Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zellzyklusaktivität in postnatalen Kardiomyozyten sichtbar zu machen und deren Kernkraft zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der kardialen Regeneration zu beantworten, z. B. teilt sich ein Kardiomyozyten wirklich oder erhöht er nur seine Ploidie oder wird er mehrkernig? Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die M-Phase des Zellzyklus in hoher räumlich-zeitlicher Auflösung sichtbar gemacht werden kann und dass Kardiomyozytenkerne durch Fluoreszenz identifiziert werden können.

Verfahren wird von Patricia Freitag, einer Technikerin aus unserem Labor, vorgeführt. Bei Verwendung von nicht-homozygoten Zuchtpaaren sind zunächst die transgenen Herzen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu identifizieren, um ihre EGFP-Analin- und H2B-mCherry-Expression zu überprüfen. Die Kernsignale des EGFP-Analyins können am einfachsten an den Rändern der Vorhöfe nachgewiesen werden, indem sie durch die Gewebeschichten hindurch fokussiert werden.

Um die Kardiomyozyten zu isolieren, geben Sie die entsprechende Anzahl von Herzen in 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen, die einen Milliliter Enzymmischung aus einem Herzdissoziationskit für Neugeborene enthalten, und schneiden Sie die Herzen mit einer Schere in kleine Stücke. Füllen Sie dann die Lösung in 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen um. Platzieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang in einer fast waagerechten Position bei 37 Grad Celsius und mischen Sie das Gewebe am Ende der Inkubation fünf- bis zehnmal mit einer Fünf-Milliliter-Pipette.

Am Ende des dritten Aufschlusses stoppen Sie die Reaktion mit 7,5 Millilitern Medium zwei und filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb. Spülen Sie das Zellsieb mit drei Millilitern Medium zwei, poolen Sie die Wäsche mit den gesammelten Zellen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet zum Zählen in 500 Mikrolitern Medium eins.

Dann säen Sie eine mal zehn bis die vierte Zellte pro Vertiefung in 120 Mikroliter Medium eins in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden und zentrifugieren Sie die Zellen vor ihrer Übernachtkultur in einem Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Tag sollten die meisten Kardiomyozyten schlagen. Wischen Sie vor Beginn der Transfektion die Bank und alle Transfektionsmaterialien mit RNAse-Dekontaminationslösung ab, um RNAse zu entfernen.

Wenn alle Materialien fertig sind, geben Sie 20 Mikroliter frisch zubereitete siRNA-Mischung in jede Vertiefung und stellen Sie die Zellen für 48 Stunden in den Inkubator zurück. Ersetzen Sie nach zwei Tagen den Überstand in jeder Vertiefung durch 120 Mikroliter Medium eins und stellen Sie die Zellen für mindestens weitere 24 Stunden in den Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, gefolgt von einer 20-minütigen Fixierung in 4%iger Formaldehydlösung.

Um die Zellen mit der konfokalen Videomikroskopie zu analysieren, übertragen Sie die Platte auf den konfokalen Mikroskoptisch und starten Sie die Bildgebungssoftware. Öffnen Sie die A1plus-Einstellungen und aktivieren Sie die Kästchen Kanal eins, zwei, drei und vier. Legen Sie im Pulldown-Menü Kanal eins auf DAPI, Kanal zwei auf eGFP, Kanal drei auf RFP und Kanal vier auf Cy5 fest.

Klicken Sie auf die Kanalspannung und verwenden Sie die Schieberegler, um die Spannung für jeden Kanal auf 80 einzustellen. Verwenden Sie die Schieberegler, um den Versatz auf Null zu setzen, und klicken Sie auf die Home-Schaltfläche, um die Lochblende auf die Ausgangsposition zu setzen. Stellen Sie die Scangröße im Pulldown-Menü auf 1024 x 1024 Pixel ein.

Klicken Sie auf Optimieren, um das Fenster zum Einrichten der XYZ-Größe zu öffnen, und aktivieren Sie das perfekte Voxel-Kästchen unter dem vorgeschlagenen Schritt Z.Wählen Sie das 20-fach-Objektiv aus und passen Sie die Laserintensitäten an, bis das Bild weder unter- noch überbelichtet ist. Wenn alle Parameter eingestellt sind, öffnen Sie das Erfassungsmenü. Wählen Sie "Großes Bild scannen" und wählen Sie dann die aktuelle Position in der oberen linken Ecke unter dem Bereich.

Legen Sie dann die Anzahl der Felder in X und Y auf drei mal drei fest und klicken Sie auf Scannen. Um die Anzahl der Kardiomyozytenkerne zu definieren, klicken Sie auf Messen, Manuelle Messung und Anzahl. Selektieren Sie die Kerne mit H2B-mCherry-Signalen, markieren und zählen Sie sie.

Wählen Sie dann die Alpha-Actinin-positiven Zellen aus, um die Anzahl der Kardiomyozyten zu bestimmen. Um die Kardiomyozyten der G1-, S- und G2-Phase mit nukleären EGFP-Analinsignalen zu zählen, wählen Sie Messen, manuelle Messung und Zählen. Markieren Sie die EGFP-Analin- und H2B-mCherry-exprimierenden Kerne mit einem Klick und zählen Sie die Kardiomyozyten manuell mit den Mitose-spezifischen EGFP-Analinsignalen, wie z. B. kontraktile Ringe und Mittelkörper.

Klicken Sie dann auf Messen, manuelle Messung und Zählung und klicken Sie auf die Kardiomyozyten mit Mitose-spezifischen EGFP-Analinsignalen, zytoplasmatischen Signalen, kontraktilen Ringen und Mittelkörpern. Im Vergleich zu den Negativkontrollen zeigen die miRNA- und siRNA-transfizierten Kardiomyozyten eine Induktion der Zellzyklusaktivität. Kardiomyozyten, die eine Endoreduplikation durchführen, weisen eine ausschließlich nukleäre EGFP-Analinexpression auf, während Kardiomyozyten, die sich einer Zellteilung unterziehen, eine EGFP-Analinexpression in M-Phase-typischen Lokalisationen aufweisen.

Nach enzymatischer Verdauung des Herzgewebes am Langendorff-Apparat können die Vorhöfe und Ventrikel mechanisch getrennt und unabhängig voneinander analysiert werden, was die Visualisierung von H2B-mCherry-transgenen ventrikulären Kardiomyozyten mit einer hohen Anzahl von H2B-mCherry-positiven zweikernigen Kardiomyozyten ermöglicht. Im Gegensatz dazu ist die Mehrzahl der atrialen Kardiomyozyten einkernig. Die enzymatische Verdauung führt nicht dazu, dass eine 100%ige Einzelzellpopulation ein Muster der Kreuzstreifung durch Alpha-Aktinin-Färbung aufweist, was die Unterscheidung zwischen zweikernigen Kardiomyozyten als kontinuierliches Muster von Kreuzstreifung und Zelldubletten weiter erleichtert.

Um den Bi-Nukleationsindex von Kardiomyozyten in dicken Schichten zu analysieren, ist es notwendig, manuell durch den Stapel zu scrollen, da die Zellkerne nicht notwendigerweise innerhalb einer Z-Ebene liegen, wobei die Weizenkeim-Agglutinin-Färbung den Nachweis der Zelle ermöglicht borders. 3D Rekonstruktionen von fixierten Scheiben adulter transgener Mausherzen die Detektion und automatische Zählung von Haken ermöglichen, gefärbte und H2B-mCherry-positive Zellkerne zur Bestimmung des Anteils von Kardiomyozytenkernen unter physiologischen Bedingungen innerhalb des Gewebes. Einmal gemeistert, kann die Dissoziation des Herzens in zwei bis drei Stunden abgeschlossen sein, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, kontinuierlich daran zu arbeiten, die Lebensfähigkeit der Zellen während des gesamten Experiments zu erhalten. Nach diesem Verfahren ist es möglich, microRNAs oder andere kleine Substanzen auf ihre proliferationsinduzierende Wirkung in postnatalen Kardiomyozyten zu untersuchen.