Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die räumliche Kolokalisation von Zielpaaren quantitativ zu bewerten, in diesem Fall durch die Untersuchung des medikamenteninduzierten Rezeptortransports. Dies wird durch die Behandlung lebender kultivierter Zellen mit einem Medikament erreicht, um einen veränderten Rezeptortransport zu induzieren. In einem zweiten Schritt ermöglicht die doppelte Immunmarkierung der Zielrezeptoren und intrazellulären Transportkompartimente die räumliche Lokalisierung der Zielpaare mittels konfokaler Mehrkanalmikroskopie.

Die quantitative Kolokalisationsanalyse wird verwendet, um die Tendenz der Zielrezeptoren und Kompartimente zu messen, sich an der gleichen Stelle zu befinden. Die Ergebnisse zeigen Veränderungen des Rezeptortransports nach medikamentöser Behandlung, die auf der Kolokalisation von Rezeptoren und intrazellulären Transportkompartimenten basieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Overlay-Kolokalisierung besteht darin, dass sie quantifizierte Messungen der Kolokalisierung liefert, die dann weitaus leistungsfähigere Analysen und komplexere Versuchsdesigns ermöglichen.

Obwohl diese Methode Einblicke in den Rezeptortransport geben kann, kann sie auch auf Veränderungen in der räumlichen Kolokalisation von nahezu zwei beliebigen Proteinen in kultivierten Zellen angewendet werden. Um dieses Verfahren zu starten, entfernen Sie das ursprüngliche Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch ein Medium, das das interessierende Arzneimittel in der gewählten Konzentration enthält. Inkubieren Sie anschließend die Zellen unter den ursprünglichen Wachstumsbedingungen für die gewählte Behandlungsdauer.

Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal vorsichtig mit jeweils einem Milliliter Waschpuffer. Fixieren Sie die Zellen mit 300 Mikrolitern 4%para-Formaldehyd in 0,1 molaren PBS für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dann erneut dreimal mit jeweils einem Milliliter Waschpuffer

inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang in 300 Mikrolitern Blockierungspuffer bei Raumtemperatur. Anschließend inkubieren Sie die Zellen mit Primärantikörpern in 300 Mikrolitern Antikörperverdünnungsmittel für 48 Stunden bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dann dreimal vorsichtig mit jeweils einem Milliliter Waschpuffer

Inkubieren Sie anschließend die Zellen mit einem an Fluor konjugierten Sekundärantikörper in 300 Mikrolitern Antikörperverdünnungsmittel für eine Stunde bei Raumtemperatur und schützen Sie die Zellen vor Licht. Waschen Sie die Zellen nach einer Stunde dreimal vorsichtig mit jeweils einem Milliliter Waschpuffer. Um den Deckglas von der 24-Well-Platte zu entfernen, halten Sie die Platte in einem Winkel von 45 Grad.

Platzieren Sie die Spitze einer feinen Pinzette an der Oberkante des Deckglases, wo sie auf den Vertiefungsboden trifft. Kippen Sie dann den Deckglas im Waschpuffer vorsichtig vom Vertiefungsboden weg. Das Deckglas liegt an der Brunnenwand an, wo es leicht mit einer Pinzette entfernt werden kann.

Montieren Sie dann die Deckgläser mit den Küvetten nach unten auf Objektträger mit Anti-Fading-Eindeckmedium und verwenden Sie ein Objektiv mit 100-facher Vergrößerung. Lokalisieren Sie zunächst eine repräsentative Zelle, die mit Hilfe der Epi-Fluoreszenz abgebildet werden soll. Konfigurieren Sie als Nächstes die Einstellungen für die Bilderfassung Nehmen Sie unkomprimierte Tiff-Bilder mit acht Bit von jedem beschrifteten Kanal auf, um jeden Kanal sequenziell abzubilden und durchschnittlich vier bis sechs Scans für das endgültige Bild durchzuführen.

Wechseln Sie dann zum konfokalen Bildgebungspfad und fokussieren Sie auf eine Z-Ebene durch die Mitte der Zelle. Optimieren Sie die Lochblendenlaserleistung und den Photomultiplier, die Röhrenspannung und den Offset für jeden Kanal. Notieren Sie diese Einstellungen, und verwenden Sie dieselben Einstellungen für die Abbildung aller Zellen, die für ein bestimmtes Zielpaar beschriftet sind.

Im selben Replizieren Sie die nächsten Locator-Zellen, die mit einem Objektiv mit hoher Vergrößerung abgebildet werden sollen. Wechseln Sie mit der Epi-Fluoreszenz zum konfokalen Bildgebungspfad und fokussieren Sie auf eine Z-Ebene durch die Mitte der Zelle, falls verfügbar. Verwenden Sie die Software-Zoom-Zuschneidefunktion, um den Scanbereich auf die gewünschte Zelle zu beschränken. Danach.

Erfassen Sie Bilder für jeden beschrifteten Kanal mit den zuvor festgelegten Einstellungen, und wiederholen Sie die Verfahren, um 15 oder mehr Zellen pro Bedingung und Replikat abzubilden. Um eine ausreichende Probenentnahme zu gewährleisten. Öffnen Sie in diesem Verfahren das Bildpaar einer Zelle in Bild J.Verwenden Sie den Befehl Bildfarbkanäle zusammenführen, um ein RGB-Bild zu erzeugen.

Zeichnen Sie dann um die gewünschte Zelle herum. Verwenden Sie das Bild j plugin die SC-Kolokalisierung, um die Kolokalisierung der Ziele in der ausgewählten Zelle zu quantifizieren. Notieren Sie das gewünschte Kolokalisierungsmaß und wiederholen Sie den Vorgang für jede Bildzelle.

Berechnen Sie als Nächstes den Mittelwert der aufgezeichneten Kolokalisierungswerte der allgemeinen Kontrollbedingungen für jedes Replikat jeder Beschriftungsbedingung. Multiplizieren Sie die Mittelwerte mit minus eins, um den Offset für jedes Replikat in jeder Beschriftungsbedingung zu erhalten. Fügen Sie dann den Offset für jedes Replikat in jeder Bezeichnungsbedingung zu jedem Kolokalisierungswert in diesem Replikat hinzu.

Dadurch werden die Daten so normalisiert, dass das mittlere Kolokalisierungsmaß für die allgemeine Kontrollbedingung in jedem Replikat jeder Beschriftungsbedingung null ist. Danach ermöglichen alle Daten aus allen Replikaten jeder Markierungsbedingung die Analyse von Veränderungen in der Kolokalisation zwischen den Replikaten. Hier sind die primären Kulturen von sensorischen Neuronen der Spinalganglien gezeigt, die längeren und akuten medikamentösen Behandlungen ausgesetzt waren. Die Zellen wurden dann immunmarkiert für Delta-Opioid-Rezeptoren und als Marker für das Recycling von Endosomen mit unterschiedlichen primären sekundären Antikörperpaaren und mittels sequentieller konfokaler Zweikanalmikroskopie abgebildet.

Zusätzlich zur anschließenden quantitativen Kolokalisierung und Analyse wurden diese repräsentativen Bilder verarbeitet, um Falschfarben-Kolokalisierungskarten zu erstellen, die hier gezeigt werden. Die mittleren Kolokalisationswerte für Delta-Opioidrezeptoren und Marker für frühe Endosomen, Recycling-Endosomen und Lysosomenrezeptor-Kolokalisationen mit jedem Kompartiment werden zwischen Gruppen verglichen, die unterschiedliche akute medikamentöse Behandlungen erhalten, und arzneimittelinduzierte Veränderungen des Rezeptorhandels werden beobachtet. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, qualitativ hochwertige, konsistente Mikroskopbilder zu erstellen, um eine valide quantitative Analyse zu ermöglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine quantitative Kolokalisierungsanalyse durchführen.