3D-Modellierung der Seitenventrikel und histologische Charakterisierung Periventrikuläre Tissue in Mensch und Maus

Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das Untersuchungen der Ursache und Wirkung der ventrikulären Magalie ermöglicht, und Techniken hervorzuheben, die es ermöglichen, die Gesundheit des ventrikulären Systems und seine wichtigen Barriere- und Filterfunktionen im Gehirn zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem entweder koronale Schnitte des Mäusegehirns oder MRT-Scans des menschlichen Gehirns entnommen werden, um 3D-Rekonstruktionen der Ventrikel zu erstellen und das Ventrikelvolumen zu berechnen. In einem zweiten Schritt wird postmortales Gewebe, das en foss-Präparationen der apikalen Oberfläche der Ventrikel umfasst, mit zellspezifischen Antikörpern gefärbt, um die zelluläre Integrität der Ventrikelschleimhaut aufzudecken. Als nächstes wird eine Montage der zellulären Organisation an der gesamten Ventrikeloberfläche vorbereitet und über das 3D-Modell des Ventrikels gerendert, um Regionen der Gliose im Vergleich zu intakten Append-Zellen zu demonstrieren.

Die Ergebnisse zeigen Regionen der Ventrikelexpansion basierend auf einer longitudinalen 3D-Modellierung der Ventrikel und Bereiche, in denen die appende themale Zellschicht der Ventrikelschleimhaut nicht mehr intakt ist, sondern durch Glianarben ersetzt ist. Durch die Kombination der 3D-Modellierungsdaten mit den immunhistochemischen Daten kann eine 3D-regionenspezifische Karte der zellulären Zusammensetzung der Ventrikelschleimhaut erstellt werden. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose von Hirnverletzungen, neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit und normalem Altern, die alle typischerweise ein gewisses Maß an Ventrikelerweiterung und damit wahrscheinlich eine Ventrikinskoliose aufweisen.

Die Verfahren an der Maus werden von Richard Wolffer und einem Studenten aus unserem Labor demonstriert, die mit menschlichen MRT-Daten und postmortalem menschlichem Gewebe durchgeführt werden. Derzeit ist sie Medizinstudentin und Rebecca Chu, eine Doktorandin im Labor. Bereiten Sie die Objektträger für die Abbildung vor, indem Sie das Mausgehirn fixieren, schneiden, immunfärben und montieren, wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben. Um das Verfahren zu beginnen, um die Seitenventrikel der Maus zu verfolgen, schalten Sie das aufrechte Fluoreszenzmikroskop und den Computer ein. Das Mikroskop sollte mit einem automatisierten Tisch und einer digitalen CCD-Kamera ausgestattet sein.

Starten Sie die Mapping-Software im Fluoreszenzmodus, öffnen Sie die Anzeigeoptionen, um die Symbolleisten und Docking-Pool-Panels zu laden, die für die Verfolgung erforderlich sind. Klicken Sie anschließend auf Optionen, zeigen Sie Optionen Zubehör an und wählen Sie die Haupt- und Markierungssymbolleiste im selben Menü aus. Wählen Sie unter "Docking-Pool-Bereiche" die Option "Kamerahistogramm", "Mehrkanalsteuerung", "Kameraeinstellungen" und "Bildaufnahme" aus.

Identifizieren Sie das erste Gewebestück, das die Seitenventrikel enthält, anhand einer starken S 100 beta-Fluoreszenz, die die Append-Zellen markiert. Auskleidung des Seitenventrikels. Richten Sie die linke und rechte Hemisphäre aus, indem Sie den kleinen Schnitt identifizieren, der während des Schnitts gemacht wurde.

Erstellen Sie nun eine neue Datendatei und legen Sie einen Referenzpunkt für die Tischbewegung fest, indem Sie in das Bildfenster oberhalb der linken Seitenkammer klicken. Halten Sie diesen Referenzpunkt an einer konsistenten Position relativ zu den lateralen Ventrikeln in den Verfolgungsdateien. Um beim Importieren von Konturen für die Serienrekonstruktion zu helfen, wählen Sie den entsprechenden voreingestellten Konturtyp aus dem Dropdown-Menü der Kontur aus.

Verwenden Sie für jede der Spuren des linken und rechten Seitenventrikels eine eindeutige Farbe. Klicken Sie nun entlang der gesamten apikalen Fläche der Anhangsschleimhaut, um die Kontur des Ventrikels nachzuzeichnen. Verschieben Sie das Nachzeichnerfenster mit den Pfeiltasten.

Nachdem Sie die Kontur nachgezeichnet haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kontur schließen. Wiederholen Sie die Abtastung für den rechten Ventrikel mit einer anderen Farbe. Wählen Sie als Nächstes den entsprechenden Marker aus der Markierungssymbolleiste auf der linken Seite aus, und klicken Sie, um einen Marker auf dem Nachzeichnerbildschirm entlang der Mittellinie abzulegen, um das Ausrichten serieller Konturen für die 3D-Rekonstruktion zu erleichtern.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine zweite Markierung vorzunehmen. Speichern Sie die Gewebespuren, indem Sie Datei speichern Datei unter auswählen und einen neuen Ordner- und Dateinamen erstellen, nummerieren Sie die Spuren, gemäß der Konvention: Objektträgernummer, Strich, Gewebenummer zur einfachen Identifizierung von Spuren aus Serienschnitten. Wiederholen Sie dann das soeben gezeigte Verfahren für alle Abschnitte, die einen Ventrikel enthalten.

Zur Durchführung der 3D-Rekonstruktion des Seitenventrikels. Öffnen Sie das 3D-Rekonstruktionsprogramm. Klicken Sie dann auf Datei Öffnen und wählen Sie die Konturdatei des ersten seriellen Leiterbahnabschnitts aus.

Importieren Sie alle Konturzeichnungen des linken und rechten Ventrikels sowie alle hinzugefügten Marker. Richten Sie die Konturen gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls aus. Wählen Sie dann im linken Bereich alle Konturen aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche 3D-Visualisierung, um die endgültige 3D-Rekonstruktion anzuzeigen.

Dieses Bild zeigt einen koronalen Schnitt des Maushirns einschließlich der lateralen Ventrikel, die von S 100 beta immunreaktiven Append-Zellen umrandet sind. Das Sternchen kennzeichnet die Seitenventrikel. Die Brackets beschreiben die Adhäsion und der Maßstabsbalken stellt 500 Mikrometer dar.

Die Seitenventrikel der Maus sind als Konturen nachgezeichnet und als Untersegmentabschnitte angeordnet. Intraventrikuläre Regionen werden von der Beeinträchtigung der volumetrischen Analyse ausgeschlossen. Dieses Bild zeigt die abschließende 3D-Rekonstruktion der Konturen der lateralen Ventrikel.

Die gelbe Farbe stellt die Kontur des gesamten Gehirnvolumens dar, das sich über die interessierende Region erstreckt, in der sich die Seitenventrikel befinden. Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 3D-Ventrikelrekonstruktionen von in Corona-Schnitten geschnittenem Hirngewebe erstellt Protokolle sind aufgeführt, um eine 3D-Bildrekonstruktion und volumetrische Quantifizierung von Seitenventrikeln zu erstellen und volumetrische Veränderungen im Laufe der Zeit mithilfe der Längsüberlagerungsanalyse zu beurteilen, ist es wichtig zu beachten, dass Konsistenz in der MRT. Die R-Datenerfassung und die Verarbeitung nach der Aufnahme sind äußerst wichtige Kriterien für die Einbeziehung von Datensätzen. Um eine ventrikuläre Segmentierung durchzuführen, wird ITK SNAP verwendet, um die Ventrikel aus hochauflösenden T-One-gewichteten MRT-Bildern zu segmentieren. Öffnen Sie nach dem Start des Programms das Graustufenbild, wählen Sie die gewünschte Datei aus und öffnen Sie sie als raffinierte Datei.

Scrollen Sie dann durch jede anatomische Ebene und notieren Sie ventrikuläre Anomalien wie Nasenregionen, große oder kleine Schläfenhörner oder ähnliches. Klicken Sie anschließend in der Haupt-Toolbox auf Schlange, ROI-Tool. Segmentieren Sie dann 3D und wählen Sie die Option für den Intensitätsbereich.

Klicken Sie nun auf Bild vorverarbeiten und wählen Sie oben aus. Erfassen Sie die maximale Intensität mit dem Schieberegler. Legen Sie dann den Schwellenwert auf 15 % der maximalen Intensität fest und notieren Sie diesen Wert.

Dies sollte den ROI in Weiß hervorheben. Legen Sie den Parameter für die Glätte auf 10 fest. Klicken Sie auf OK.

Dann als nächstes. Fügen Sie als Nächstes 10 bis 12 kleine Blasen in jeden Ventrikel hinzu. Zwei im vorderen Frontalhorn, sieben gleichmäßig verteilt entlang der oberen Oberfläche des lateralen Ventrikelkörpers, einer im Hinterhaupthorn und einer im Schläfenhorn des lateralen Ventrikels.

Wählen Sie als Nächstes Parameter aus und stellen Sie die Krümmungskraft auf 0,4 ein. Klicken Sie dann auf das Play-Symbol, um die aktive Konturentwicklung zu starten. Klicken Sie nun auf Netz aktualisieren, um die Oberfläche zu visualisieren.

Aktivieren Sie dann die Option Automatische Aktualisierung. Stoppen Sie den Segmentierungsprozess, wenn alle Bereiche des lateralen Ventrikels in der interessierenden Region enthalten sind. Vermeiden Sie die Einbeziehung des dritten Ventrikels.

Klicken Sie abschließend auf Fertig und speichern Sie die Segmentierungsergebnisse in einem raffinierten Dateiformat. Um das Gesamtvolumen des Ventrikels zu erhalten, wählen Sie Segmentierung, Volumen und Statistik aus, um das Gesamtvolumen des Ventrikels mit dem festgelegten Farbetikett zu erhalten. In diesem Segment werden longitudinale ROIs mit Hilfe von Mango-Software überlagert, um Veränderungen des Ventrikelvolumens innerhalb der Probanden im Laufe der Zeit qualitativ und quantitativ zu demonstrieren.

Klicken Sie nach dem Öffnen der Software auf Öffnen, Datei öffnen und zuvor gespeicherte Nifty-Datei laden. Nachdem die Bilddatei geladen wurde, klicken Sie auf ROI laden und laden Sie den ROI des Zeitpunkts des Baseline-ROI grün. Klicken Sie auf Datei-ROI laden und laden Sie den zweiten ROI-Zeitpunkt in Rot.

Speichern Sie das Längs-Overlay, indem Sie Datei speichern ROI auswählen und jedem Bild einen Dateinamen zuweisen, der der Konvention entspricht, die jetzt auf dem Bildschirm angezeigt wird. Öffnen Sie als Nächstes den ITK-Snap. Öffnen Sie dann den kombinierten ROI erneut als kombinierten ROI für Graustufen-Bildlast, indem Sie die Segmentierungslast aus der kombinierten ROI-Datei des Bildes auswählen, um Längsvolumendaten zu erhalten, und führen Sie das folgende Segmentierungsvolumen und die folgenden Statistiken aus.

Etikett eins ist gleich Expansionsvolumen, Etikett zwei grün entspricht Stenose Volumen Etikett drei blau entspricht Basenvolumen, beginnend mit einer intakten Hemisphäre, die maximal sechs Wochen lang in 10%Formin fixiert und gründlich mit 0,1 molaren PBS-Schnitten, 1,5 Zentimeter dicken koronalen Schnitten durch die gesamte Hemisphäre gespült wurde, wobei ein großes Messer mit einem mikrochirurgischen Skalpell verwendet wurde. Präparieren Sie die Ventrikelwand einen Zentimeter tief, wobei ein durchgehender Abschnitt für die gesamte Seitenwand beibehalten wird, und unterteilen Sie die Wand nach Bedarf, um Abschnitte in geeigneter Größe für die Färbung zu schaffen. Kerben Sie den Abschnitt auf der gegenüberliegenden Seite der Ventrikelwand gut ein.

Um die obere untere Orientierung zu identifizieren, führen Sie eine Immunhisto-Chemie durch und montieren Sie die Schnitte gemäß dem schriftlichen Protokoll. Befestigen Sie das Gewebe unter einem Präpariergerät mit Stiften mit einem mikrochirurgischen Stichmesser, erstellen Sie einen gleichmäßig dünnen Schnitt der lateralen Ventrikelwand und befestigen Sie ein Penem seitlich auf einem Objektträger. Wenn die Objektträger vollständig getrocknet sind, untersuchen Sie die Schnitte durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie. Stellen Sie die bildgebende Brennebene an der Ventrikeloberfläche ein, wie sie durch die Verwendung von Beta-Catenin, einem Marker für die apikale Adhärenz, bestimmt wird.

Verbindungsproteine von Append-Zellen. Dann werden Regionen der Bedeckung der Append-Zellen und der Oberflächen-Astrogliose gemäß GFAP-Färbung an der Ventrikeloberfläche abgegrenzt, um die gesamte Ventrikeloberfläche zu dokumentieren und zu montieren. Verwenden Sie überlappende Bilder der gesamten Oberfläche, um eine Montage von Serienbildern zu erstellen.

Öffnen Sie Adobe Photoshop und verwenden Sie das interaktive Layout "File Automate Auto Emerge", um Bilder auszuwählen, die überlagert werden sollen, und nehmen Sie bei Bedarf manuelle Anpassungen vor. Erstellen Sie eine neue Ebene, um die Montage nachzuzeichnen, um eine Cartoon-Darstellung des Intakten zu erstellen. Abhängig von der Zellbedeckung oder der G-Skoliose der Ventrikeloberfläche, kompilieren Sie alle Schnitte, um die Karte der Ventrikelwand zu rekonstruieren und die entsprechende Region in der MRT-Rekonstruktion zu verknüpfen.

Dies ist die Montage von menschlichen MRT-Bildern hier. Der laterale Ventrikel wurde als der interessierende Bereich in Rot definiert. Die hier gezeigte 3D-Bildrekonstruktion ermöglicht eine volumetrische Quantifizierung und qualitative Visualisierung des lateralen Ventrikels.

Dieses Bild zeigt die Beurteilung der longitudinalen Ventrikelexpansion bei einem älteren Patienten. Längsschnitt-MRTs von mehreren Punkten aus können ausgerichtet und überlagert werden, um die Volumenausdehnung des Ventrikels innerhalb der Probanden im Laufe der Zeit zu visualisieren und zu quantifizieren. Die letzten drei Bilder zeigen die immunhistochemische Bewertung und regionale Kartierung der Oberfläche des menschlichen lateralen Ventrikels. Hier.

Die Bereiche der intakten Append-Zellen, die durch Beta-Catine und Färbung umrandet sind, zeigen ein Kopfsteinpflaster-Aussehen, wie durch das Sternchen angezeigt, und sind durch eine gestrichelte Linie von Regionen der Astrogliose auf der Ventrikeloberfläche abgegrenzt, die durch die GFAP-Färbung umrandet sind. Serielle konfokale Bilder werden überlagert, um eine regionale Montage zu erzeugen, und mit Adobe Photoshop oder einer Cartoon-Darstellung der zellulären Organisation an der Ventrikeloberfläche nachgezeichnet. Dieses Cartoon-Bild der Montage wird auf der entsprechenden MRT-basierten 3D-Ventrikelrekonstruktion auf die Ventrikeloberfläche abgebildet.

Wie gezeigt, zeigt die grüne Farbe den intakten Anhang und die roten Bereiche der Gliose. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, jede Gewebeprobe sorgfältig zu dokumentieren, um eine serielle Rekonstruktion und Kartierung der zellulären Integrität durchführen zu können. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Subsegmentierung der lateralen Ventrikel, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur regionsspezifischen Expansion im Zeitverlauf zu beantworten.