Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, microRNAs unvoreingenommen für die Hochdurchsatzsequenzierung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst DNA-Oligonukleotide hergestellt oder gekauft werden, die für die Ligation an das drei primierende Ende der Mikro-RNA zuständig sind. Der zweite Schritt besteht darin, die drei Prime-DNA-Oligonukleotide an die drei Primzahlen der microRNA zu ligieren.

Als nächstes wird das Ligationsprodukt gelgereinigt und der Fünf-Prime-RNA-Oligonukleotid-Linker wird an das Fünf-Prime-Ende der Mikro-RNA ligiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Hybridmoleküle in CDNA umzuwandeln und dann das CDNA durch Polymerase-Kettenreaktion zu amplifizieren. Letztendlich werden die Mikro-RNA-Klonierung und die Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet, um das transkriptomweite Profil von microRNAs quantitativ mit individueller Nukleotidauflösung zu zeigen.

Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Mikrosequenzierung und dem Mikrostrahlen-qPCR-Blot besteht darin, dass unsere Technik das tatsächliche Niveau der Mikrostrahlung auf einem transkriptweiten Labormaßstab mit einer Auflösung von nur einem Nukleotid besser widerspiegelt. Diese Methode kann nicht nur Einblicke in die microRNA-Biologie geben, sondern auch auf andere Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien wie HC Clip und RNA-Seq angewendet werden. Die DNA-Oligonukleotide für dieses Verfahren sind für drei Primzahl-Ligationsreaktionen ausgelegt und sollten eine Fünf-Prime-Phosphatgruppe, ein randomisiertes Dinukleotid am Fünf-Primzahl-Ende und ein Drei-Prime-Cytosin aufweisen, das die DNA-Oligonukleotide in nukleasefreiem Wasser auf 100 Mikromolar verdünnt.

Durch Kombinieren dieser Reagenzien werden 200 Picomol des drei Prime-Linker-Oligonukleotids, vier Mikroliter des Prime-DNAA-Beatmungspuffers, vier Mikroliter eines TP, vier Mikroliter M-T-H-R-N-A, Ligase und Nuklease-freies Wasser zu einem Endvolumen von 40 Mikrolitern zusammengesetzt. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie sie fünf Minuten lang auf 85 Grad Celsius erhitzen.

Fällen Sie den TED-Linker aus, indem Sie 2,5 Volumen 100% Ethanol und ein Drittel Volumen 10 molare Ammoniumacetate hinzufügen. Um TP-Reste zu entfernen und unvorhergesehene Ligationen in zukünftigen Reaktionen zu vermeiden, mischen Sie den Alkohol, das Salz und die Oligonukleotidlösung bis zur Homogenität, indem Sie sie 20 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius drehen. Waschen Sie das Pellet in 70 % Ethanol, trocknen Sie es an der Luft und resuspendieren Sie das Pellet in der entsprechenden Menge nukleasefreiem Wasser, um 50 bis 100 Mikromolar eines belüfteten Oligonukleotids zu erhalten.

Bestätigen Sie eine Belüftung des Oligonukleotids durch Elektrophorese auf einem 18%igen Polyacrylamid-Gel. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 24 Volt Zentimeter Gelbreite mit einem XTBE-Laufpuffer bei Raumtemperatur vorlaufen. Sobald die 30 Minuten abgelaufen sind, spülen Sie die Vertiefungen mit laufendem Puffer.

Die DNA-Oligonukleotide für dieses Verfahren sind für drei Primzahl-Ligationsreaktionen ausgelegt und sollten eine Fünf-Prime-Phosphatgruppe, ein randomisiertes Dinukleotid am Fünf-Primzahlen-Ende und ein Drei-Prime-Oxytocin aufweisen. Verdünnen Sie die DNA-Oligonukleotide auf 100 Mikromolar in nukleasefreiem Wasser. Lassen Sie das Gel mit 24 Volt pro Zentimeter laufen, bis das Bromphenolblau drei Viertel des Weges zum unteren Rand des Gelstifts erreicht hat.

Färben Sie das Gel mit one x cyber gold solution in one XTBE und visualisieren Sie es auf einer UV-Transluminator-Box. Es sollte eine Einzelnukleotidverschiebung in der Größe des DNA-Oligonukleotids geben, das für die Ligationsreaktion mit M-T-H-R-N-A-Ligase beatmet wurde. Montieren Sie die folgenden Komponenten in dieser Reihenfolge auf Eis.

Ein Mikroliter 50%PEG 8, 000 0,5 Mikroliter 10 XRNA Ligase-Puffer. Ein Mikroliter eines belüfteten Drei-Prime-Linkers, 0,5 Mikroliter RNAs, Inhibitor 0,5 bis acht Mikrogramm Gesamt-RNA, 0,5 Mikroliter T, vier RNA, Ligase zwei und Nukleasefreies Wasser bis zu einem Endvolumen von fünf Mikrolitern. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren, sobald sie gründlich vermischt ist.

Geben Sie die Reaktion in einen Thermocycler mit beheiztem Deckel. Stellen Sie den Block auf 16 Grad Celsius ein und inkubieren Sie ihn vier Stunden lang. Es ist zu beachten, dass die Reaktion auf ein Endvolumen von 20 Mikrolitern hochskaliert werden kann, ohne dass die Ligationseffizienz beeinträchtigt wird.

Nach der Ligation mit drei Primzahlen wird die Reaktion fünf Minuten lang mit einem gleichen Volumen von zwei XRNA-Ladepuffern auf 70 Grad Celsius gemischt und auf Eis abgekühlt. Nächstes Gel. Reinigen Sie die Probe auf einem 15%igen Polyacrylamid-Gel.

Lassen Sie das Gel mindestens 30 Minuten lang bei einer Gelbreite von 24 Volt vorlaufen. Schalten Sie die Stromversorgung aus und spülen Sie die Vertiefungen mit laufendem Puffer. Laden Sie die Probe und lassen Sie das Gel mit der gleichen Spannung wie im Vorlauf laufen, bis das Bromphenol gerade aus dem Gel ausgetreten ist.

Das gewünschte Produkt wird in die Nähe des Xylolcyans wandern, wenn die Elektrophorese des Polyacrylamid-Gels abgeschlossen ist. Lege das Gel für 15 Minuten in eine saubere Schale mit einem x Laufpuffer und einem x Cyber Gold and Rock. Nehmen Sie das Gel aus der Färbeschale und visualisieren Sie es auf einer UV-Transluminatorbox, die mit sauberer Plastikfolie abgedeckt ist.

Das Ligationsprodukt sollte etwa 45 Nukleotide lang sein. Da dieses Ligationsprodukt normalerweise nicht sichtbar ist, ist es wichtig, eine synthetische Positivkontroll-RNA-Probe in die benachbarte Spur mit einer sauberen Rasierklinge exci einzuschließen, die Region, die das Ligationsprodukt enthält. Orientiert an den Positionen der synthetischen RNA-Probe und den Größenstandards.

Geben Sie das Verbrauchsteuergelfragment in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Durchstechen Sie den Boden des 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens mit einer 30-Gauge-Nadel und legen Sie das Einstechröhrchen fünf Minuten lang etwa 15.000 Mal in eine zweite saubere, 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchenzentrifuge mit geringer Retention. G.Bestätigen Sie visuell, dass sich die gesamte Gelscheibe durch das Loch im Schlauch bewegt hat.

Verwenden Sie bei Bedarf eine saubere Pipettenspitze, um einige Gelfragmente näher an das Loch zu schieben. Entsorgen Sie das leere 0,5-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 400 Mikroliter Puffer mit hoher Salzsäule in die Acrylamid-Aufschlämmung. Rocken Sie die Tube am nächsten Tag bei vier Grad Celsius über Nacht.

Übertragen Sie die Aufschlämmung mit einer Zentrifuge mit Pipettenspitze mit breitem Durchgang drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei etwa 15.000 Mal in eine 0,22-Mikron-Celluloseacetat-Spin-Säule. G, um die gesamte Flüssigkeit von der Acrylamid-Gel-Matrix zu entfernen. Übertragen Sie die Flüssigkeit in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Retention, das einen Mikroliter einer Glykogenlösung von 20 Milligramm pro Milliliter enthält.

Fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropanol und ein 10. Volumen Natriumacetat hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. In einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius 20 Minuten fällen. Zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius.

Um die Nukleinsäure zu pelletieren, entfernen Sie die Schlinge und waschen Sie sie in 70%iger Ethanolluft. Trocknen Sie das Pellet 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und fahren Sie direkt mit dem Fünf-Prime-Ligaturschritt fort. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie die folgenden Komponenten zu der zuvor pelletierten Nukleinsäure hinzu: zwei Mikroliter PEG 8, 000 0,5 Mikroliter RNA-Ligase-Puffer, 0,5 Mikroliter eines TP, 0,5 Mikroliter Linker, RNA-Oligonukleotid und Wasser bis zu einem Endvolumen von vier Mikrolitern.

Mischen Sie diese Probe, indem Sie sie bis zu fünf Minuten lang wiederholt auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig wieder löslich ist. Sobald das Pellet in Lösung ist, überführen Sie den Inhalt in ein sauberes PCR-Röhrchen, das einen Mikroliter einer Eins-zu-Eins-Mischung aus RNA-Inhibitor und T-Vier-RNA-Ligase enthält, die durch Auf- und Abpipettieren gemischt wird. Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler bei 37 Grad Celsius für vier Stunden.

Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, fahren Sie sofort mit der CD-NA-Synthese fort, wie im Protokolltext beschrieben, gefolgt von der Linker-Ligation an das drei Prime End der RNA und der Seitenanalyse der Reaktionen. Im Bereich von 100 bis 300 Nukleotiden des Gels sind scharfe Banden mit hohem Molekulargewicht erkennbar, was darauf hindeutet, dass die gesamte verwendete RNA-Probe von hoher Qualität ist. Das sehr helle Signal an der 25-Nukleotid-Region des Gels ist überschüssig unligierte synthetische RNA mit drei Prime-Linkern deutet auf eine Ligation hin, die mit fünf Picomolen synthetischer Mikro-RNA und einem Drei-Prime-Linker durchgeführt wurde, der gelgereinigt wurde.

Hier ist ein Autoradiogramm von drei Prime-Ligationsreaktionen zu sehen, die mit P 32, 5 prime und markierter synthetischer microRNA durchgeführt wurden. Die Anzahl der Stunden, die die Reaktion ablaufen durfte, ist oben angegeben, und die Zahlen unten geben die ligierten Mengen als Prozentsatz der Summe von nicht ligiert und ligiert an. Dieses Autoradiogramm besteht aus fünf Prime-Ligationsreaktionen, die mit P 32, 5 Prime-End-markierter synthetischer Mikro-RNA und drei Prime-Linker-Hybriden durchgeführt wurden.

Die Zahlen am unteren Rand geben die ligierten Mengen als Prozentsatz der Summe aus unligierten und ligierten Mengen an und zeigen, wie wichtig es ist, eine hohe Konzentration von PEG 8.000 small R-N-A-D-N-A zu verwenden. Bibliotheken, die für die Hochdurchsatz-Sequenzierung kompatibel sind, werden anschließend durch PCR erzeugt. Die richtige Anzahl von PCR-Zyklen wird empirisch bestimmt.

In diesem Beispiel beträgt die Größe des erwarteten DNA-Produkts 146 Basenpaare. Einmal gemeistert, kann diese Technik in nur zwei Tagen ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, daran zu denken, alle Spitzen und Röhrchen frei von RNAs zu halten.