Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

Hallo, mein Name ist Ken Paradiso. Ich arbeite für Ling Gang Wu am National Institute of Neurological Disorders and Stroke Intramural Program, das sich am NIH auf dem Bethesda-Campus befindet. Ich zeige Ihnen die Techniken für das Caly haben präsynaptische Aufzeichnung Patch Clamping.

Um also das Hirngewebe aufzubereiten, entnehmen wir der Ratte das Gehirn. Wir legen das Gehirn in diese Lösung, die eiskalt und kalziumarm ist, und es sprudelt vor Karbogen, um sicherzustellen, dass das Gehirn jederzeit mit Sauerstoff versorgt wird. Und es muss auch eiskalt sein, um DA zu minimieren und das Ausmaß des Schadens zu minimieren.

Das Gehirn wäre nun also in dieser Lösung. Wir nahmen es heraus, schnitten es entsprechend zu, so dass es auf den Block gelegt werden konnte, montierten es mit Sano-Korrelat oder verrücktem Kleber auf den Block, füllten dann aber die Kammer mit eiskalter, kalziumarmer Lösung, ließen es sprudeln, platzierten es auf dem Vibrator und schnitten dann Scheiben mit einer Dicke von 180 bis 190 Mikrometern bei einer Frequenz von 70 Hertz und einer Vorwärtsgeschwindigkeit von 0,01 bis 0,02 Millimetern pro Stück Sekunde. Das wären also 10 bis 20 Mikrometer pro Sekunde.

Sobald jede Scheibe hergestellt ist, übertragen wir die Scheiben aus der eiskalten Kochsalzlösung in diese Kammer, die normale Kalziumlösung enthält. Dies ist die gleiche Lösung, in der wir aufnehmen, und sie hat eine physiologische Temperatur von 37 Grad. Dann legen wir die Scheiben hier hinein, um sie zu verwerten.

Es bleibt hier eine halbe bis eine Stunde, bevor die physiologischen Experimente durchgeführt werden. Hier habe ich also das Gehirn und ich werde es aus der Lösung ziehen. Das ist also ein größeres Gehirn zu Demonstrationszwecken.

Dies ist von einer P 20 Ratte. Wir drehen es um. Es ist der Hirnstamm, an dem wir interessiert sind.

Also, dieser Bereich hier unten und der Kelch, den er gehalten hat, ist genau in diesem Bereich, genau dort. Was wir also tun werden, ist, den Rest des Gehirns abzuschneiden, den Hirnstamm zu isolieren und dann den Hirnstamm für die Schnittkammer vorzubereiten. Okay, wir werden also den Rest des Gehirns abschneiden und den Hirnstamm isolieren.

Ich werde es umdrehen, um zu zeigen, wo wir stehen. Normalerweise würden wir es nicht so machen, und auch hier können wir einfach den ganzen Teil loswerden. Als wir es wieder umdrehen, haben wir den Hirnstamm isoliert und machen einfach einen weiteren Schnitt genau dort.

Okay, das war's. Das ist der Hirnstamm. Der Kelch von Held hat genau dort und dort recht.

Das ist der Hirnstamm. Auch hier schieben wir es ein wenig nach hinten. Wir werden eine Seite des Kleinhirns abschneiden und das wird es dem Hirnstamm ermöglichen, so seitlich zu sitzen.

Wir geben ein wenig Sano-Acrylkleber hinein und lassen ihn seitlich liegen, füllen ihn schnell mit kaltem Eis und kalter kalziumarmer Lösung. Bringen Sie die Sauerstoffleitung so schnell wie möglich dorthin. Wir nehmen es nun auf und bringen es zum Vibrato.

Wir bringen es schnell hinein, um zum Anfang des Gehirns zu gelangen, und dann, wenn wir am Anfang des Gehirns ankommen, senken wir die Geschwindigkeit auf 0,01 Millimeter pro Sekunde. Es sind also 10 Mikrosekunden pro Sekunde. Es bewegt sich also unglaublich langsam.

Der erste Teil des Gehirns ist der Teil, der das mtb hat, das ist der mediale Nil des trapezförmigen Körpers. Und das ist der Teil, der das, okay, also sobald ich es in der Transferpipette habe, versuche ich, es so nah wie möglich an die Spitze der Pipette zu bringen. Und da ist das Stück des Gehirns, das ich ziemlich schnell in diese Kammer übertrage, die eine Standard-Aufzeichnungslösung enthält, die einen normalen Kalziumspiegel und auch eine höhere Temperatur hat.

Und das wird es den Scheiben ermöglichen, sich nach den Schneidevorgängen zu erholen, dass sie aus physiologischen Experimenten fertig sind. Okay, von jetzt an wird es immer wieder das Gleiche sein. Die folgende Ausrüstung werde ich verwenden, um das Patchklemmen durchzuführen.

Wir verfügen über ein aufrechtes Mikroskop mit festem Tisch. Der Tisch ist, wie gesagt, fixiert, so dass sich das Mikroskop von einem Manipulator unter ihm bewegt. Wir verwenden eine Perücke und einen Newman Mikromanipulator, um die Bühne zu halten, die Kopfstufe des Verstärkers, wir verwenden einen EPC 10 Patch Clamp Verstärker von heca.

Und was ich auch hätte erwähnen sollen, ist, dass wir DIC mit Infrarotlicht verwenden. Wir haben hier also eine IR-Kamera, und alles, was wir sehen, wird auf dem Bildschirm zu sehen sein, wenn wir nach CAEs suchen. Der Patch-Clamp-Verstärker wird von dieser Software gesteuert, die Pulse genannt wird, die ebenfalls von Heca stammt und den Verstärker und das gesamte physiologische Experiment steuert

Die Ergebnisse werden auf diesem Bildschirm angezeigt. Das Caly Held ist ein großes präsynaptisches Terminal, und weil es groß ist, ermöglicht es uns, physisch auf das Terminal zu patchen. Wir können also präsynaptische Aufzeichnungen machen, und das ist eine einzigartige Sache, besonders im ZNS.

Dies ermöglicht es uns, präsynaptisch aktivierte Kalziumkanäle zu messen. Es können wir auch die potentielle Aktivität messen, wenn wir den Nerv stimulieren wollen, der zum Kelch führt. Was wir in diesem Labor tun, ist die Messung eines Prozesses namens Exozytose, bei dem es sich um die Verschmelzung von Vesikel, die Neurotransmitter enthalten, mit der Membran handelt.

In diesen Vesikeln verschmelzen sie mit der Membran in dem Prozess, der Exozytose genannt wird, und fügen dem synaptischen Terminal eine Membran hinzu, und wir können dies als eine Änderung der Kapazität messen. Wir erhalten eine Erhöhung der Kapazität, wenn die Membran zum Terminal hinzugefügt wird, so dass, also sind die Experimente, die ich heute zeigen werde, Kapazitätsmessungen, präsynaptisch, wenn die Membran entfernt wird. Sie können also nicht einfach immer wieder Membranen hinzufügen, Sie müssen natürlich einige entfernen.

Dieser Prozess wird als Endozytose oder Membranaufnahme bezeichnet. Wir können das auch messen, und das wird als Abnahme des Kapazitätsniveaus gemessen, und wir werden später Beispiele dafür zeigen. Dies ermöglicht es uns nun, die Aktivität der Kalziumkanäle zu überwachen und auch einige der Proteine zu überwachen, die an der Exozytose und Endozytose beteiligt sind, und sie zu untersuchen.

Wir können Dinge wie Peptide einbauen, um Proteine zu blockieren, die an der Exo- oder Endozytose beteiligt sind. Wir können auch Giftstoffe verwenden, die das Gleiche tun. Wir können auch die Mengen an Kalzium anpassen, die in das Terminal gelangen, so dass wir den Exozytoseprozess, die Freisetzung von Neurotransmittern sowie die Aufnahme der Membran, die auf dieses Ereignis folgt, wirklich untersuchen können.

Dies ist das Röhrchen, das unsere intrazelluläre Aufzeichnungslösung enthält. Wir bereiten es im Voraus vor und frieren es dann ein und können es in der Regel mehrere Wochen bis zu einem Monat lang verwenden, bevor wir eine neue Lösung herstellen müssen. Auch hier dachten wir sofort, bevor wir unsere Aufnahmen machten, dass man immer eine bestimmte Menge an Staubpartikeln oder anderen Arten von Schmutz bekommen wird, die in die Röhre gelangen werden.

Sie können eines von zwei Dingen tun. Du kannst die Lösung entweder herausnehmen und filtrieren, oder du kannst sie ein oder zwei Minuten lang drehen und dann die Lösung abziehen, wobei ein unterer Teil übrig bleibt, in dem sich Schmutz und anderes Material befinden. Also ziehe ich es vor, es zu drehen, und das mache ich jetzt.

Das ist also das Röhrchen, das unsere intrazelluläre Lösung enthält. Es ist aufgetaut. Wir werden es etwa zwei bis drei Minuten lang in einer kleinen winzigen Zentrifuge drehen, und das sollte ausreichen, um große Staubpartikel aus der Lösung zu entfernen.

Jetzt ziehe ich einfach den Deckel ab, die Lösung, die wir gerade gesponnen haben, wobei ich darauf achte, sie nicht zu bewegen, und übertrage sie in eine saubere Tube, und ich ziehe etwa 90 % davon ab. Ich versuche, es nicht noch einmal zu tun, das letzte bisschen zu bekommen. Also werde ich gleich hier aufhören.

Diesen habe ich sofort auf Eis gelegt, damit er während des Experiments schön kalt bleibt. Das ist sehr wichtig. Das ist die, das ist eine unserer Pipetten.

Wir verwenden dies für intrazelluläre Aufzeichnungen. Es handelt sich um dickwandiges Quarzglas mit zwei Millimetern Außendurchmesser und 1,16 Millimetern Innendurchmesser. Zuerst füllen wir die Pipette auf.

Wir saugen also etwas, wir stecken die Pipette in die Aufnahmelösung und saugen, um zu versuchen, die äußerste Spitze der Pipette zu füllen, die sich sonst nicht auf andere Weise füllt. Sobald wir das getan haben, nehmen wir einen Kapillarschlauch und füllen den Rest der Elektrode, indem wir nur die Rückseite Ihrer Pipette nehmen. Dies ist eine Standard-Physiologie-Technik, die buchstäblich geschnippt werden kann.

Sie laufen Gefahr, das Ende der Pipette zu brechen, aber wenn Sie das nicht tun, werden Sie oft Luftblasen haben. Okay, wir legen es jetzt auf unseren Pipettenhalter, der mit unserer Kopfstufe des Patch Plant Verstärkers verbunden ist. Da ist ein Silberchloriddraht.

Der Silberchloriddraht kommt mit der intrazellulären Lösung in Kontakt, und das ermöglicht es uns, die elektrische Aktivität im präsynaptischen Terminal zu messen. Was wir also tun, ist, den Slice zu finden, der viele CAEs enthält. Wir wollen eine hohe Dichte an CAEs.

Das heißt, wir suchen nach dem medialen Kern des trapezförmigen Körpers, der das MNTB ist, und dort befindet sich das Terminal, das den Kelch bildet, oder das ist die Kelch-App, wie es gefunden wird. Und so fangen wir an, die Scheibe zu scannen. Da haben wir zum Beispiel einen Kelch, der ein wenig tief von der Oberfläche abliegt und auf dem es nicht viel gibt, auf das wir flicken können, also scannen wir einfach weiter über uns.

Das ist also ein Kelch hier, den wir anstreben. Was ich gemacht habe, sind zwei Markierungen auf dem Bildschirm, wo die Pipette hingehen wird. Und Sie können sehen, dass das Stück Kelch, das ich nach der Pipette gehen werde, herunterkommen wird.

Ich werde einen positiven Druck ausüben, so dass er gegen den Kelch drückt, und dann werde ich den positiven Druck abbauen. Der Kelch drückt dann gegen die Pipette, und an diesem Punkt sauge ich sehr sanft und versuche, die Membran zu saugen und zu drücken oder die Membran auf die Pipettenspitze zu bringen. In Ordnung, der positive Druck wurde abgebaut.

Und jetzt werde ich saugen. Hier sind wir also Profi, wir wenden einen Fünf-Millivolt-Impuls an, oder eigentlich einen Vier-Millivolt-Impuls. Okay, das war's. Okay.

Jetzt senken wir das Membranpotential auf minus 80, heben den schnellen transienten Ausleger auf. Jetzt gehen wir zur ganzen Zelle. Ich werde sanft saugen und versuchen, im Großhandel zu verkaufen.

Diese Ladetransienten zeigen an, dass er, dass die Pipette und die Zelle nun kontinuierlich sind, dass er eine umfassende Aufzeichnung hat. Das ist wieder eine schöne Aufnahme. Je heller das Rot war, desto größer war die Kapazitätskurve, und Sie können sehen, dass es einen plötzlichen Sprung gab. Und dann ging es zurück.

Okay, ich habe Ihnen gerade die grundlegenden Techniken gezeigt, um Aufnahmen von einem Kelch zu erhalten, der präsynaptisch gebunden ist. Ich habe Ihnen gezeigt, wie Sie die Scheiben herstellen, die den medialen Kern des Trapezkörpers enthalten. Dort findet ihr die Blütenkelche, die gehalten haben.

Und ich habe Ihnen die Techniken gezeigt, mit denen Sie durch die Scheiben schauen können. Du wirst jede der Scheiben durchgehen und nach der Scheibe suchen, die die größte Anzahl an Calys auf der Oberfläche hat. Sie werden dann nach der größten Caly-Membran suchen, die Sie finden können, und die Schallplatte darauf kleben.

Und ich habe Ihnen auch die Techniken für die Aufnahme von Patch-Klemmen gezeigt, und das sind Standard-Techniken für Patch-Clamp-Aufnahmetechniken.