Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Erzeugung von Gewebekultursubstraten mit mehreren Mikromuster-PEG-Bürsten, die orthogonale Chemien präsentieren, die eine räumlich präzise und ortsspezifische Immobilisierung biologischer Liganden ermöglichen. Dies wird durch die Abscheidung von Arrays aus Acan Thiol, einem TRP-Initiator, durch einen robotergestützten Mikrokontaktdruck auf goldbeschichteten Substraten erreicht. Als zweiter Schritt SI wird ein TRP auf den Mikromustersubstraten durchgeführt, wodurch PEG-Bürsten mit terminalen Bromgruppen erzeugt werden.

Als nächstes werden die terminalen Bromgruppen mit einer oder zwei chemisch reaktiven Gruppen funktionalisiert, um die IM-Mobilisierung von entsprechend präparierten biologischen Liganden zu ermöglichen. Dann wird der gesamte Prozess wiederholt, um mit einer zweiten chemischen Gruppe zu funktionalisieren. Die Ergebnisse zeigen Microarrays von zwei orthogonal funktionalisierten PEG-Bürsten, die sich mit einer Genauigkeit von 10 Mikrometern überlagern.

Dies wird mit einer speziellen Bildanalysesoftware überprüft, nachdem die reaktiven Gruppen mit fluoreszierenden Molekülen konjugiert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber Methoden wie dem manuellen Mikrokontaktdruck besteht darin, dass der robotergestützte Mikrokontaktdruck in der Lage ist, mehrere Druckschritte mit Mikrometergenauigkeit zu überlagern und gleichzeitig maximale Flexibilität und Substratdesign zu ermöglichen. Die Genauigkeit, die diese Methode in Verbindung mit sequentiellen nukleophilen Substitutionsreaktionen bietet, ermöglicht es uns, Gewebekultursubstrate zu erzeugen, die mit mehreren biologischen Liganden funktionalisiert sind, die dann in der Lage sind, eine zeitliche und räumliche Kontrolle von Sulfat auf der Mikrometerskala auszuüben.

Vor S-I-A-T-R-P sollte ein goldbeschichtetes Deckglas mit dem A-P-D-M-S-Stempel gemustert worden sein. Dieses relativ gebräuchliche Vorgehen wird in einem Textprotokoll erklärt. Beginnen Sie damit, den Patentabdeckschieber vom Roboter zu entfernen, indem Sie das Vakuum loslassen.

Füllen Sie es dann in einen 50-Milliliter-Kolben mit der Länge sch, verschließen Sie den Kolben und wenden Sie ein negatives Vakuum von 30 PSI an. Als nächstes werden 5,5 Milliliter A TRP-Reaktionsgemisch mit einer Spritze in den Kolben gegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,5 Millilitern L-Natriumascorbat in Wasser, ebenfalls über eine Spritze. Beobachten Sie, wie die Reaktion ihre Farbe von hellgrün zu dunkelbraun ändert.

Lassen Sie die Reaktion 16 Stunden lang unter Inertgas weiterlaufen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie den Abdeckschieber und spülen Sie ihn mit Ethanol, dann mit Wasser und dann wieder mit Ethanol ab. Anschließend sanft mit Stickstoff trocknen.

Der Microarray aus transplantierten P-E-G-M-E-M-A-Pinseln sollte mit bloßem Auge sichtbar sein. Verwenden Sie die Mikroskopie, um diese Veränderungen im Detail zu zeigen, um Azad zu funktionalisieren, die P-E-G-M-E-M-A-Ketten. Übertragen Sie den Objektträger auf ein 20-Milliliter-Reaktionsgefäß aus Glas und fügen Sie sechs Milliliter DMF mit 100 millimolaren Natriumazid hinzu.

Lassen Sie die Reaktion 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius laufen. Spülen Sie am nächsten Tag den Patentdeckel mit Ethanol und trocknen Sie ihn unter einem sanften Stickstoffstrom, um die restlichen Brom-funktionalisierten P-E-G-M-E-M-A-Ketten zu beruhigen. Übertragen Sie den Objektträger des Mikromusters in ein 20-Milliliter-Reaktionsgefäß aus Glas und fügen Sie sechs Milliliter DMSO hinzu, das 100 millimolare Ethanolamine und 300 millimolare Triethylamine enthält.

Lassen Sie diese Reaktion am nächsten Tag 24 Stunden lang bei 40 Grad Celsius ablaufen. Spülen Sie den Objektträger mit Ethanol ab und trocknen Sie ihn vorsichtig unter einem Stickstoffstrahl. Der nächste Schritt besteht darin, den Mikrokontaktdruck des Roboters mit einem zweiten PDMS-Stempel und dem anschließenden Stempeln zu wiederholen.

Verwenden Sie erneut SI A TRP, um den zweiten Micro-Array-PEG-Pinsel grafisch darzustellen. Dann ist es an der Zeit, die zweite Microarray-P-E-G-M-E-A-Kette François mit Acetylen zu funktionalisieren. Das Micro-Pattern-Cover.

In ein 20-Milliliter-Reaktionsfläschchen aus Glas mit sechs Millilitern 100 Millimol-Propagagin in DMF schieben. Lassen Sie die Reaktion 24 Stunden lang ablaufen. Am nächsten Tag bei Raumtemperatur den Objektträger mit Ethanol abspülen und unter einem sanften Stickstoffstrahl trocknen.

Der Patent-Deckfolien ist dann bereit für die Biotin-Hochstimmung. Beginnen Sie damit, den Objektträger aus Mikropatent in ein 20-Milliliter-Reaktionsgefäß aus Glas zu legen. Zuerst fraß Biotin die Acetylen-terminierten Ketten.

Geben Sie sechs Milliliter Kupfersulfat mit dem Azid-PEG Vier-Biotin-Konjugat in das Reaktionsgefäß, gefolgt von 1,2 Millilitern mit 0,15. Millimolare rbinare Säure in Wasser, um die Reaktion zu initialisieren, blasen Sie die Reaktion 10 Sekunden lang mit Stickstoff. Verschließen Sie dann das Fläschchen mit Paraform und lassen Sie die Reaktion 24 Stunden lang laufen.

Spülen Sie den Abdeckschieber am nächsten Tag bei Raumtemperatur mit Wasser ab und geben Sie ihn in eine 12-Brunnen-Styroporschüssel. Dann bei Raumtemperatur bei DPBS mit Eselsserum für eine Stunde eine Stunde später, Färbung in den Biotin elierten Gruppen mit Streptokokken DEIN 5 46 Konjugat bei zwei Mikrogramm pro Milliliter in DPBS Färbung für zwei Stunden bei Raumtemperatur zwei Stunden später. Spülen Sie das Objektträger fünfmal mit sanftem Bewuchs in DPBS ab.

Tobi ITIN aate die azi terminierten Ketten. Legen Sie den Deckglas in eine Vertiefung aus einer Polystyrolplatte mit sechs Vertiefungen und tragen Sie zwei Milliliter DPBS auf, die 20 mikromolare D-B-C-O-P-G-vier Biotin enthalten. Dann inkubieren Sie das Objektträger 24 Stunden später 24 Stunden lang bei Raumtemperatur.

Spülen Sie den Objektträger wie zuvor vier aus und färben Sie ihn mit Streptavidin 4 88 ein. Konjugieren Sie bei zwei Mikrogramm pro Milliliter in DPBS. Zwei Stunden später.

Spülen Sie das Objektträger erneut ab und bilden Sie es dann mit dem Mikroskop ab. Mit diesem Roboter-Mikrokontakt-Druckprotokoll. Ein genau gemustertes Array von PEG-Bürsten-ANN-UI mit terminalen Alkin-Gruppen wurde innerhalb eines separaten Arrays größerer PEG-Bürsten-ANN-UI mit terminalen Azi-Gruppen gemustert.

Die räumliche Verteilung der Azid- und Alkingruppen wurde mit Hilfe der Click-Chemie und der Streptavidin-Bindung von Fluoreszenzsonden betrachtet. Eine Überlagerung beider Leuchtstoffkanäle zeigt, dass sich die Stempel nicht überlappen. Die Genauigkeit der Ausrichtung wurde mit unter 10 Mikrometern berechnet, was an den Grenzen des SCAR liegt.

Ein System, das zum Drucken verwendet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mithilfe des robotergestützten Mikrokontaktdrucks benutzerdefinierte Gewebekultursubstrate generieren können, um mehrere Stiftbürstenarrays zu überlagern. Funktionalisiert mit orthogonalen Chemien.