Name: Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung komplexer Kultursubstrate mittels robotischem Mikrokontaktdrucken und sequentieller Nukrophiler Substitution. Diese Methode ermöglicht die präzise Immobilisierung biologischer Liganden für Tissue-Engineering-Anwendungen.

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Die Finanzierung für diese Arbeit, GTK, TK und JDM wurden vom Wisconsin Institute for Discovery und der Wisconsin Alumni Research Foundation bereitgestellt.

1. Gene Elastomere Briefmarken <ol style="margin-left: 40px;"><li> Um Silizium Meister der PDMS-Stempel zu erzeugen, Design-Merkmal-Muster der Photomaske ist mit Computer-Aided-Design-Software. <ol><li> Gestalten Sie das erste Muster als 20 x 20 Anordnung von Kreisringen mit 300 &amp; mgr; m Innendurchmesser (ID) und 600 &amp; mgr; m OD mit 1200 &amp; mgr; m von Mitte zu Mitte-Abstand. </li><li> Gestalten Sie das zweite Muster als 20 x 20 Anordnung von Kreisringen mit 600 um ID und 900 &amp; mgr; m OD mit 1200 &amp; mgr; m von Mitte zu Mitte-Abstand. </li><li> Zusätzlich legen 1 x 1 mm 2 Quadratreferenzmarken an allen vier Ecken jedes Array-Design Abstand 1.200 &amp; mgr; m von Mitte zu Mitte von der Ecke Muster in einem 45 ° -Winkel. </li><li> Fabrizieren die Silizium-Master für die Verwendung in diesem Experiment mit 1: 1-Seitenverhältnisse, in Korrelation zu einem 300 um Feature Tiefe mit Standardlithographietechniken anderswo 15 oder in Zusammenarbeit mit einem mikrofluidischen Gießerei detailliert. HINWEIS: Feature Tiefen von weniger als 100 &amp; mgr; m können zu abnorm Verformung Briefmarken vor mit Substratoberflächen kontaktieren führen. HINWEIS: Dieses Protokoll beginnt mit mit bereits erhaltenen Silizium-Master mit den beschriebenen Muster aus Fotolack, die Spezialausrüstung und saubere Zimmer zu schaffen erfordert. Am besten ist es mit einem Verarbeiter oder Core Facility, diese strukturiert Master-Dokumente erstellen zu konsultieren. </li></ol></li><li> Silanisieren Silizium Meister O / N durch Inkubation mit (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydroocty) Trichlorsilan Dampf. HINWEIS: Silandampf ist sehr giftig und sollte nur in einer chemischen Abzugshaube gehandhabt werden. </li><li> Erstellen inverse Repliken der Silizium Meister durch Härten einer 10: 1-Verhältnis von PDMS-Prepolymer und PDMS Härter auf der Oberseite der silanisierten Silizium Meister in einer Petrischale O / N bei 60 ° C. </li><li> Entfernen Sie die PDMS-Stempel aus den Silizium Meister und binden die Briefmarken zu Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) Träger oder einer anderen starren Materials unter Verwendung von Klebstoff. HINWEIS: Das Material der Wahl nicht transparent oder biokompatibel sein. Es muss jedoch eine flache Oberfläche für die Schnittstelle mit der Roboterwerkzeuge und höhere Steifigkeit als PDMS bereitzustellen. </li></ol> 2. Vorbereiten Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Spülen Mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) in Toluol, Methanol und beschallen in Aceton für 1 Minute vor dem Spülen mit Ethanol und Trocknen unter einem leichten Stickstoffstrom. Hinweis: Behandeln Toluol und Aceton nur in einer chemischen Abzugshaube. </li><li> Mantel coverslides mit ~ 3,5 nm Titan (Ti), gefolgt von 18,0 nm Gold (Au) mit einem fokussierten Elektronenstrahl-Verdampfers. Hinweis: Dieses Verfahren ist mit einer Vielzahl von mit Gold beschichteten Substraten, einschließlich Silicium und Polystyrol kompatibel. Während es möglich ist, diese vor Ort zu erzeugen, sind ebenfalls mit Gold beschichteten Substrate über kommerzielle Lieferanten erhältlich. HINWEIS: Ti-Schichten sollte mindestens 3 nm dick sein, während Au-Schichten auf Substraten sollte eint mindestens 5 nm dick und kann den ganzen Weg in der Dicke in Abhängigkeit von den idealen optischen Eigenschaften des fertigen Substrats 16,17 1mm liegen. Substrate sind nicht erforderlich für die Herstellung optisch klar zu sein; jedoch ermöglicht sie mikroskopische Analyse hergestellt Substraten. </li><li> Spülen Sie goldbeschichteten coverslides mit Ethanol und trocken unter leichtem Stickstoff unmittelbar vor der Verwendung. </li></ol> 3. R-mCP der Außenring <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bevor R-mCP mit der selektiv kompatible Knickarmroboter (SCARA) System, kalibrieren Sie die Roboterwerkzeug Effektoren und begleitenden Dual-Kamera-Systeme mit der Software des Systems. ANMERKUNG: Diese Werkzeuge sind in Figur 1 dargestellt. </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg"> Abbildung 1. R- mCP System und Robotic Arm Tooling. (A) Großansicht des R-mCP System mit allen Werkzeuge und Vorrichtungen (a) Vakuumspann, (b) Reagenz Bad, (c) nach unten gerichtete Kamera, (d) Stempel Verschachtelung Halterung, (e) Roboter Werkzeug. (B) Robotic arm tooling Darstellung (f) Diamant Ätzanlage und (g) pneumatische Saugwerkzeug hält eine (h) ABS-Backed PDMS-Stempel. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Manuell legen Sie eine PDMS-Stempel mit 600 um ID und 900 &amp; mgr; m OD vorstehende Ringe nach unten im Stempel Verschachtelung Befestigung. Hand legen eine frisch gereinigte Gold beschichteten Deckglas auf der Oberseite der Vakuumspannvorrichtung, in Figur 1A dargestellt, und zu immobilisieren sie mit dem verbundenen Laborvakuum. </li><li> Mit den Robotersteuerungen, richten Sie den nach unten weisenden Kamera über dem Mittelpunkt des goldbeschichteten Deckglas, wie in 2A. HINWEIS: Dieser Punkt kann anfänglich visuell definiert werden und erfordert keine große Genauigkeit, wie der PDMS-Stempel ist viel largER als die goldbeschichteten Folie. </li><li> Weisen den Roboterarm zu vier Referenz ätzen "X" Markierungen an den Ecken eines Quadrats mit den Maßen 3,8 mm · 3,8 mm auf der Gold beschichteten Deckglas mit der Diamant Ätzanlage zum Roboterarm befestigt zentriert. (In 2B Dargestellt; automatisierten Prozess) HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, alle vier Referenzmarken sind innerhalb einer visuellen Rahmen der nach unten weisenden Kamera. </li><li> Mit den Robotern pneumatische Absaugung Tooling, Abholung und halten die PDMS-Stempel 1 mm über der Stempel Verschachtelung Halterung wie in 2C. (Automatisierten Prozess) </li><li> Mit dem nach oben zeigenden Kamera und LED-Beleuchtungsring in 2D und E abgebildet, visualisieren quadratischen Referenzmarken des Stempels und ihnen mit der Kamera-Software zu identifizieren 10 mal um durchschnittlich X des Stempels, Y zu bestimmen und von der Mitte der Winkelversatz Roboter Werkzeugachse. (Automatisierten Prozess) </li><li> Wie in <strong verwenden sie den unten gerichtete kamera zu visualisieren und erkennen ge referenzmarken der deckglas des durchschnittlichen x das ist y-center-standorte winkelversatz von mitte roboters werkzeugachse bestimmen. prozess> HINWEIS: Eine interne Berechnung wird von der Software des Robotersystems durchgeführt, um genau auszurichten der Stempel und Deckglas der X, Y-Center-Standorte und Winkelverschiebungen in künftige R-mCP Schritte. </li><li> 3.8) Den Stempel in ein Bad aus Alkanthiol ATRP Initiators, ω-mercaptoundecyl bromisobutyrat (2 mM in Ethanol), wie in Abbildung 2F dargestellt. (Automatisierten Prozess) </li><li> Entfernen Sie den Stempel aus der Alkanthiol-Lösung und legen Sie es über Stickstoffstrom auf 0,48 bar (5 psi) unter Druck gesetzt, um das Ethanol wie in 2G verdampfen. Nach 1 min erhöht der Stickstoffstrom Druck auf 1,03 bar (15 psi) zu einheitlichen Trockenheit zu gewährleisten. (Automatisierten Prozess) HINWEIS: Unvollständige Trocknung wird in vollständigen oder teilweisen Verlust der Mustertreue führen. </li><li> Nach dem Trocknen bewegen der Stempel über die berechnete Mittelstellung des Gold-beschichteten Objektträger und senken es bei 100 &amp; mgr; m-Schritten während der Überwachung Z-Achsen-Motorkraft, wie in Figur 2H dargestellt. ANMERKUNG: Diese wird als Drehmoment von der Z-Achsen-Motor erfahren und in die Roboterführung Software angezeigt kommuniziert. (Automatisierten Prozess) </li><li> Stop Absenken der Stempel einmal der vorbestimmte Druck von 79,2 kPa erreicht worden ist, und der Kontakt mit dem Gold-beschichteten Objektträger für 15 Sekunden zu halten. (Automatisierten Prozess) HINWEIS: Die Druckwerte werden hier für den aktuellen Stempel Design und Funktion Höhe optimiert. Wenn der Briefmarkenentwurf ist von einem Versuch und Irrtum-Prozess verändert, speziell für hohe Seitenverhältnis Briefmarken, tune diese entsprechend. </li><li> Entfernen Sie langsam den Stempel aus dem goldbeschichteten Objektträger und setzen Sie den Stempel wieder in die Stempel Verschachtelung Befestigung. (Automatisierten Prozess) </li></ol> 4. SI-ATRP von PEGMEMA auf mikrostrukturierten Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lassen Unterdruck hält die mikroDeckGlas, und überträgt es auf einen 50-ml-Schlenk-Kolben. Seal und entgast Schlenkkolben mit einer Vakuumpumpe. </li><li> Hinzufügen von 5,5 ml ATRP Reaktionsmischung, die das Makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), Wasser (34,4 ml), Methanol (43,8 ml), Kupfer (II) -bromid (1 mmol) und 2 ', 2-Bipyridin (3 mmol) an die Schlenk-Kolben. </li><li> 0,5 ml der L-Natriumascorbat (454,3 mM) in Wasser, um die Reaktion zu starten, und lassen Sie sie 16 Stunden lang bei RT unter Schutzgas fortzusetzen. HINWEIS: Nach der Zugabe von L-Natriumascorbat, wird Reaktionsfarbe von hellgrün bis dunkelbraun zu verschieben, wie in 3A-B gezeigt. HINWEIS: Die Reaktion kann über 16 Stunden weiter, aber es wird die Länge der PEG Bürsten nicht wesentlich erhöhen. </li></ol><imgalt src='"/' files ftp_upload></imgalt> Abbildung 3. Einleitung SI-ATRP. (A) Einleitung der Reaktion und (B) anschließende Farbänderung nach Zugabe von L-Natriumascorbat. (C) Mikroskopische Aufnahme von mikroDeckGlas Oberfläche folgenden SI-ATRP Verfahren. Maßstabsleiste 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Schenk-Kolben und spülen mit Ethanol, Wasser und Ethanol und trocken unter einem leichten Stickstoffstrom. HINWEIS: Nach SI-ATRP, sollten Oberflächenmodifikationen für das Auge sichtbar sein und kann, wie in 3C abgebildet und unter einem Mikroskop untersucht werden. Anmerkung: Dies ist die einfachste Methode, um die Genauigkeit der Test testen, wie es entfällt die Notwendigkeit, die Substrate Immunfärbung. </li></ol> 5. Azid Funktionalisierung von mikrostrukturierten PEGMEMA Chains <ol style="margin-left: 40px;"><li> Legen Sie die mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche. </li><li> 6 ml N, N-Dimethylformamid (DMF), enthaltend 100 mM Natriumazid in die Reaktionsflasche. Pflegen diese Reaktion bei 37 ° C für 24 Stunden. Hinweis: Behandeln DMF nur in einer chemischen Abzugshaube. Vorsicht beim Abwiegen Natriumazid. </li><li> Nach Abschluss entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß und spülen mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom. </li></ol> 6. Passivierung von Brom Funktionalisierte PEGMEMA Chains <ol style="margin-left: 40px;"><li> Zeigen mikrostrukturiert Deckglas in 20 ml Glasreaktionsgefäße. </li><li> 6 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), die 100 mM Ethanolamin und 300 mM Triethylamin zu der Reaktionsflasche. Halten diese Reaktion bei 40 ° C für 24 Stunden. Hinweis: Behandeln DMSO, Ethanolamin und Triethylamin nur in einer chemischen Abzugshaube. </li><li> Nach Abschluss entfernen Sie die mikro coverslide aus dem Reaktionsgefäß gründlich mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom. </li></ol> 7. R-mCP der Innenring und SI-ATRP von PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Durchführung R-mCP Schritte wie zuvor in den Schritten 3.2 und 3.6 - 3.12, Substitution eines PDMS-Stempel mit 300 um ID und 600 um Außendurchmesser vorstehenden Ringräume, so dass die Ringräume mit kleineren Merkmale sind in den zuvor mikrostrukturiert Ringräume angeordnet. HINWEIS: Die Druckschwelle für diese Briefmarke ist 132,0 kPa. Wie bereits erwähnt, werden diese Druckeinstellungen für wobei die Stempelfunktionen in diesem Experiment verwendet optimiert. </li><li> Führen Sie SI-ATRP Schritte wie zuvor in den Schritten 4.1 beschrieben - 4.4. </li></ol> 8. Acetylen Funktionalisierung von mikrostrukturierten PEGMEMA Chains <ol style="margin-left: 40px;"><li> Zeigen mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche. </li><li> 6 ml DMSO, enthaltend 100 mMPropargylamin in die Reaktionsflasche. Halten Sie diese Reaktion bei RT für 24 h. Hinweis: Behandeln DMSO und Propargylamin nur in einer chemischen Abzugshaube. </li><li> Nach Abschluss entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß und spülen mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom. </li></ol> 9. Kupferkatalysierte "Click" Biotinylierung von Acetylen Abgebrochene PEGMEMA Chains <ol style="margin-left: 40px;"><li> Zeigen mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche. </li><li> 6 ml Kupfersulfat (15 mM) / Tris [(1-Benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v Wasser / DMF) enthalten 562 uM Azid-PEG 4 -Biotin Konjugat in die Reaktionsflasche. Mit 1,2 ml L-Ascorbinsäure (0,15 mM) in Wasser zu der Mischung, um die Reaktion zu initialisieren. </li><li> Bubble Stickstoff durch die Reaktionslösung für 10 sec, versiegeln die Phiole mit Parafilm und für 24 h bei RT reagieren. </li><li> Nach completion entfernen mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß, mit Wasser abspülen und legen Sie sie in einem 12-Well-Polystyrolschale. </li></ol> 10. Immunfluoreszenz-Nachweis von biotinylierter Acetylengruppen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Block mikroDeckGlas in DPBS (3% Eselserum) 1 h bei RT. Färbung für biotinylierte Acetylengruppen mit Streptavidin-546-Konjugat (2 ug / ml) in DBP (3% Eselserum in PBS) für 2 h bei RT. </li><li> Spülen mit Mikrodeckglas 5 mal mit DPBS für 10 min unter leichtem Schütteln. ANMERKUNG: Abbildung 4B zeigt ein Bild der Folie, nach dieser Schritt abgeschlossen ist. </li></ol> 11. Kupferfreie "Click" Biotinylierung von Azid Abgebrochene PEGMEMA Chains HINWEIS: Wenn gewünscht, kann dieses Substrat Modifikationsschritt in situ während der Zellkultur durchgeführt werden. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lassen mikroDeckGlas in 12-Well-polystyrene Gericht folgenden DBPs spült. </li><li> 2 ml DBP (oder Zellkulturmedium), enthaltend 20 &amp; mgr; M-PEG DBCO 4 Biotin und lassen diese Reaktion für 24 h bei RT weiter (oder bei 37 ° C in einem Brutschrank). </li><li> Nach Abschluss gründlich mikroDeckGlas 5 mal mit DPBS (oder einfach führen Sie einen Medienwechsel). </li></ol> 12. Immunfluoreszenz-Nachweis von biotinylierter Azidgruppen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Färbung für biotinylierte Azidgruppen mit Streptavidin-488-Konjugat (2 ug / ml) in 2 ml DPBS (3% Eselserum) für 2 h bei RT. </li><li> Spülen mit Mikrodeckglas 5 mal in DPBS für 10 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Bildmikrodeckglas mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskops. 4A-C zeigt Bilder der Folie, nach diesem Schritt abgeschlossen. HINWEIS: Bei der Verwendung von Substraten für die Gewebekultur-Assays, überspringen Abschnitte 10 und 12 dieses Protokolls. Nach der gewünschten degree Funktionalisierungsgrad sterilisieren entworfen Deckglas durch Spülen beide Seiten mit 100% Ethanol und Trocknen unter einem Stickstoffstrom. Die Objektträger in einer sterilen Sicherheitswerkbank und spülen Sie die Objektträger mit PBS fünfmal, bevor mit Zellaussaat und Kultur voran. </li></ol>

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<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Ideale Substrate für das Tissue Engineering Bioinspiriertes würde und dadurch die räumliche Verteilung der kritischen bioaktiven Liganden innerhalb der nativen Geweben zu rekapitulieren. Sie würden auch dynamische Eigenschaften besitzen, die zeitliche Änderungen der Liganden und die räumlichen Muster in der sie präsentiert gerichtet Morphogenese ermöglichen und räumlich begrenzte Induktion von Zellschicksal zu ermöglichen. Herstellung solcher Substrate erfordert die Immobilisierung von mehreren biochemischen Signale in ...

Die Fähigkeit von PEG-gepfropften Oberflächen kovalent gebunden biochemischen Liganden angezeigt während gleichzeitig inhärente Nicht-Fouling-Eigenschaften machen sie zu einer idealen Wahl für Engineering individuelle Mikroumgebungen auf Kultursubstraten 1,2,3. Die biospezifische Wechselwirkungen von Liganden konjugiert PEG vermittelte Bürsten ermöglicht reductionistic Analyse der Wirkungen von biochemischen Hinweisen im Komplex in vivo Gewebemikroumgebung über einzelne Zell Phänotypen gefunden. Weiterhin kann bio-orthogonal &quot;auf&quot; Chemie verwendet werden, um Richt Immobilisierung von Liganden zu erleichtern, so dass sie im nativen Konformationen 4-6 dargestellt werden. So mikroskaligen räumlichen Strukturierung von PEG Bürsten ist ein vielseitiges Werkzeug, um Designer in vitro Nischen schaffen, um Zellsignalisierung durch immobilisierte biochemischen Cues 6,7 induzierte untersuchen. Ein übliches Verfahren zur Erzeugung von räumlichen Mustern der biochemischen cues bringt Mikrokontakt-Drucken (mCP) gold-beschichteten Substrate mit Mustern von PEG konjugierten Alkanthiole. Dann werden die mikroselbstorganisierte Monoschichten (SAMs) von PEG-ylated Alkanthiole schränkt die physikalische Adsorption von biochemischen Molekülen, zB Proteine, nur für die nicht gemusterten Bereiche des Substrats 8,9. , Die durch diese Technik erzeugt SAMs sind jedoch empfindlich gegenüber Oxidation in der Langzeitzellkulturmedien. Somit μCP&#39;d Alkanthiol SAMs häufig weiter mit PEG Polymerbürsten mit oberflächeninitiierte Atom Transfer Radical Polymerisation (ATRP-SI), um die Region nicht-Fouling-Stabilität 10 zu erhöhen gepfropft. Insbesondere mCP der Alkanthiol Polymerisationsinitiator erzeugt ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, auf Gold-beschichteten Oberflächen, gefolgt von SI-ATRP von Poly (ethylenglycol) methylethermethacrylat (PEGMEMA) Monomere Oberflächen mikro langfristig stabil und nicht Fouling PEG Bürsten. Darüber hinaus sind diese<html> sind in der Lage, die weiter modifiziert, um diverse chemische Einheiten 11 zu präsentieren. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft, Sha et. al. eine Methode entwickelt, um Kultursubstrate mit Mehrkomponenten PEGMEMA Bürsten präsentiert orthogonal &quot;auf&quot; Chemie-Ingenieur. Bei diesem Verfahren verwendet man eine Reihe von &amp; mgr; CP / SI-ATRP Schritten mit sequentieller Natriumazid, Ethanolamin vermischt und Propargylamin nucleophile Substitutionen Kultursubstrate präsentiert Mikromuster mehrere immobilisierte Liganden 6 zu erstellen. Während das Potential der Verwendung solcher Chemikalien in Verbindung mit manuellen mgr; CP neue Kultursubstrate Ingenieur ist immens, es wird von der Präzision und Genauigkeit, mit welcher mehrere &amp; mgr; CP Schritte können auf einem einzigen Substrat ausgerichtet werden, beschränkt. Ein hohes Maß an Präzision und Genauigkeit erforderlich wäre, um reproduzierbar herzustellen Komplex in vitro Nischen mit diesen vielseitigen Techniken werden. e_content &quot;&gt; Um diese Einschränkung zu begegnen, haben mehrere automatisierte und halbautomatisierte mCP Systemen erzeugt wurden. Chakra et. al. eine mCP System, in dem kundenspezifische Stempel sind auf einem Schienensystem platziert und mit Gold-beschichtete Objektträger mit in konformen Kontakt gebracht entwickelt ein computergesteuertes pneumatisches Stellglied. Allerdings erfordert dieses Verfahren die präzise Herstellung von kundenspezifischen Stempel entwickelt und berichtet über eine Präzisions 10 um ohne Bericht der erreicht wird, wenn die Durchführung mehrerer Schritte 12 &amp; mgr; CP Genauigkeit. Vor kurzem wurde ein Verfahren unter Verwendung eines integrierten kinematischen Kopplungssystem berichteten Genauigkeit unterhalb von 1 um unter Verwendung eines einzigen Musters, waren aber nicht in der Lage, mehrere Muster genau auszurichten aufgrund des Fehlens einer präzisen Steuerung der Stempelfunktionen von Form zu Form 13. Zusätzlich beiden vorhergehenden Verfahren erfordern das Substrat zwischen den Strukturierungsschritten fest bleiben und damit deutlich die Vielfalt der Oberflächenmodifizierung Chemie, die sein kann, begrenztverwendet. Hier beschreiben wir eine automatisierte R-mCP System in der Lage genau und präzise Ausrichtung mehrerer mCP Schritte und ermöglicht maximale Flexibilität bei der Briefmarkenentwurf und Fertigung. Weiterhin können die gemusterten Substraten wiederholt aus dem System zwischen Stanz entfernt werden, wodurch die Verwendung von verschiedenen Substratmodifikation Chemien, einschließlich sequentieller nucleophile Substitutionen erlaubt. Substrate entwickelt unter Verwendung solcher Chemikalien wurden für Zellkultur zuvor sowohl von uns 6,14 und andere 7 verwendet. So haben wir R-mgr; CP und sequenzielle nukleophile Substitutionsreaktionen zusammengeführt, um ein Verfahren zur Herstellung von skalierbaren Kultursubstrate mit komplexen biochemischen und mikro Signale zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>SCARA&nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Auf Wunsch sind höherwertige Modelle mit erhöhter Präzision erhältlich.</td></tr><tr><td>(Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorsilan</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>VORSICHT, Sollte nur in einem chemischen Abzug gehandhabt werden. Bei der Silanisierung von Wafern sollte niemand die Haube betreten, bis das gesamte Silan verdampft ist.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Entgasen Sie Lösungen vor der Verwendung gründlich durch Vakuumbelichtung. Alternative Kits wie Kit 182 sind akzeptabel.</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm #1 Deckglas-Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>Diese können von einer Reihe von Anbietern mit unterschiedlichen Abmessungen erworben werden, um den Anforderungen gerecht zu werden.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Elektronenstrahlverdampfer</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Erfordert eine spezielle Schulung.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST&</td><td></td></tr><tr><td>omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrat</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Bei -20 μC lagern. Andere ATRP-Initiatoren können als diese R-& mu verwendet werden. Die CP-Plattform ist auf alle Mikrostrukturierungsmodalitäten anwendbar.</td></tr><tr><td>Schlenk Tube Flask 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Benötigt Gummistopfen mit Membran.</td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol)-methylethermethacrylat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Versand mit MEHQ- und BHT-freien readical-Inhibitoren.</td></tr><tr><td>Methanol (ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>VORSICHT, nur in chemischem Abzug handhaben.</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-bromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>VORSICHT, begrenzen Sie die Exposition mit chirurgischer Maske.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipyridin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>VORSICHT, Exposition mit chirurgischer Maske begrenzen.</td></tr><tr><td>Natrium-L-Ascorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Szintillationsfläschchen aus Borosilikatglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>VORSICHT, Begrenzen Sie die Exposition mit chirurgischer Maske.</td></tr><tr><td>N,N-Dimethyformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>VORSICHT, nur in chemischem Abzug handhaben.</td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>VORSICHT, nur im chemischen Abzug handhaben.</td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>VORSICHT, nur im chemischen Abzug handhaben.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>VORSICHT, nur in chemischem Abzug handhaben.</td></tr><tr><td>Propargylamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>VORSICHT, nur im chemischen Abzug handhaben.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Material Distribution Services</td><td>2292</td><td>VORSICHT, nur in chemischem Abzug handhaben.</td></tr><tr><td>Azid-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilisiert in DMF</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>VORSICHT, Exposition mit chirurgischer Maske begrenzen.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Mit Eselserum kontaminierte Gegenstände gelten als biologisch gefährliches Material und sollten entsprechend entsorgt werden. Verschiedene andere Verbindungen (z.B. BSA) stehen zur Verfügung und dienen diesem Zweck.</td></tr><tr><td>12-Well-Polystyrolplatte</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Platten können von einer Reihe von Lieferanten mit unterschiedlichen Abmessungen erworben werden.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotin</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilisiert in DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilisiert in PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 546 Konjugat</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilisiert in PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>Ein Epifluoreszenzmikroskop reicht aus, um funktionalisierte mikrostrukturierte Substrate abzubilden.</td></tr></tbody></table>

herstellung von komplexen kultursubstrate verwenden robotic mikrokontaktdrucken (r-mcp) und sequential nucleophile substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Im Tissue Engineering ist es wünschenswert, die räumliche Kontrolle der Gewebemorphologie und des Zellschicksals in Kultur auf der Mikrometerskala zu zeigen. Kultursubstrate mit transplantierten Poly(ethylenglykol) (PEG)-Bürsten können verwendet werden, um diese Aufgabe zu erfüllen, indem mikroskalige, nicht fouling- und zelladhäsionsresistente Regionen sowie Regionen geschaffen werden, in denen Zellen an biospezifischen Wechselwirkungen mit kovalent gebundenen Liganden beteiligt sind. Um komplexe Gewebe unter Verwendung solcher Substrate zu entwickeln, wird es notwendig sein, mehrere PEG-Bürsten sequentiell zu strukturieren, die funktionalisiert sind, um unterschiedliche Bioaktivitäten zu verleihen, und die in mikroskaligen Orientierungen ausgerichtet sind, die In-vivo-Nischen nachahmen. Der Mikrokontaktdruck (μCP) ist eine vielseitige Technik, um solche gepfropften PEG-Bürsten zu modellieren, aber der manuelle μCP kann nicht mit mikroskaliger Präzision durchgeführt werden. Daher haben wir fortschrittliche Robotik mit Soft-Lithographie-Techniken und aufkommenden oberflächenchemischen Reaktionen kombiniert, um eine robotergestützte Mikrokontaktdruckmethode (R-μCP) zur Herstellung von Kultursubstraten mit komplexen, mikroskaligen und hochgeordneten Mustern von PEG-Bürsten zu entwickeln, die orthogonale "Klick"-Chemien darstellen. Hier beschreiben wir ausführlich den Workflow zur Herstellung solcher Substrate.

Der Einsatz von manuellen Ausrichtung mCP Techniken, um Kultursubstrate mit Arrays von PEG-gepfropft Bürsten mit orthogonaler funktionalisiert Engineer "klicken Sie auf" Chemie hat in früheren Arbeiten 6 nachgewiesen. Allerdings bietet diese minimale Steuerung der Musterausrichtung und führt oft zu einer Überlappung von funktionalisierten Bereichen. Hier wird eine neue R-mgr; CP-System verwendet, um diese Beschränkung zu überwinden, und ihre Fähigkeit, genau Muster eine Anordnung von PEG Bürstenringräume mit ...

Zellkultursubstrate, funktionalisiert mit mikroskaligen Mustern biologischer Liganden, haben einen immensen Nutzen im Bereich des Tissue Engineering. Hier demonstrieren wir die vielseitige und automatisierte Herstellung von Gewebekultursubstraten mit mehreren, mikrostrukturierten Poly(ethylenglykol)-Bürsten und präsentieren orthogonale Chemien, die eine räumlich präzise und ortsspezifische Immobilisierung von biologischen Liganden ermöglichen.

Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Erzeugung von Gewebekultursubstraten mit mehreren Mikromuster-PEG-Bürsten, die orthogonale Chemien präsentieren, die eine räumlich präzise und ortsspezifische Immobilisierung biologischer Liganden ermöglichen. Dies wird durch die Abscheidung von Arrays aus Acan Thiol, einem TRP-Initiator, durch einen robotergestützten Mikrokontaktdruck auf goldbeschichteten Substraten erreicht. Als zweiter Schritt SI wird ein TRP auf den Mikromustersubstraten durchgeführt, wodurch PEG-Bürsten mit terminalen Bromgruppen erzeugt werden.Als nächstes werden die terminalen Bromgruppen mit einer oder zwei chemisch reaktiven Gruppen funktionalisiert, um die IM-Mobilisierung von entsprechend präparierten biologischen Liganden zu ermöglichen. Dann wird der gesamte Prozess wiederholt, um mit einer zweiten chemischen Gruppe zu funktionalisieren. Die Ergebnisse zeigen Microarrays von zwei orthogonal funktionalisierten PEG-Bürsten, die sich mit einer Genauigkeit von 10 Mikrometern überlagern.Dies wird mit einer speziellen Bildanalysesoftware überprüft, nachdem die reaktiven Gruppen mit fluoreszierenden Molekülen konjugiert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber Methoden wie dem manuellen Mikrokontaktdruck besteht darin, dass der robotergestützte Mikrokontaktdruck in der Lage ist, mehrere Druckschritte mit Mikrometergenauigkeit zu überlagern und gleichzeitig maximale Flexibilität und Substratdesign zu ermöglichen. Die Genauigkeit, die diese Methode in Verbindung mit sequentiellen nukleophilen Substitutionsreaktionen bietet, ermöglicht es uns, Gewebekultursubstrate zu erzeugen, die mit mehreren biologischen Liganden funktionalisiert sind, die dann in der Lage sind, eine zeitliche und räumliche Kontrolle von Sulfat auf der Mikrometerskala auszuüben.Vor S-I-A-T-R-P sollte ein goldbeschichtetes Deckglas mit dem A-P-D-M-S-Stempel gemustert worden sein. Dieses relativ gebräuchliche Vorgehen wird in einem Textprotokoll erklärt. Beginnen Sie damit, den Patentabdeckschieber vom Roboter zu entfernen, indem Sie das Vakuum loslassen.Füllen Sie es dann in einen 50-Milliliter-Kolben mit der Länge sch, verschließen Sie den Kolben und wenden Sie ein negatives Vakuum von 30 PSI an. Als nächstes werden 5,5 Milliliter A TRP-Reaktionsgemisch mit einer Spritze in den Kolben gegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,5 Millilitern L-Natriumascorbat in Wasser, ebenfalls über eine Spritze. Beobachten Sie, wie die Reaktion ihre Farbe von hellgrün zu dunkelbraun ändert.Lassen Sie die Reaktion 16 Stunden lang unter Inertgas weiterlaufen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie den Abdeckschieber und spülen Sie ihn mit Ethanol, dann mit Wasser und dann wieder mit Ethanol ab. Anschließend sanft mit Stickstoff trocknen.Der Microarray aus transplantierten P-E-G-M-E-M-A-Pinseln sollte mit bloßem Auge sichtbar sein. Verwenden Sie die Mikroskopie, um diese Veränderungen im Detail zu zeigen, um Azad zu funktionalisieren, die P-E-G-M-E-M-A-Ketten. Übertragen Sie den Objektträger auf ein 20-Milliliter-Reaktionsgefäß aus Glas und fügen Sie sechs Milliliter DMF mit 100 millimolaren Natriumazid hinzu.Lassen Sie die Reaktion 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius laufen. Spülen Sie am nächsten Tag den Patentdeckel mit Ethanol und trocknen Sie ihn unter einem sanften Stickstoffstrom, um die restlichen Brom-funktionalisierten P-E-G-M-E-M-A-Ketten zu beruhigen. Übertragen Sie den Objektträger des Mikromusters in ein 20-Milliliter-Reaktionsgefäß aus Glas und fügen Sie sechs Milliliter DMSO hinzu, das 100 millimolare Ethanolamine und 300 millimolare Triethylamine enthält.Lassen Sie diese Reaktion am nächsten Tag 24 Stunden lang bei 40 Grad Celsius ablaufen. Spülen Sie den Objektträger mit Ethanol ab und trocknen Sie ihn vorsichtig unter einem Stickstoffstrahl. Der nächste Schritt besteht darin, den Mikrokontaktdruck des Roboters mit einem zweiten PDMS-Stempel und dem anschließenden Stempeln zu wiederholen.Verwenden Sie erneut SI A TRP, um den zweiten Micro-Array-PEG-Pinsel grafisch darzustellen. Dann ist es an der Zeit, die zweite Microarray-P-E-G-M-E-A-Kette François mit Acetylen zu funktionalisieren. Das Micro-Pattern-Cover.In ein 20-Milliliter-Reaktionsfläschchen aus Glas mit sechs Millilitern 100 Millimol-Propagagin in DMF schieben. Lassen Sie die Reaktion 24 Stunden lang ablaufen. Am nächsten Tag bei Raumtemperatur den Objektträger mit Ethanol abspülen und unter einem sanften Stickstoffstrahl trocknen.Der Patent-Deckfolien ist dann bereit für die Biotin-Hochstimmung. Beginnen Sie damit, den Objektträger aus Mikropatent in ein 20-Milliliter-Reaktionsgefäß aus Glas zu legen. Zuerst fraß Biotin die Acetylen-terminierten Ketten.Geben Sie sechs Milliliter Kupfersulfat mit dem Azid-PEG Vier-Biotin-Konjugat in das Reaktionsgefäß, gefolgt von 1,2 Millilitern mit 0,15. Millimolare rbinare Säure in Wasser, um die Reaktion zu initialisieren, blasen Sie die Reaktion 10 Sekunden lang mit Stickstoff. Verschließen Sie dann das Fläschchen mit Paraform und lassen Sie die Reaktion 24 Stunden lang laufen.Spülen Sie den Abdeckschieber am nächsten Tag bei Raumtemperatur mit Wasser ab und geben Sie ihn in eine 12-Brunnen-Styroporschüssel. Dann bei Raumtemperatur bei DPBS mit Eselsserum für eine Stunde eine Stunde später, Färbung in den Biotin elierten Gruppen mit Streptokokken DEIN 5 46 Konjugat bei zwei Mikrogramm pro Milliliter in DPBS Färbung für zwei Stunden bei Raumtemperatur zwei Stunden später. Spülen Sie das Objektträger fünfmal mit sanftem Bewuchs in DPBS ab.Tobi ITIN aate die azi terminierten Ketten. Legen Sie den Deckglas in eine Vertiefung aus einer Polystyrolplatte mit sechs Vertiefungen und tragen Sie zwei Milliliter DPBS auf, die 20 mikromolare D-B-C-O-P-G-vier Biotin enthalten. Dann inkubieren Sie das Objektträger 24 Stunden später 24 Stunden lang bei Raumtemperatur.Spülen Sie den Objektträger wie zuvor vier aus und färben Sie ihn mit Streptavidin 4 88 ein. Konjugieren Sie bei zwei Mikrogramm pro Milliliter in DPBS. Zwei Stunden später.Spülen Sie das Objektträger erneut ab und bilden Sie es dann mit dem Mikroskop ab. Mit diesem Roboter-Mikrokontakt-Druckprotokoll. Ein genau gemustertes Array von PEG-Bürsten-ANN-UI mit terminalen Alkin-Gruppen wurde innerhalb eines separaten Arrays größerer PEG-Bürsten-ANN-UI mit terminalen Azi-Gruppen gemustert.Die räumliche Verteilung der Azid- und Alkingruppen wurde mit Hilfe der Click-Chemie und der Streptavidin-Bindung von Fluoreszenzsonden betrachtet. Eine Überlagerung beider Leuchtstoffkanäle zeigt, dass sich die Stempel nicht überlappen. Die Genauigkeit der Ausrichtung wurde mit unter 10 Mikrometern berechnet, was an den Grenzen des SCAR liegt.Ein System, das zum Drucken verwendet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mithilfe des robotergestützten Mikrokontaktdrucks benutzerdefinierte Gewebekultursubstrate generieren können, um mehrere Stiftbürstenarrays zu überlagern. Funktionalisiert mit orthogonalen Chemien.

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Erfahren Sie die Herstellung komplexer Kultursubstrate mittels robotischem Mikrokontaktdrucken und sequentieller Nukrophiler Substitution. Diese Methode ermöglicht die präzise Immobilisierung biologischer Liganden für Tissue-Engineering-Anwendungen.

Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

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