Name: Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Visualisierung von Zellzyklusaktivität und Nukleation in postnatalen Kardiomyozyten transgener Mäuse. Diese Technik ermöglicht hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie für die Herzregeneration.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken S. Grünberg (Bonn, Deutschland) und P. Freitag (Bonn, Deutschland) für ihre technische Unterstützung.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es gibt eine Kontroverse darüber, ob Kardiomyozyten können den Zellzyklus und teilen sich nach der Verletzung und während der Gewebehomöostase erneut einzugeben. Werte für den Grundumsatz von Kardiomyozyten wurden im Bereich zwischen 1% und 80% 1 7 angegeben. Auch nach einer kardialen Läsion, die Induktion von Zellzyklusaktivität und die Erzeugung neuer Kardiomyozyten wurde in der Grenzzone berichtet, wobei Werte zwischen 0,0083% 8 und 25 - 40% <sup...

Die korrekte Identifizierung von Kardiomyozyten Kerne und der Zellzyklusstatus ist von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung der Herzmuskel Umsatz und Regeneration. Dies gilt insbesondere für die Nutzung der Kernmarker wie pHH3, Ki-67, oder Thymidin-Analoga, für die Zellzyklusaktivität identifiziert. Da die proliferative Kapazität von erwachsenen Säugetieren Kardiomyozyten ist sehr klein 1, eine falsche Identifizierung eines Kerns für eine positive Proliferationsmarker eines Kardiomyozyten Kern einen entscheidenden Unterschied in dem Ergebnis eines Proliferationsassay machen könnte. Außerdem sind Kardiomyozyten anfällig für Schwankungen in den Zellzyklus, wie Endoreduplikation und acytokinetic Mitose, die in polyploiden und mehrkernige Zellen führen, anstatt in der Zellteilung. Zu diesem Zweck ist die Interpretation der Antikörperfärbung gegen gemeinsame Zellzyklus-Marker in allen Fällen nicht schlüssig. Hier präsentieren wir Methoden für die lineare forwa<html> rd Anerkennung der Maus Kardiomyozyten und ihre Nuklearität in nativen isolierten Zellen und dicke Gewebeschnitte bei postnatalen und adulten Stadien durch die eindeutige Identifizierung ihrer Kerne. Zu diesem Zweck wird eine transgene Mauslinie mit Kardiomyozyten-spezifische Expression eines Fusionsproteins bestehend aus humanem Histon H2B und mCherry unter der Kontrolle des Promotors Myh6 (Myh6-H2B-MCH) 2 verwendet. Kreuz-Zucht Mauslinie mit einer transgenen Proliferation Indikator Mauslinie, in denen die Expression eines eGFP-Anillin Fusionsprotein unter der Kontrolle des allgegenwärtigen Huhn-Aktin-Promotor mit einem CMV-Enhancer (CAG-eGFP-Anillin), ermöglicht die Bestimmung der Zellzyklus-Status. Das Gerüstprotein Anillin wird in Zellzyklus - aktiven Zellen 3 und seine differentielle subzelluläre Lokalisierung während des Zellzyklus ermöglicht Live-tracking Zellzyklusprogression mit einer hohen Auflösung von M-Phase spezifisch exprimiertef &quot;&gt; 4. Daher kann der doppelt transgenen Mäuse verwendet werden , um zwischen proliferierenden Kardiomyozyten und diejenigen zu unterscheiden , die Zellzyklus - Variationen unterzogen werden . Dies erweist sich als besonders nützlich beim Screening auf die Proliferation induzierenden Substanzen in vitro.

<table><tbody><tr><td>10 cm</td><td>Petrischale Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 & micro; m cell Sieb</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butandion-Monoxim (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; Injektionskanüle, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>20 Gauge Nadel</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927,1</td><td></td></tr><tr><td>37%ige Formaldehydlösung</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>3-Wege-Absperrhahn</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Aktinin EA-53, Maus IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Mikroplatte, 96 Well, </td><td>Halbflächen-Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>konfokales Mikroskop Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kryostat CM 3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>fötales Kälberserum</td><td>PromoCell, Heidelberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung (4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut, Typ A</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger Verlängerungshülse</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond Objektträger</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG Cy5 (Esel)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Shaker</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Mold</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td></td><td>ibidi 80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>negativ control (scrambled RNA)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Dissoziationskit für Neugeborene</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; </td><td></td><td></td>brussels</tr><tr><td>non essential amino acids, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Reduced Serum</td><td>Medium Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Einbettmedium aus Polyvinylalkohol mit DABCO&reg;, antifading</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Probenbehälter</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 Jodid (642/661)</td><td>Molekular Sonden/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Weizenkeim-Agglutinin (WGA) Fluorescein markiert</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Aktinin Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von zellzyklus-variationen und bestimmung der nukleation in postnatale kardiomyozyten

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Kardiomyozyten sind anfällig für Variationen des Zellzyklus, wie z.B. Endoreduplikation (fortlaufende Runden der DNA-Synthese ohne Karyokinese und Zytokinese) und azytokinetische Mitose (Karyokinese, aber keine Zytokinese). Solche atypischen Zellzyklusvariationen führen eher zu polyploiden und mehrkernigen Zellen als zu Zellteilung. Daher ist es für die Bestimmung des Herzumsatzes und der Regeneration von entscheidender Bedeutung, die Kardiomyozytenkerne, die Anzahl der Zellkerne pro Zelle und ihren Zellzyklusstatus korrekt zu identifizieren. Dies gilt insbesondere für die Verwendung von nukleären Markern zur Identifizierung der Zellzyklusaktivität, wie z. B. Thymidinanaloga Ki-67, PCNA oder pHH3. Im Folgenden stellen wir Methoden vor, um Kardiomyozyten und ihre Kernkraft zu erkennen und ihre Zellzyklusaktivität zu bestimmen. Wir verwenden zwei veröffentlichte transgene Systeme: die transgene Mauslinie Myh6-H2B-mCh, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und die CAG-eGFP-Anillin-Mauslinie, zur Unterscheidung von Zellteilung und Zellzyklusvariationen. In Kombination erleichtern diese beiden Systeme die Untersuchung der kardialen Regeneration und Plastizität.

Um die Effekte von siRNAs / miRNAs auf der Zellzyklusaktivität der postnatalen Kardiomyozyten in vitro, Kardiomyozyten von Doppel transgenen Myh6-H2B-mCh / CAG-eGFP-Anillin Mäuse wurden isoliert auf postnatalen Tag 3 (P3) und transfizierte zu analysieren mit Zellzyklusaktivität auslösenden miR199 5, siRNA p27 und siRNA Fzr1. Im Vergleich zur Negativkontrolle (Abbildung 1A), die Bilder von miR199- (Abbildung 1B) und p27- s...

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zellzyklusaktivität in postnatalen Kardiomyozyten sichtbar zu machen und deren Kernanzahl zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Herzerneuerung zu beantworten, beispielsweise, ob ein Kardiomyozyt tatsächlich teilt oder lediglich seine Ploidie erhöht beziehungsweise mehrkernig wird. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass die M-Phase des Zellzyklus mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dargestellt werden kann und dass die Kerne von Kardiomyozyten mittels Fluoreszenz identifiziert werden können.Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Patricia Freitag, eine Technikerin aus unserem Labor. Falls nicht-homozygoten Zuchtpaare verwendet werden, identifizieren Sie zunächst die transgenen Herzen mittels Fluoreszenzmikroskopie, um deren Expression von EGFP-Analin und H2B-mCherry zu überprüfen. Die nukleären Signale von EGFP-Analin lassen sich am leichtesten an den Rändern der Vorhöfe detektieren, indem durch die Gewebeschichten fokussiert wird.Um die Kardiomyozyten zu isolieren, geben Sie die entsprechende Anzahl an Herzen in 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäße, die ein Milliliter Enzymgemisch aus einem Kit zur Dissoziation neonataler Herzen enthalten, und schneiden Sie die Herzen mit einer Schere in kleine Stücke. Überführen Sie anschließend die Lösung in 15-Milliliter-Reaktionsgefäße. Stellen Sie das Gefäß für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in nahezu horizontale Position und mischen Sie das Gewebe am Ende der Inkubation fünf bis zehn Mal mit einer 5-Milliliter-Pipette. Am Ende der dritten Verdauung die Reaktion mit 7,5 Milliliter Medium zwei stoppen und die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb filtern. Das Zellsieb mit drei Milliliter Medium zwei ausspülen, die Waschflüssigkeit mit den gesammelten Zellen vereinen und die Zellen durch Zentrifugation gewinnen. Den Pellet in 500 Mikroliter Medium eins zur Zellzählung resuspendieren.Dann säen Sie eine mal zehn hoch vier Zellen pro Vertiefung in 120 Mikrolitern Medium 1 in einer 96-Loch-Flachbodenplatte aus und zentrifugieren Sie die Zellen, bevor sie über Nacht in einem Zellkulturgehäuse kultiviert werden. Am nächsten Tag sollten die meisten Kardiomyozyten schlagen. Vor Beginn der Transfektion wischen Sie die Arbeitsfläche und alle Materialien für die Transfektion mit einer RNase-Entkontaminationslösung ab, um jegliche RNase zu entfernen.Wenn alle Materialien bereitstehen, geben Sie 20 µL frisch zubereiteter siRNA-Mischung in jede Vertiefung und stellen Sie die Zellen für 48 Stunden in den Inkubator zurück. Nach zwei Tagen ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch 120 µL Medium eins und stellen Sie die Zellen für mindestens weitere 24 Stunden in den Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fixieren sie anschließend 20 Minuten lang in 4 %iger Formaldehydlösung.Um die Zellen mittels konfokaler Videomikroskopie zu analysieren, überführen Sie die Platte auf den Objekttisch des konfokalen Mikroskops und starten Sie die Bildgebungssoftware. Öffnen Sie die A1plus-Einstellungen und aktivieren Sie die Kanäle eins, zwei, drei und vier. Wählen Sie im Dropdown-Menü Kanal eins für DAPI, Kanal zwei für eGFP, Kanal drei für RFP und Kanal vier für Cy5.Klicken Sie auf die Kanal-Spannung und verwenden Sie die Schieberegler, um die Spannung für jeden Kanal auf 80 einzustellen. Verwenden Sie die Schieberegler, um den Offset auf null zu setzen, und klicken Sie auf die Schaltfläche „Home“, um die Blende in die Ausgangsposition zu bringen. Stellen Sie die Scan-Größe im Dropdown-Menü auf 1024 mal 1024 Pixel ein.Klicken Sie auf „Optimieren“, um das Fenster für die XYZ-Größeneinstellung zu öffnen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für den idealen Voxel unter dem vorgeschlagenen Schritt Z. Wählen Sie das 20x-Objektiv aus und passen Sie die Laserintensitäten an, bis das Bild weder unter- noch überbelichtet ist. Sobald alle Parameter eingestellt sind, öffnen Sie das Erfassungsmenü. Wählen Sie „Großes Bild scannen“ und anschließend „Aktuelle Position ist oben links“ unter Bereich.Stellen Sie anschließend die Anzahl der Felder in X und Y auf drei mal drei ein und klicken Sie auf „Scan“. Um die Anzahl der Kardiomyozytenkerne zu bestimmen, klicken Sie auf „Measure“, „Manual Measurement“ und „Counts“. Wählen Sie die Kerne mit H2B-mCherry-Signalen aus, um sie dadurch zu markieren und zu zählen.Danach die Alpha-Aktinin-positiven Zellen auswählen, um die Anzahl der Kardiomyozyten zu bestimmen. Um die Kardiomyozyten in der G1-, S- und G2-Phase mit nukleären EGFP-Analin-Signalen zu zählen, wählen Sie „Messen“, „Manuelle Messung“ und „Zählungen“. Markieren Sie die Kerne, die EGFP-Analin und H2B-mCherry exprimieren, durch Anklicken und zählen Sie manuell die Kardiomyozyten mit den mitose-spezifischen EGFP-Analin-Signalen wie kontraktilen Ringen und Mittelkörpern.Klicken Sie anschließend auf „Messen“, „Manuelle Messung“ und „Zählungen“ und markieren Sie die Kardiomyozyten mit mitose-spezifischen EGFP-Analin-Signalen, zytoplasmatischen Signalen, kontraktilen Ringen und Mittelkörpern. Im Vergleich zu den negativen Kontrollen zeigen die mit miRNA und siRNA transfizierten Kardiomyozyten eine Induktion der Zellzyklusaktivität. Kardiomyozyten, die eine Endoreduplikation durchlaufen, weisen einen ausschließlich nukleären EGFP-Analin-Ausdruck auf, während Kardiomyozyten, die eine Zellteilung durchlaufen, EGFP-Analin-Ausdruck in für die M-Phase typischen Lokalisationen zeigen.Nach der enzymatischen Verdauung des Herdgewebes am Langendorff-Apparat können die Vorhöfe und Ventrikel mechanisch getrennt und unabhängig voneinander analysiert werden, wodurch die Visualisierung von H2B-mCherry-transgenen ventrikulären Kardiomyozyten mit einer hohen Anzahl H2B-mCherry-positiver binukleärer Kardiomyozyten ermöglicht wird. Im Gegensatz dazu sind die meisten atrialen Kardiomyozyten mononukleär. Die enzymatische Verdauung führt nicht zu einer 100%igen Einzelzellpopulation, wobei durch die Alpha-Aktinin-Färbung ein Muster von Querstreifungen sichtbar wird, was die Unterscheidung zwischen binukleären Kardiomyozyten – erkennbar als kontinuierliches Muster von Querstreifungen – und Zelldoppelten weiter erleichtert.Um den Bi-Nukleationsindex von Kardiomyozyten in dicken Schnitten zu analysieren, ist es notwendig, manuell durch den Stapel zu scrollen, da die Kerne nicht unbedingt in einer einzigen Z-Ebene liegen, wobei die Färbung mit Weizenkeimagglutinin die Detektion der Zellgrenzen ermöglicht. 3D-Rekonstruktionen fixierter Schnitte von adulten transgenen Mausherzen ermöglichen die Detektion und automatisierte Zählung von Haken, gefärbten und H2B-mCherry-positiven Kernen, um den Anteil der Kardiomyozytenkerne unter physiologischen Bedingungen im Gewebe zu bestimmen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Herzdissoziation in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, kontinuierlich weiterzuarbeiten, um die Lebensfähigkeit der Zellen während des gesamten Experiments aufrechtzuerhalten. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, Mikro-RNAs oder andere kleine Substanzen auf ihre proliferationsinduzierenden Wirkungen in postnatalen Kardiomyozyten zu untersuchen.

visualization-cell-cycle-variations-determination-nucleation

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Cardiac Kerne über Dichte Sedimentation isoliert und mit Antikörpern gegen immunmarkiert pericentriolar Material 1 (PCM-1) zu identifizieren und zu sortieren Kardiomyozyten Kerne durch Durchflusszytometrie.

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Mutationen, die zu angeborenen Herzfehlern führen, profitieren von der in vivo Untersuchung der Herzstruktur während der Entwicklung, aber hochauflösende Strukturstudien im embryonalen Herzen der Maus sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Immunfluoreszenz- und Bildanalysemethode vor, um Kardiomyozyten-spezifische Strukturen im sich entwickelnden Mausherz zu beurteilen.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Die Quantifizierung des Kardiomyozytenumsatzes ist eine Herausforderung. Das hier beschriebene Protokoll leistet einen wichtigen Beitrag zu dieser Herausforderung, indem es eine genaue und empfindliche Quantifizierung der Bildung von Neokardiomyozytenkernen und der Kernploidie ermöglicht.

Die gleichzeitige Bewertung der Cardiomyocyte DNA-Synthese und Ploidy: Ein Verfahren zur Förderung des Quantifizierung von Cardiomyocyte Regeneration und Umsatz

Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Herkömmliche Verfahren Aufhängungsaggregat Cardiac Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind geplagt mit Kultur Heterogenität bezüglich Aggregatgröße und Form zu initiieren. Hier beschreiben wir eine robuste Methode zur kardialen Differenzierung Mikrotitervertiefungen Verwendung Größe gesteuert erzeugen HPSC kultiviert Aggregate unter Herzfördernden Bedingungen.

Aggregate Größenoptimierung in Mikrotiterplattenvertiefungen für Abhänge-basierte Herz Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode zu entwickeln, um Kardiomyozyten reproduzierbar vom Erwachsenenherz zu isolieren und DEN DNA-Gehalt und die Keimbildung zu messen.

Isolierung von Kardiomyozyten aus festen Herzen für die Immunzytochemie und Ploidie-Analyse

Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten eine Alternative zur Verwendung von Tieren für das präklinische Kardiotoxizitäts-Screening. Eine Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von hiPSC-CMs im präklinischen Toxizitätsscreening ist der unreife, fetale Phänotyp der Zellen. Hier werden Protokolle für eine robuste und schnelle Reifung von hiPSC-CMs vorgestellt.

Hochdurchsatz-Kardiotoxizitäts-Screening unter Verwendung von reifen, humaninduzierten pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten-Monoschichten

Erfahren Sie Methoden zur Visualisierung von Zellzyklusaktivität und Nukleation in postnatalen Kardiomyozyten transgener Mäuse. Diese Technik ermöglicht hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie für die Herzregeneration.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Weitere Videos entdecken