Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die räumliche Kolokalisation von Ziel-Paaren quantitativ zu bewerten, hier konkret den durch Medikamente induzierten Rezeptortransport. Dies wird erreicht, indem lebende kultivierte Zellen mit einem Wirkstoff behandelt werden, um den Rezeptortransport zu verändern. In einem zweiten Schritt ermöglicht die doppelte immunologische Markierung der Zielrezeptoren und der intrazellulären Transportkompartimente die räumliche Lokalisation der Ziel-Paare mittels mehrkanaliger konfokaler Mikroskopie.

Die quantitative Kolokalisationsanalyse wird verwendet, um die Neigung der Zielrezeptoren und -kompartimente zu messen, am selben Ort vorzukommen. Die Ergebnisse zeigen Veränderungen im Rezeptortransport nach einer Behandlung mit einem Wirkstoff auf der Grundlage der Kolokalisation von Rezeptoren und intrazellulären Transportkompartimenten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Überlagerungskolokalisation besteht darin, dass sie quantifizierte Maße der Kolokalisation liefert, wodurch deutlich aussagekräftigere Analysen und komplexere experimentelle Designs ermöglicht werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in den Rezeptortransport ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf Veränderungen der räumlichen Kolokalisation praktisch beliebiger zwei Proteine in kultivierten Zellen anwenden. Um dieses Verfahren zu beginnen, entfernen Sie das ursprüngliche Wachstumsmedium und ersetzen es durch Medium, das die Substanz der Wahl in der gewählten Konzentration enthält. Anschließend inkubieren Sie die Zellen unter den ursprünglichen Wachstumsbedingungen für die gewählte Behandlungsdauer.

Nach der Inkubation die Zellen jedes Mal vorsichtig mit einem Milliliter Waschpuffer dreimal waschen. Die Zellen mit 300 Mikrolitern 4 % Paraformaldehyd in 0,1 molarer PBS für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius fixieren. Anschließend die Zellen erneut jedes Mal mit einem Milliliter Waschpuffer dreimal waschen.

Anschließend die Zellen in 300 Mikrolitern Blockpuffer zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Danach die Zellen mit primärem Antikörper in 300 Mikrolitern Antikörperverdünnungspuffer 48 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Zellen jedes Mal dreimal mit je einem Milliliter Waschpuffer vorsichtig waschen.

Als Nächstes inkubieren Sie die Zellen mit sekundärem Antikörper, der an ein Fluorophor gekoppelt ist, in 300 Mikrolitern Antikörperverdünnungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur, und schützen Sie die Zellen dabei vor Licht. Nach einer Stunde waschen Sie die Zellen vorsichtig jeweils mit einem Milliliter Waschpuffer, insgesamt dreimal. Um den Deckglaser von der 24-Loch-Platte zu entfernen, halten Sie die Platte in einem Winkel von 45 Grad.

Platzieren Sie die Spitze eines feinen Pinzettenpaares an der oberen Kante des Deckglases, dort, wo es auf den Boden der Vertiefung trifft. Neigen Sie dann das Deckglas vorsichtig im Waschpuffer von der Bodenfläche der Vertiefung weg. Das Deckglas legt sich daraufhin an der Wand der Vertiefung an, wo es leicht mit der Pinzette entfernt werden kann.

Danach montieren Sie die Deckgläser mit den Zellen nach unten auf Objektträger mit einem Anti-Fade-Montagemedium unter Verwendung eines 100×-Objektivs mit hoher Vergrößerung. Zuerst lokalisieren Sie eine repräsentative Zelle zur Abbildung mittels Epifluoreszenz. Konfigurieren Sie anschließend die Einstellungen für die Bildaufnahme. Speichern Sie 8-Bit-unkomprimierte TIFF-Bilder jedes markierten Kanals auf, um jeden Kanal nacheinander abzubilden, und mitteln Sie vier bis sechs Scans für das Endbild.

Wechseln Sie dann zum konfokalen Abbildungspfad und fokussieren Sie auf eine Z-Ebene durch die Zellmitte. Optimieren Sie die Lochblende, die Laserleistung sowie die Spannung und den Offset der Photomultiplierröhre für jeden Kanal. Notieren Sie diese Einstellungen und verwenden Sie dieselben Einstellungen für die Aufnahme aller Zellen, die für ein bestimmtes Ziel-Paar markiert sind.

Im selben Replikat lokalisieren Sie anschließend die Zellen, die mit einem Objektiv mit hoher Vergrößerung abgebildet werden sollen. Wechseln Sie bei Verwendung der Epi-Fluoreszenz zur konfokalen Abbildungsebene und fokussieren Sie auf eine Z-Ebene durch die Zellmitte, falls verfügbar. Nutzen Sie die Software-Zoom-Zuschneide-Funktion, um den Scan-Bereich auf die Zelle von Interesse einzuschränken. Danach.

Nehmen Sie Bilder für jeden markierten Kanal mit den zuvor festgelegten Einstellungen auf und wiederholen Sie die Verfahren, um 15 oder mehr Zellen pro Bedingung und Replikat abzubilden. Um eine ausreichende Probenanzahl zu gewährleisten, öffnen Sie in diesem Verfahren das Paar von Bildern einer Zelle in ImageJ. Verwenden Sie den Befehl „Farbkanäle kombinieren“ des Programms, um ein RGB-Bild zu erzeugen.

Umreißen Sie dann die Zelle von Interesse. Nutzen Sie das ImageJ-Plugin „SC Colocalization“, um die Kolokalisation der Zielstrukturen in der ausgewählten Zelle zu quantifizieren. Notieren Sie das gewünschte Kolokalisierungsmaß und wiederholen Sie den Vorgang für jede Bildzelle.

Berechnen Sie anschließend den Mittelwert der aufgezeichneten Kolokalisierungswerte der gemeinsamen Kontrollbedingungen jedes Replikats jeder Markierungsbedingung. Multiplizieren Sie die Mittelwerte mit minus eins, um den Offset für jedes Replikat in jeder Markierungsbedingung zu erhalten. Addieren Sie dann den Offset für jedes Replikat in jeder Markierungsbedingung zu jedem Kolokalisierungswert in diesem Replikat hinzu.

Dadurch werden die Daten normalisiert, sodass das mittlere Kolokalisierungsmaß für die gemeinsame Kontrollbedingung in jeder Wiederholung jeder Markierungsbedingung Null beträgt. Danach ermöglichen alle Daten aus allen Wiederholungen jeder Markierungsbedingung die Analyse von Veränderungen der Kolokalisation über die Wiederholungen hinweg. Gezeigt sind hier die primären Kulturen sensorischer Neuronen des Rückenwurzelganglions, die langen und akuten Pharmakabehandlungen ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden anschließend mittels unterschiedlicher primärer und sekundärer Antikörpapaare für Delta-Opioidrezeptoren und einen Marker von Recycling-Endosomen immungelabelt und mittels zweikanaliger sequenzieller konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Zusätzlich zur anschließenden quantitativen Kolokalisation und Analyse wurden diese repräsentativen Bilder bearbeitet, um die hier gezeigten Falschfarben-Kolokalisationskarten zu erzeugen. Die mittleren Kolokalisationsscores für Delta-Opioidrezeptoren und Marker von frühen Endosomen, recycelnden Endosomen und Lysosomen – also die Kolokalisation der Rezeptoren mit jeweiligen Kompartimenten – werden zwischen Gruppen verglichen, die unterschiedliche akute Drogenbehandlungen erhielten, und drogeninduzierte Veränderungen im Rezeptortransport werden beobachtet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, qualitativ hochwertige und konsistente Mikroaufnahmen anzufertigen, um eine valide quantitative Analyse zu ermöglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine quantitative Kolokalisationsanalyse durchführt.