Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, spannungsgesteuerte Ionenkanäle in riesige uni-lamellare Vesikel einzubauen und ihre Aktivität mit Patch-Clamp-Messungen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Lösung aus kleinen Vesikel, die den Ionenkanal KVAP enthalten, teilweise dehydriert wird, um einen Lipidproteinfilm zu erzeugen. Als nächstes wird der Lipidfilm rehydriert, was die Bildung und das Wachstum von zellgroßen riesigen ALR-Vesikeln oder gvs verursacht, die den Kanal enthalten.

Dann werden die gvs in unsere Aufnahmekammer übertragen und ein Stück GUV-Membran mit einer Patch-Pipette herausgeschnitten, um die Ionenströme zu messen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ionenkanäle in der GUV-Membran als Reaktion auf Änderungen der Membranspannung aktiviert werden, basierend auf der Analyse der Stromaufzeichnungen. Riesige unilaterale physikalische Untersuchungen können helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Biophysik im Zusammenhang mit Membranprotein-Wechselwirkungen zu beantworten.

Zum Beispiel das Zusammenspiel von Transmembranproteinen mit den physikalischen Eigenschaften der Lipidmembran. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Funktion des spannungsgesteuerten Eisenkanals KVAP geben kann, kann sie auch auf andere Eisenkanäle, Transporter und Pumpen sowie Transmembranproteine im Allgemeinen angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte, die die Manipulation von Riesenvesikeln beinhalten, von entscheidender Bedeutung sind.

Wie man nur das Lesen von Artikeln aufnimmt, nachdem Lösungen und kleine unale Vesikel KVAP enthalten haben. Bereiten Sie gemäß dem Textprotokoll die Elektroformierungskammer vor, indem Sie zuerst die Drähte durch die Löcher einführen und die Drähte drehen und abwischen, um sicherzustellen, dass sie sauber sind, Sonneneinstrahlung und Trocknung unter einem Stickstoff- oder Luftstrom. Bereiten Sie 30 Mikroliter drei Milligramm pro Milliliter SUV-Suspension in SUV-Puffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben, und mischen Sie die Lösung kräftig, um die SUV-Lösung abzuscheiden.

Verwenden Sie eine Zwei-Mikroliter-Pipette oder eine Fünf-Mikroliter-Glasspritze, um kleine Tröpfchen der SUV-Lösung auf die Drähte zu geben. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen klein genug und weit genug voneinander entfernt sind, damit sie sich nicht berühren oder verschmelzen. Lassen Sie die deponierten SUVs ca. 30 Minuten an der frischen Luft trocknen.

Wenn sich die Tröpfchen abgesetzt haben, drehen Sie den Draht, damit die Lipidablagerungen mit dem Mikroskop leichter zu beobachten sind. Tragen Sie anschließend mit einer Spritze Vakuumfett auf den Boden der Kammer um die drei Vertiefungen auf und drücken Sie vorsichtig einen 40 Millimeter x 22 Millimeter großen Deckschirm dagegen, um den Kammerboden so abzudichten, dass er ohne Spalt haftet. Verwenden Sie dann Deckenpaste, um die Seiten der Kammer abzudichten, und tragen Sie Vakuumfett auf die Oberseite der Kammer auf, um die drei Vertiefungen zu umranden.

Fügen Sie langsam Wachstumspuffer hinzu, bis jede Vertiefung bis zum Rand gefüllt ist. Vermeiden Sie jede schnelle Bewegung der Lösung in den Vertiefungen, da dies möglich ist. Entfernen Sie den Lipidfilm von den Elektroden.

Verschließen Sie die Kammer, indem Sie den oberen Abdeckschieber vorsichtig auf das Fett drücken. Achten Sie darauf, dass sich der untere Abdeckschub nicht löst. Verwenden Sie zwei Krokodilklemmen, um den Signalgenerator mit den Drähten zu verbinden.

Stellen Sie die Frequenz entsprechend der Salzkonzentration des verwendeten Puffers und mit einem Multimeter ein und stellen Sie die Spannung über den Drähten ein. Verwenden Sie auch entsprechend Ihrem Puffer Aluminiumfolie, um die Kammer abzudecken, um die Flora Fours vor Licht zu schützen. Lassen Sie die G-UUVs zwei bis drei Stunden im Puffer mit niedrigem Salzgehalt und 12 Stunden oder über Nacht im Puffer mit hohem Salzgehalt wachsen.

Trennen Sie nach der Inkubation die Kammer vom Generator und stellen Sie sie vorsichtig auf ein inverses Mikroskop. Um das GUV-Wachstumsplasma zu bewerten, reinigen Sie einen Objektträger eine Minute lang, damit sich die ARO-Lösung gut darauf verteilen kann. Tragen Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Reinigung des Objektträgers 200 Mikroliter warme Aro-Lösung auf, die gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurde, so dass sie die gesamte Oberfläche benetzt.

Kippen Sie den Objektträger vertikal und berühren Sie die untere Kante eines Taschentuchs, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und hinterlassen Sie eine dünne, glatte Schicht Arous auf dem Objektträger. Legen Sie die Folie auf eine heiße Platte oder einen Backofen bei 60 Grad Celsius und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten trocknen. Legen Sie anschließend ein AROS-beschichtetes Deckglas in eine handelsübliche 3,5 Zentimeter große Petrischale.

Tragen Sie dann nach der Zubereitung der SUV-Lösung vorsichtig etwa 15 Mikroliter in etwa 30 sehr kleinen Tropfen auf die aros-Oberfläche auf. Achten Sie darauf, die Aros-Schicht nicht zu stark zu verzerren. Legen Sie den Objektträger etwa 10 bis 15 Minuten lang unter einen sanften Stickstoffstrahl und verfolgen Sie die Verdunstung des Puffers mit dem Auge.

Da die Tröpfchen trocknen, sobald die SUVs getrocknet sind, fügen Sie etwa einen Milliliter Wachstumspuffer hinzu, um die Oberfläche der Folie zu bedecken. Lassen Sie die Schwellung etwa 30 Minuten lang fortschreiten und verwenden Sie dann ein inverses Mikroskop mit Phasenkontrast oder DIC. Um das Wachstum der GU-UUVs in der Wachstumskammer zu untersuchen, um die Clamp-Gu-UUVs zu patchen, aßen die Kammer durch Zugabe einer Beta-Cain-Lösung von fünf Milligramm pro Milliliter, die das Anhaften der Gus verhindert. Spreizen und Reißen. Fünf Minuten inkubieren und spülen, die Erdungselektrode einführen und die Kammer mit einem Beobachtungspuffer füllen.

Übertragen Sie anschließend die G-UUVs in die Beobachtungskammer für elektrogeformte GU-UUVs. Öffnen Sie die Wachstumskammer, indem Sie den oberen Abdeckschirm vorsichtig entfernen. Platzieren Sie die Pipettenspitze direkt über jedem Draht und saugen Sie zum Ablösen der GU-UUVs langsam etwa 10 Mikroliter an, während Sie die Pipettenspitze entlang des Drahtes bewegen, um gelgestützte Quell-GU-UUVs zu ermöglichen.

Klopfen Sie zunächst einige Male auf die Seite der Petrischale, um die GU UUVs von der Deckglasoberfläche zu lösen. Positionieren Sie die Pipettenspitze knapp über dem Deckglas und saugen Sie 10 Mikroliter ab, während Sie die Spitze über die Oberfläche zurückziehen, um das geerntete GVS direkt in die Beobachtungskammer zu übertragen. Warten Sie einige Minuten, bis sich der Gus auf dem Boden abgesetzt hat, um den GVS zu flicken.

Verwenden Sie einen Beobachtungspuffer, um eine frische Patch-Pipette zu füllen und sie auf dem Patch-Clamp-Kopftisch zu montieren. Durchsuche die Kammer, um ein defektfreies GUV zu finden, und überprüfe, ob es fluoreszierendes Protein enthält. Wenden Sie einen konstanten Überdruck von mehr als 100 Pascal an, um das Innere der Patch-Pipette sauber zu halten, und führen Sie die Patch-Pipette in die Kammer ein.

Bringen Sie die Patch-Pipette in das Sichtfeld und legen Sie Testimpulse an, um den Spannungsversatz und den Widerstand der Pipette zu messen oder zu kompensieren. Untersuchen Sie dann die Pipette unter Leuchtstoffröhrenbeleuchtung, um zu bestätigen, dass die Spitze sauber ist. Bringen Sie die Patch-Pipette in Richtung des GUV und reduzieren Sie ggf. gleichzeitig den Überdruck, damit der Ausfluss aus der Patch-Pipette das GUV nicht weglaufen lässt.

Wenn sich die Patch-Pipette in der Nähe des GUV befindet, üben Sie Unterdruck aus, um das GUV gegen die Patch-Pipette zu ziehen. Überwachen Sie den Widerstand, wenn die Zunge der GUV-Membran in die Patch-Pipette eintritt und sich die Giga-Versiegelung bildet. Wenn das Inside-Out-Membranpflaster aus dem GUV herausgeschnitten wurde und die Giga-Dichtung stabil ist, schalten Sie die Prüfimpulse aus und wenden Sie ein Spannungsprotokoll an, wie im Text beschrieben.

Diese Abbildung zeigt DIC- und Epi-Fluoreszenzbilder eines defektfreien GUV. Die gleichmäßige Proteinfluoreszenz in der GUV-Membran bestätigt, dass KVAP in das GUV eingebaut wird, anstatt im Lipidfilm zu verbleiben, und keine Aggregate gebildet hat. Die fluoreszierenden Lipid- und Proteinsignale wurden auf die gleiche durchschnittliche Dichte skaliert, so dass g UUVs mit einer niedrigen oder hohen Proteindichte in den Overlay-Bildern einen magentafarbenen oder grünen Farbton haben, während GVS mit einer durchschnittlichen Proteindichte weiß sind.

Es wurden isolierte defektfreie G-UUVs identifiziert und die GUV-Größenverteilung ist hier dargestellt. In der Regel führt die Elektrobildung zu defektfreieren G-UUVs als die gelgestützte Quellung, aber die durch die Elektrobildung erzeugten GUS sind kleiner. Hier ist die Proteindichteverteilung dargestellt, die aus der GUV-Fluoreszenz abgeleitet wurde.

Durch die Elektrobildung mit hohem Salzpuffer entstehen GU-UUVs mit unterschiedlichen Proteindichten. Die Dichte variiert bei der Elektrobildung mit niedrigem Salzpuffer viel weniger, und die Proteindichte von GU-UUVs, die durch gelgestützte Quellung erzeugt werden, ist in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration im exzidierten Pflaster bemerkenswert gleichmäßig. Die aktuellen Kurven zeigen entweder einzelne Kanäle oder ein Ensemble von Kanälen.

KVAP zeigt eine spannungsabhängige Öffnung. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich an die riesigen Vesikel zerbrechlicher Objekte zu erinnern, die nicht gegen schiere und osmotische Belastung resistent sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie das Ziehen von Lipid-Nanoröhrchen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Krümmungserfassung von Proteinen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man GVS herstellt, das funktionell rekonstituierte Proteine enthält.