Name: Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Lernen Sie die Patch-Clamp-Technik für präsynaptische Aufnahmen am Calyx of Held in Rattenhirnschnitten. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen von Exozytose und Membrankapazität in der Synapsenphysiologie.

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Patch-Clamp-Setup: Optik: Die Optik ist sehr wichtig, eine gute Zelle zu finden, und um die Position der es zu etablieren. Versuchen Sie, ein klares Bild von den Zellen zu erhalten: scharfe Kanten, weich aussehende Zelle. Scan das gesamte Feld, für gute MNTB wichtigsten Zellen mit angeschlossenem Kelch zu suchen. Drehen Gericht für Kelche aus verschiedenen Blickwinkeln betrachten. Zunächst ist es OK, um auf Ballon-förmigen Klemme Praxis. Pick-Zellen an der Oberfläche des Slice, oder in der 2. Zellschicht. Ziel der ersten 1 / 3 rd der Zelle mit Pipette Identifizieren Hopfenzapfen: für ein Doppelzimmer Membran (siehe Abbildung 1) Look, und drehen Sie die Scheibe Gericht, es aus verschiedenen Blickwinkeln sehen, um zu bestätigen, dass es ein Kelch ist. <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="Abbildung 1" width="298" height="159" /> Abbildung 1 Tiefe der Kelch: Calyx sollte auf der Oberfläche oder als nahe an der Oberfläche wie möglich. Zur Verfügung stehende Fläche für das Patchen: Verwenden Sie Fein-Fokus-Knopf am Mikroskop zu bestimmen, wie &quot;breit / tief&quot; der Kelch ist. Zum Beispiel werden ca. 10% einer vollen Umdrehung der Feinfokussierung Ihnen mehr als genug Fläche, um auf Patch. Abdichtung auf einen präsynaptischen Zelle: Um zu Zelle angebracht zu bekommen, für einen &quot;kleinen&quot; Verformung auf der Zelloberfläche durch pos Druck (~ 0.15psi) in die Pipette suchen, verwenden Sie Manipulator Pipette laufen nach oben, unten und quer, und sogar in der Oberfläche des presyn Terminal, um eine gute Verformung zu bekommen, dann lassen Sie Druck und Unterdruck anwenden, wenn und soweit notwendig. PULSE-, Datenerfassungs-Programm: Brauchen Sie, um Puffergröße vor dem ersten Gebrauch zu erhöhen, und wenn durch Stichproben Kapazität erforderlich. Brauchen Sie laden modifizierten Makros jeder Zeit. Flüssige Junction Potential: Presyn Recording Solution-11mV (negative 11mV). Presyn: Cslow = ~ 15 pF Rs comp für presyn: 10 us, 65% (mehr Entschädigung kann möglich w / out Schwingungen) Vor der Aufnahme Kapazität: Prüfstrom Entspannung (10 mV, 10 ms Sprung) zu sehen, ob Entspannung monoexponentielle ist, dh ob presyn Begriff, der von einem einzigen Innenraum modelliert werden kann. Filter: Set mit 30 kHz und 10 kHz (Bessel-Filter 1 und 2) während der Entspannung Mess-, um sicherzustellen, dass eine schnelle Komponente nicht auf verfehlt. Während Mini-Aufnahmen verwendet Xinsheng 10 kHz und 5 kHz. LGW hat mich gebeten, nur Filter 1 Satz bei 30 kHz verwenden, um sicherzustellen, dass wir Anstiegszeit von Mini messen. Dateien benennen: 7-stellig 000mmxx, wobei mm Monat (oder Monat und Jahr) und xx ist die Zellzahl. Cleaning Solution Lines: Zeilen am Ende des Experiments mit 20 ml 0,1 M HCl gereinigt, gefolgt von 200 ml ddH2O. Externe Lösungen recycelt werden, ist Pumpendrehzahl 20-30 Umdrehungen pro Minute. (Lösung der Rückkehr aus Bad Kammer fließt zurück in den Messzylinder). Set up 3 abgehende Leitungen, um eine ausreichende Saugleistung zu gewährleisten. Pipette Präsynaptische Recording Solution: ~ 310 Millisekunden osmolaren Presyn Lösung muss ~ 310 mOsm zu R-Zugang Anstieg im Experiment zu verhindern. Presyn Pipettenlösung unterscheidet sich von postsyn Pipettenlösung (Presyn hat ATP &amp; GTP für ex.). TTX-TEA-Lösung (Ca Strömen Isolat): <ul><li> Versuchen Sie, nach dem Versiegeln oder sogar Patches gelten, auf die Zelle, wie TEA in Lösung Blöcke K-Kanäle und depolarisiert die Zelle. Das ist nicht gut für die Zelle. Aus dem gleichen Grund ist es vielleicht nicht möglich sein, die Scheibe Wiederverwendung nach TTX angewendet wird. </li><li> Vergleichen Sie die erste und die letzte Antwort der Zelle, oder ein Stück für eine Wirkung anhaltender Depolarisation zu überprüfen. </li><li> TTX ist bei 1 uM statt 0,5 uM verwendet, so ist der Effekt schneller. Benötigen Sie weniger Zeit nach dem Wechsel Lösungen warten. </li></ul> Cutting Slices Vibratom Einstellungen: <ul><li> 70Hz seitlichen Schwingungen </li><li> Amplitude: 1,0 mm </li><li> Fahrgeschwindigkeit 0,01-0,02 mm / sec beim Schneiden Scheiben mit Kelch, 0,1 ansonsten Dicke: 180 &amp;mgr; m (~ 150um bei älteren Tieren) </li></ul> Scheiben bei 37 º C für 1 Stunde (einschließlich Schneiden Zeit), dh, lassen in Bad 15-20 Minuten nach dem Schneiden. Pipetten: Presyn: 3,5-4,5 MOhm auf den ersten, 3,0 bis 3,5 MOhm, wenn sich sicherer fühlen Verwenden Sie puller Handbuch Einstellungen vornehmen. Verwenden Sie Delay Feature, denn Glas ist dick (Verzögerungen von 200 oder 1 Arbeitsplatz) Glass Art: Borosilikatglas, Standard-Wand, kein Filament Außendurchmesser: 2,0 mm Innendurchmesser 1,16 mm Länge: 7,5 cm

methoden für die patch-clamp kapazität recordings aus dem kelch

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Wir zeigen die grundlegenden Techniken für die präsynaptische Patch-Clamp-Aufzeichnung am Kelch der Held, ein zentralen Nervensystem von Säugetieren Nervenendigung. Elektrische Aufnahmen aus den präsynaptischen Terminal ermöglichen die Messung der Aktionspotentiale, Calcium-Kanal-Ströme, Vesikelfusion (Exozytose) und anschließende Membran-Aufnahme (Endozytose). Die Fusion von Vesikeln mit Neurotransmitter bewirkt, dass die Vesikelmembran an die Zellmembran der Kelch hinzugefügt werden. Dieser Anstieg in Höhe von Zellmembran ist eine Erhöhung der Kapazität gemessen. Die anschließende Reduktion der Kapazität zeigt Endozytose, den Prozess der Membran die Aufnahme oder Streichung aus dem Kelch Membran. Endozytose, ist notwendig, um die Struktur der Kelch zu halten und es ist auch notwendig, um Vesikel, die mit Neurotransmitter für zukünftige Exozytose Ereignisse gefüllt werden bilden. Kapazität Aufnahmen am Kelch von Held haben es möglich gemacht, um direkt und schnell messen vesikuläre Freisetzung und anschließende Endozytose in einem Säuger-ZNS Nervenendigung. Darüber hinaus können die entsprechenden postsynaptischen Aktivität gleichzeitig mit gepaart Aufnahmen gemessen werden. So ein vollständiges Bild von der präsynaptischen und postsynaptischen elektrische Aktivität an einem zentralen Nervensystems Synapse ist erreichbar mit diesem Präparat. Hier werden die Methoden zur Scheibe Vorbereitung, morphologische Merkmale zur Identifizierung von Kelchen der Held, grundlegende Patch-Clamp-Techniken und Beispiele der Kapazität Aufnahmen Exozytose und Endozytose Maßnahme.

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

Wir demonstrieren die grundlegenden Techniken für die präsynaptische Patch-Clamp-Ableitung am Calyx of Held, einer Nervenendigung des zentralen Nervensystems von Säugetieren. ...

Hallo, mein Name ist Ken Paradiso. Ich arbeite für Ling Gang Wu im Intramural-Programm des National Institute of Neurological Disorders and Stroke, das sich auf dem Bethesda-Campus des NIH befindet. Ich werde Ihnen die Techniken für die kalizierte präsynaptische Ableitung mittels Patch-Clamp-Verfahren zeigen.Um das Gehirngewebe vorzubereiten, entnehmen wir das Gehirn der Ratte. Wir legen das Gehirn in diese Lösung, die eiskalt sein muss und einen niedrigen Kalziumgehalt aufweist, und lassen sie mit Carbogen durchblubbeln, um sicherzustellen, dass das Gehirn jederzeit mit Sauerstoff versorgt wird. Außerdem muss die Lösung eiskalt sein, um die DA zu minimieren, also die Schädigung so gering wie möglich zu halten.Das Gehirn befindet sich nun in dieser Lösung. Wir nehmen es heraus und schneiden es entsprechend zu, sodass es auf den Block aufgebracht werden kann, wobei es mit Sano Correlate oder Sekundenkleber auf dem Block befestigt wird. Anschließend füllen wir die Kammer mit eiskalter, kalziumarmer Lösung, belüften sie, platzieren sie auf dem Vibratome und schneiden dann Schnitte mit einer Dicke von 180 bis 190 Mikron bei einer Schwingfrequenz von 70 Hertz und einer Vorschubgeschwind

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in...

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Wir bieten Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für whole-cell Patch-Clamp-Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in peripheren mononukleären Zellen gewonnenen humanen T-Lymphozyten.

Whole-Cell Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in menschlichen T-Lymphozyten

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Nach der Exozytose wird die fusionierte Plasmamembran durch einen Prozess gewonnen, der als Endozytose bekannt ist. Dieser Mechanismus reformiert neue synaptische Vesikel für die nächste Runde der Freisetzung. Einzelne endozytäre Ereignisse werden durch die Verwendung der zellgebundenen Kapazitätsaufzeichnungen in chromaffinen Nebennierenzellen der Maus erfasst und analysiert.

Methoden für die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen in Maus-chromaffinen Nebennierenzell

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Echtzeit- und dynamischen Erfassung von spannungsgesteuerten Kaliumkanalströmen (Kv) in H9c2-Kardiomyozyten unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik.

Spannungsabhängige Kaliumstromaufzeichnung an H9C2-Kardiomyozyten mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Technik

Dies ist eine Anleitung zum Ändern der Form von Glas-Mikropipetten. Insbesondere durch Anwendung von Wärme und Luftdruck der Verjüngung ist ohne Erhöhung des Bahnöffnung verbreitert, was zu niedrigeren Pipette Widerstand. Dies ist entscheidend für rauscharme Aufnahmen von kleinen Zellen zu erhalten, sondern ist in vielen Anwendungen.

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Lernen Sie die Patch-Clamp-Technik für präsynaptische Aufnahmen am Calyx of Held in Rattenhirnschnitten. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen von Exozytose und Membrankapazität in der Synapsenphysiologie.

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

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