Knochen konditioniertem Medium: Vorbereitung und Bioassay

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, zu beschreiben, wie man knochenkonditioniertes Medium herstellt und seine Aktivität in vitro testet. Dazu werden zunächst Knochenspäne aus einem Schweineunterkiefer mit einem Knochenschaber entnommen. Der zweite Schritt besteht darin, die Knochenchips vor der 24-stündigen Inkubation in Kulturmedium zu erhitzen, zu behandeln, zu demineralisieren oder nichts zu tun.

Als nächstes wird das knochenkonditionierte Medium gesammelt, das alle Faktoren enthält, die von den Knochenspänen freigesetzt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen mit dem knochenkonditionierten Medium zu stimulieren oder ein Biomaterial mit dem knochenkonditionierten Medium und den darauf befindlichen Samenzellen nach der Inkubationszeit vorzuinkubieren. Letztendlich wird die quantitative real-time PCR verwendet, um Veränderungen in der Genexpression der Zellen nach der Behandlung zu zeigen.

Die Verwendung von autologen Knochentransplantaten allein oder in Kombination mit anderen Biomaterialien stimuliert die Knochenregeneration bei periimplantären Knochendefekten und sorgt so für langfristig gute Ergebnisse. Dieses Video zeigt einen in vitro Bioassay, der nützlich ist, um die genetische Reaktion von Massenzellen auf die Biomoleküle im Knochenzustand zu bestimmen. Mittel Knochenzustand mittel kann helfen, wichtige Fragen im Bereich Trauma, Kiefer- und Zahnmedizin zu beantworten, z. B. warum autologer Knochen das Ziel eines Standardtransplantats bei der Knochenregeneration ist.

Die Herstellung von Bedingungsmedium aus bearbeitetem Knochen, wie z. B. wärmebehandeltes Knochenautotransplantat oder isierte Knochenmatrix, kann schwierig zu standardisieren sein. Daher ist es wichtig, präzise zu sein. Besorgen Sie sich zunächst frische Schweinemandibeln von einem örtlichen Metzger und legen Sie sie auf eine feste Unterlage.

Verwenden Sie als Nächstes ein Periost, um einen Lappen des Periosts in voller Dicke freizugeben, wobei Sie besonders darauf achten, dass kein Weichgewebe am Knochen haftet. Sobald das Periost entfernt ist, halten Sie den Knochenschaber fest und entnehmen Sie mit langen Bewegungen Knochenspäne von der bukkalen Seite des Unterkiefers. Entsorgen Sie alle Knochensplitter, die kleiner als einen Millimeter sind.

Verhindern Sie das Austrocknen der Knochenspäne, indem Sie sie in einer 10 Zentimeter großen Petrischale schnell mit Nährboden abdecken. Nachdem genügend Knochenspäne gesammelt wurden, bereiten Sie eine Charge zur thermischen Kontrolle vor, indem Sie fünf Gramm der Knochenspäne pasteurisieren. Pasteurisieren Sie die Chips, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius erhitzen oder 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren.

Bereiten Sie als Nächstes eine demineralisierte Kontrolle vor, indem Sie fünf Gramm Knochenspäne in eine einmolare Salzsäurelösung geben und sie vier bis sechs Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einen Schüttler legen. Waschen Sie dann die Knochenchips wiederholt mit Kulturmedium, bis ein neutraler pH-Wert erreicht ist. Fünf Gramm frische Knochenchips und jeweils fünf Gramm der Kontrollpräparate werden in separate Schalen gegeben und 10 Milliliter frisches Nährmedium in jede Schale gegeben.

Anschließend werden die Proben in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 Grad Celsius 24 Stunden lang inkubiert, um am nächsten Tag das konditionierte Medium herzustellen. Nehmen Sie das Medium aus jeder Schale und geben Sie es in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das knochenkonditionierte Medium 10 Minuten lang bei der 200-fachen Schwerkraft, um Ablagerungen zu entfernen.

Entfernen Sie dann den Überstand und passieren Sie ihn durch einen 0,2-Mikron-Sterilfilter. Lagern Sie die Ali-Quads gefroren bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Beginnen Sie mit der Aussaat menschlicher mesenchymaler Zellen wie Knochenzellen oder gingivaler und parodontaler Bandfibroblasten in eine 12-Wal-Platte in einer Konzentration von 30.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Decken Sie die Zellen mit Wachstumsmedium ab und lassen Sie die Zellen am nächsten Morgen über Nacht an der Platte haften.

Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem PBS bei 37 Grad Celsius. Stimulieren Sie dann die Zellen, indem Sie vorwarmes serumfreies Kulturmedium mit und ohne 20% knochenkonditioniertes Medium hinzufügen. Wenn auch die Absorptionsfähigkeit eines Biomaterials getestet wird, geben Sie das knochenkonditionierte Medium, einschließlich aller Kontrollen, zu den Röhrchen, die das betreffende Biomaterial enthalten, und inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Spülen Sie dann das Biomaterial kräftig mit vorgewärmtem PBS ab und säen Sie menschliche mesenchymale Zellen in einer Konzentration von 30.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf das Material. Inkubieren Sie die Zellen allein oder die auf den Biomaterialien besiedelten Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 Grad CS für 24 Stunden. Entsorgen Sie dann das Nährmedium.

Spülen Sie die Zellen mit vorwarmem PBS und extrahieren Sie die RNA der Zellen unter Verwendung eines Standard-RNA-Isolierungsprotokolls. Sobald die RNA isoliert wurde, bereiten Sie CD-NA-Proben jeder Behandlungsgruppe vor, indem Sie mit gleichen Konzentrationen der extrahierten RNA beginnen und eine reverse Transkriptase-Reaktion an jeder Probe durchführen. Führen Sie dann eine quantitative Echtzeit-PCR an den Proben durch, um unter Verwendung der im Begleittextprotokoll aufgeführten Primer und Bedingungen nach Konzentrationen ausgewählter Gene zu suchen.

Berechnen Sie schließlich die Qualität des knochenkonditionierten Mediums auf der Grundlage der relativen Genexpressionsniveaus, indem Sie mit der Delta-Delta-CT-Methode auf Zyklusschwellenwerte der Gene auf das Haushaltsgen Gabb dh normalisieren. Hier sind einige typische Ergebnisse, die die Veränderungen in der Genexpression von oralen Fibroblasten zeigen, die 24 Stunden lang knochenkonditioniertem Medium ausgesetzt waren. Zwei Gene, Adrenalin und Pent Trax und drei, wurden beide signifikant auf 40% des ursprünglichen Niveaus herunterreguliert, während die Interleukine 11 und 33 zusammen mit N-A-D-P-H-Oxidase vier und Prot-Glykan vier bis zu 200-fach hochreguliert wurden.

Interessanterweise absorbieren Kollagenbarrieremembranen, die verwendet werden, um die Knochenspäne vom umgebenden Weichgewebe abzuschirmen, einen Großteil des knochenkonditionierten Mediums, das für die Veränderungen in der Genexpression verantwortlich ist. Die Kollagenmembranen konnten jedoch die Faktoren, die die Interleukin-33-Expression steuern, nicht absorbieren. Daher ist die Interleukin-33-Expression in diesem Setting nicht reguliert.

Das hier beschriebene Protokoll kann angepasst werden, um die Reaktion verschiedener Zelltypen auf die Knochenregeneration zu untersuchen. Darüber hinaus kann das Protokoll zur Herstellung von Konditionsmedium aus Prozessknochen und anderen Knochenfüllstoffen verwendet werden. Die klinische Relevanz dieses Bioassays bleibt unklar.

Die zelluläre Antwort auf BCM in vivo ist wahrscheinlich komplexer und umfasst ein großes Spektrum an Genen und verschiedenen Zielzellen, die das hier vorgestellte erweitern. Nichtsdestotrotz liefert unser Bioassay erste Einblicke in die vermutlich komplexe Zusammensetzung von Knochen-RAF-Molekülen und die in vitro zelluläre Reaktion.