Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zellzyklusaktivität in postnatalen Kardiomyozyten sichtbar zu machen und deren Kernanzahl zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Herzerneuerung zu beantworten, beispielsweise, ob ein Kardiomyozyt tatsächlich teilt oder lediglich seine Ploidie erhöht beziehungsweise mehrkernig wird. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass die M-Phase des Zellzyklus mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dargestellt werden kann und dass die Kerne von Kardiomyozyten mittels Fluoreszenz identifiziert werden können.

Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Patricia Freitag, eine Technikerin aus unserem Labor. Falls nicht-homozygoten Zuchtpaare verwendet werden, identifizieren Sie zunächst die transgenen Herzen mittels Fluoreszenzmikroskopie, um deren Expression von EGFP-Analin und H2B-mCherry zu überprüfen. Die nukleären Signale von EGFP-Analin lassen sich am leichtesten an den Rändern der Vorhöfe detektieren, indem durch die Gewebeschichten fokussiert wird.

Um die Kardiomyozyten zu isolieren, geben Sie die entsprechende Anzahl an Herzen in 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäße, die ein Milliliter Enzymgemisch aus einem Kit zur Dissoziation neonataler Herzen enthalten, und schneiden Sie die Herzen mit einer Schere in kleine Stücke. Überführen Sie anschließend die Lösung in 15-Milliliter-Reaktionsgefäße. Stellen Sie das Gefäß für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in nahezu horizontale Position und mischen Sie das Gewebe am Ende der Inkubation fünf bis zehn Mal mit einer 5-Milliliter-Pipette.

Am Ende der dritten Verdauung die Reaktion mit 7,5 Milliliter Medium zwei stoppen und die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb filtern. Das Zellsieb mit drei Milliliter Medium zwei ausspülen, die Waschflüssigkeit mit den gesammelten Zellen vereinen und die Zellen durch Zentrifugation gewinnen. Den Pellet in 500 Mikroliter Medium eins zur Zellzählung resuspendieren.

Dann säen Sie eine mal zehn hoch vier Zellen pro Vertiefung in 120 Mikrolitern Medium 1 in einer 96-Loch-Flachbodenplatte aus und zentrifugieren Sie die Zellen, bevor sie über Nacht in einem Zellkulturgehäuse kultiviert werden. Am nächsten Tag sollten die meisten Kardiomyozyten schlagen. Vor Beginn der Transfektion wischen Sie die Arbeitsfläche und alle Materialien für die Transfektion mit einer RNase-Entkontaminationslösung ab, um jegliche RNase zu entfernen.

Wenn alle Materialien bereitstehen, geben Sie 20 µL frisch zubereiteter siRNA-Mischung in jede Vertiefung und stellen Sie die Zellen für 48 Stunden in den Inkubator zurück. Nach zwei Tagen ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch 120 µL Medium eins und stellen Sie die Zellen für mindestens weitere 24 Stunden in den Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fixieren sie anschließend 20 Minuten lang in 4 %iger Formaldehydlösung.

Um die Zellen mittels konfokaler Videomikroskopie zu analysieren, überführen Sie die Platte auf den Objekttisch des konfokalen Mikroskops und starten Sie die Bildgebungssoftware. Öffnen Sie die A1plus-Einstellungen und aktivieren Sie die Kanäle eins, zwei, drei und vier. Wählen Sie im Dropdown-Menü Kanal eins für DAPI, Kanal zwei für eGFP, Kanal drei für RFP und Kanal vier für Cy5.

Klicken Sie auf die Kanal-Spannung und verwenden Sie die Schieberegler, um die Spannung für jeden Kanal auf 80 einzustellen. Verwenden Sie die Schieberegler, um den Offset auf null zu setzen, und klicken Sie auf die Schaltfläche „Home“, um die Blende in die Ausgangsposition zu bringen. Stellen Sie die Scan-Größe im Dropdown-Menü auf 1024 mal 1024 Pixel ein.

Klicken Sie auf „Optimieren“, um das Fenster für die XYZ-Größeneinstellung zu öffnen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für den idealen Voxel unter dem vorgeschlagenen Schritt Z. Wählen Sie das 20x-Objektiv aus und passen Sie die Laserintensitäten an, bis das Bild weder unter- noch überbelichtet ist. Sobald alle Parameter eingestellt sind, öffnen Sie das Erfassungsmenü. Wählen Sie „Großes Bild scannen“ und anschließend „Aktuelle Position ist oben links“ unter Bereich.

Stellen Sie anschließend die Anzahl der Felder in X und Y auf drei mal drei ein und klicken Sie auf „Scan“. Um die Anzahl der Kardiomyozytenkerne zu bestimmen, klicken Sie auf „Measure“, „Manual Measurement“ und „Counts“. Wählen Sie die Kerne mit H2B-mCherry-Signalen aus, um sie dadurch zu markieren und zu zählen.

Danach die Alpha-Aktinin-positiven Zellen auswählen, um die Anzahl der Kardiomyozyten zu bestimmen. Um die Kardiomyozyten in der G1-, S- und G2-Phase mit nukleären EGFP-Analin-Signalen zu zählen, wählen Sie „Messen“, „Manuelle Messung“ und „Zählungen“. Markieren Sie die Kerne, die EGFP-Analin und H2B-mCherry exprimieren, durch Anklicken und zählen Sie manuell die Kardiomyozyten mit den mitose-spezifischen EGFP-Analin-Signalen wie kontraktilen Ringen und Mittelkörpern.

Klicken Sie anschließend auf „Messen“, „Manuelle Messung“ und „Zählungen“ und markieren Sie die Kardiomyozyten mit mitose-spezifischen EGFP-Analin-Signalen, zytoplasmatischen Signalen, kontraktilen Ringen und Mittelkörpern. Im Vergleich zu den negativen Kontrollen zeigen die mit miRNA und siRNA transfizierten Kardiomyozyten eine Induktion der Zellzyklusaktivität. Kardiomyozyten, die eine Endoreduplikation durchlaufen, weisen einen ausschließlich nukleären EGFP-Analin-Ausdruck auf, während Kardiomyozyten, die eine Zellteilung durchlaufen, EGFP-Analin-Ausdruck in für die M-Phase typischen Lokalisationen zeigen.

Nach der enzymatischen Verdauung des Herdgewebes am Langendorff-Apparat können die Vorhöfe und Ventrikel mechanisch getrennt und unabhängig voneinander analysiert werden, wodurch die Visualisierung von H2B-mCherry-transgenen ventrikulären Kardiomyozyten mit einer hohen Anzahl H2B-mCherry-positiver binukleärer Kardiomyozyten ermöglicht wird. Im Gegensatz dazu sind die meisten atrialen Kardiomyozyten mononukleär. Die enzymatische Verdauung führt nicht zu einer 100%igen Einzelzellpopulation, wobei durch die Alpha-Aktinin-Färbung ein Muster von Querstreifungen sichtbar wird, was die Unterscheidung zwischen binukleären Kardiomyozyten – erkennbar als kontinuierliches Muster von Querstreifungen – und Zelldoppelten weiter erleichtert.

Um den Bi-Nukleationsindex von Kardiomyozyten in dicken Schnitten zu analysieren, ist es notwendig, manuell durch den Stapel zu scrollen, da die Kerne nicht unbedingt in einer einzigen Z-Ebene liegen, wobei die Färbung mit Weizenkeimagglutinin die Detektion der Zellgrenzen ermöglicht. 3D-Rekonstruktionen fixierter Schnitte von adulten transgenen Mausherzen ermöglichen die Detektion und automatisierte Zählung von Haken, gefärbten und H2B-mCherry-positiven Kernen, um den Anteil der Kardiomyozytenkerne unter physiologischen Bedingungen im Gewebe zu bestimmen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Herzdissoziation in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, kontinuierlich weiterzuarbeiten, um die Lebensfähigkeit der Zellen während des gesamten Experiments aufrechtzuerhalten. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, Mikro-RNAs oder andere kleine Substanzen auf ihre proliferationsinduzierenden Wirkungen in postnatalen Kardiomyozyten zu untersuchen.