je nach der Menge des Ausgangsmaterials, variieren die Gesamt PCR-Zyklus-Nummern. Typischerweise ist für einen Eingang 1-2 ug Gesamt-RNA, sind insgesamt 13 PCR-Zyklen ausreicht, um die miR-Seq-Bibliothek zu erzeugen. </li><li> Durchführung nachfolgenden Zyklen, beispielsweise Zyklen 5-12, in einem Zwei-Schritt-Weise, wo die Hybridisierung und Verlängerung Zyklen werden vereinigt und bei 70 ° C für 30 sec und der Denaturierung wieder 98 ° C für 15 sec. HINWEIS: Das Reaktionsvolumen beträgt 30 ul Pausieren der PCR-Programm zu ermöglichen, und nehmen Sie die 10 ul Aliquot in vorbestimmten Zykluszahlen für Aussehen des gewünschten Produkts zu überwachen. Typischerweise Zyklen 10, 13 und 16 sind für die Prüfung von einer RNA-Probe ausgewählt. </li></ol></li><li> Vorbereiteneine 8% nicht-denaturierenden Acrylamid-Gel durch Mischen von 2 ml 40% Acrylamid, 1 ml 10x TBE, und H 2 O auf 10 ml. Dann fügen Sie 100 ul 10% APS und 10 ul TEMED. Gießen Gel und lassen Set. <ol><li> Vorlauf das Gel bei 12 V / cm Gel Breite für 30 min. Flush Brunnen. 1 ul 10x-Ladepuffer (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) Bromphenolblau), mit 10 ul Probe in jede Vertiefung der Abmessungen 5 mm x 1 mm x 15 mm. Typischerweise kann jeder Vertiefung bis zu 30 &amp; mgr; l-Proben zu laden. Ausführen des Muster Gel bei 10 V / cm Gel Breite in 1x TBE-Puffer, bis der Bromphenolblau-Farbstoff läuft gerade aus dem Boden des Gels. </li><li> Färben und Visualisieren Gel wie in Schritt 2.3 beschrieben. </li><li> Verbrauchsteuern Das 146 Basenpaar-Band und eluieren über Nacht in 0,25 ml HSCB in einer Weise ähnlich dem, was in Abschnitt 2.4 beschrieben. Auszufällen DNA in einem gleichen Volumen an Isopropanol und 1/10 Volumen Natriumacetat. Wash Pellet in 70% Ethanol und Resuspension in TE-Puffer. </li><li> Quantifizieren Sie die Bibliothek mit PicoGreen nach den Empfehlungen des Herstellers. </li></ol></li></ol>

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<li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li>
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<li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li>
<li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Die hierin beschriebene Methode verwendet mehrere Schlüsselvariablen Ligationseffizienzen, nämlich hohe Konzentrationen an PEG, die Verwendung von randomisierten Linker und hohe Konzentration von Linkern 2,6,9 maximieren. Dieser Ansatz ermöglicht zuverlässig quantitative Sequenzierung Bibliotheken aus Gesamt-RNA-Proben 2. Wir haben mehrere Titrationen von Eingangs RNA durchgeführt und dabei festgestellt, dass die vorangehende Methodik eignet sich am besten für die Gesamt-RNA Mengen in der 1-8 ug Be...

Hochdurchsatz-Sequenzierung basierte Methoden sind weit verbreitet, viele biologische Proben in den letzten Jahren erheblich erweitern unser Verständnis der molekularen Komplexität biologischer Systeme 3,4 angewendet. Allerdings Vorbereitung RNA-Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung oft vermittelt spezifische Vorurteile inhärent angewandten Methode, die Begrenzung der potenziellen Nutzen dieser mächtigen Techniken. Diese Methode bestimmte Vorurteile sind gut für die Ligation-basierten, kleine RNA-Bibliothek Vorbereitungen 1,2,5,6 dokumentiert. Diese Vorspannungen ergeben 1.000-fache Variation liest Nummern äquimolaren synthetische miRNAs, wodurch Inferenz miRNA Fülle von Sequenzdaten wild variable und fehleranfällig. Studien, die sich auf die Eigenschaften des Phagen T4 abgeleitetes RNA Ligasen haben dokumentiert, dass die Enzyme weisen Nucleotid-basierte Präferenzen 7, die als vorgespannte Bibliotheken in Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimenten manifestieren <sup&gt; 1,2,8. Um die Vorspannungen von RNA Ligasen verliehen minimieren, verschiedene Strategien eingesetzt wurden; makromolekulare Verdrängung 9, Randomisierung der Nukleotidsequenz des Adapters, die proximal zu der Ligationsstelle 6 ist, und unter Verwendung hoher Konzentrationen von Ligations Adapter 2. Durch eine Kombination dieser drei Ansätze haben wir einen Arbeitsablauf für unvoreingenommene Herstellung von kleinen RNA-Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung (Abbildung 1) kompatibel entwickelt. Für direkte Vergleiche zwischen aktuellen Protokolle und unser optimiertes Verfahren entnehmen Sie bitte unserem aktuellen Bericht 2 beziehen. Diese optimierte Verfahren ergibt Ligationsgrade von mehr als 95% an beiden 3 &#39;und 5&#39; Schritte und ermöglicht die unvoreingenommene Ligation von kleinen RNA-Molekülen aus synthetischen und biologischen Proben 2.

<table><tbody><tr><td>3' Linker (5' phosphoryliert, 3' blockiert)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>kundenspezifisch</td><td></td></tr><tr><td>5' Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>kundenspezifisch</td><td>5' blockiert, HPLC gereinigt</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Spezialisiert auf die Ligation von präadenylierten DNA-Adaptern</td></tr><tr><td>10x Ligationspuffer (ohne ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>im Lieferumfang von M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligationspuffer (mit ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>im Lieferumfang von M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol (mol. 8.000)</td><td>New England Biolabs</td><td>im Lieferumfang von M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Wir haben festgestellt, dass Wasser, das aus einem Destillationsapparat gewonnen wird, von gleichwertiger Qualität ist.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT Kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequenzinformationen verfügbar von Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequenzinformationen verfügbar von Illumina</td></tr><tr><td>Illumina Index Primer(n)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequenzinformationen verfügbar von Illumina</td></tr><tr><td>40%</td><td>Acrylamid Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylendiamin (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturierender RNA-Ladepuffer</td><td>New England</td><td>Biolabs Inklusive mit M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon Röhrchen</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low Retention Mikrofuge Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylierungskit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

hoch effiziente ligation kleine rna-moleküle für microrna quantifizierung von hochdurchsatz-sequenzierung

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mirna Klonierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung, genannt miR-Seq, steht allein als Transkriptom-weiten Ansatz für miRNAs mit Einzel-Nukleotid-Auflösung zu quantifizieren. Diese Technik nimmt miRNAs durch Anbringen 3 &#39;und 5&#39;-Oligonukleotid-Adapter zu miRNA-Moleküle und können de novo miRNA Entdeckung. Die Kopplung mit leistungsstarken nächsten Generation Sequenzierung Plattformen hat miR-Seq war maßgeblich an der Studie der miRNA Biologie. Allerdings haben erhebliche Verzerrungen durch Oligonukleotid-Ligation Schritte eingeleitet miR-Seq davor als eine genaue Quantifizierung Werkzeug eingesetzt verhindert. Frühere Studien zeigen, dass Vorurteile in aktuellen miR-Seq Methoden oft zu ungenauen miRNA Quantifizierung führen mit Fehlern bis zu 1.000-fach für einige miRNAs 1,2. Um diese Verzerrungen durch RNA-Ligation vermittelt zu lösen, haben wir ein kleines RNA Ligationsverfahren, die in Ligationsgrade von über 95% sowohl in 3 &#39;und 5&#39; Ligationsschritte ergibt entwickelt. Benchmarking diese imbewiesen Bibliothek Bauweise mit äquimolaren oder differentiell gemischten synthetischen miRNAs, konsequent ergibt liest Nummern mit weniger als zweifache Abweichung vom Erwartungswert. Darüber hinaus ermöglicht diese Hocheffizienz miR-Seq Methode genaue genomweiten miRNA Profiling von in vivo Gesamt-RNA-Proben 2.

Die erwarteten Ergebnisse für die vorstehenden Verfahren sollte zunächst Beobachtung einer einzelnen Nukleotid-Verschiebung (Anstieg) in der Größe der DNA-Oligonukleotid, das unter Adenylierung von Mth RNA-Ligase (Abbildung 2). Nach 3 'Ligation, Visualisierung des Acrylamid-Gel zeigt (siehe Abbildung 3) scharfe Gewichtsbändern mit hohem Molekular deutlich in der 100-300 Nukleotidbereich des Gels. Dies zeigt, dass die RNA-Probe verwendet wird ist von hoher Qualität (nicht degrad...

MicroRNAs (miRNAs) sind eine weit verbreitete Klasse von regulatorischen Molekülen. Hier beschreiben wir eine miRNA-Klonierungsmethode, die auf zwei potenten Ligationsschritten beruht, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung. Unsere Methode ermöglicht eine genaue genomweite Quantifizierung von miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, microRNAs unvoreingenommen für die Hochdurchsatzsequenzierung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst DNA-Oligonukleotide hergestellt oder gekauft werden, die für die Ligation an das drei primierende Ende der Mikro-RNA zuständig sind. Der zweite Schritt besteht darin, die drei Prime-DNA-Oligonukleotide an die drei Primzahlen der microRNA zu ligieren.Als nächstes wird das Ligationsprodukt gelgereinigt und der Fünf-Prime-RNA-Oligonukleotid-Linker wird an das Fünf-Prime-Ende der Mikro-RNA ligiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Hybridmoleküle in CDNA umzuwandeln und dann das CDNA durch Polymerase-Kettenreaktion zu amplifizieren. Letztendlich werden die Mikro-RNA-Klonierung und die Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet, um das transkriptomweite Profil von microRNAs quantitativ mit individueller Nukleotidauflösung zu zeigen.Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Mikrosequenzierung und dem Mikrostrahlen-qPCR-Blot besteht darin, dass unsere Technik das tatsächliche Niveau der Mikrostrahlung auf einem transkriptweiten Labormaßstab mit einer Auflösung von nur einem Nukleotid besser widerspieg

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Laser-Capture-Mikrodissektion als effektive Methode zur Isolierung reiner Populationen von Zelltypen aus heterogenem Prostatagewebe für die nachgeschaltete RNA-Analyse zu verwenden.

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Diese Methode beschreibt die hochgradige in vitro-Synthese von sowohl kapptem als auch nicht kapptem mRNA aus einem linearisierten Plasmid, das das Gaussia-Luciferase-Gen (GLuc) enthält. Die RNA wird gereinigt, und ein Teil der nicht kappten RNA wird enzymatisch mit dem Vaccinia-Virus-Capping-Enzym kappt. Im letzten Schritt wird die mRNA in HeLa-Zellen transfiziert, und die Kulturüberstände der Zellen werden auf Luciferase-Aktivität untersucht.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

Lernen Sie eine hocheffiziente Ligation kleiner RNA-Moleküle zur genauen Quantifizierung von MicroRNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht die unvoreingenommene Analyse des gesamten Transkriptoms.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

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