ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

この手順の全体的な目標は、転写因子の強制発現により、ヒト多能性幹細胞から赤血球および骨髄性血液細胞を生成することです。この方法は、内皮からHEPOへの移行、およびHEPOの発現と仕様の転写調節の研究のための血液細胞における均質性内皮の生成に適用できます。この技術の主な利点は、この方法がヒトpreport幹細胞からの均質性内皮誘導の非効率的かつ迅速な手段を提供し、細胞培養皿内の内皮ヘミー転移の観察を可能にすることです。

Dr.Linの研究室の研究助手であるDr.Bruskeは、プレコを開始する前に、マットゲルなどの細胞外マトリックスを含む6枚のウォールプレートをメーカーの指示に従って希釈し、ウェルに注ぐ手順を実演します。プレートを摂氏37度で30〜60分間インキュベートし、形質導入培地にします。まず、各形質導入セットに対してレンチウイルスアリコートを調製し、ウイルスの細胞への感染の推定多重度またはMOIが1細胞あたり1つのウイルスになるようにし、それらを摂氏4度に保ちます。

次に、hbscウイルスpoly brain用の完全無血清培地を最終濃度6マイクログラム/ミリリットルに、岩石阻害剤Y 2 7 6 3 2を最終濃度10マイクロモルに組み合わせ、各形質導入セットの総容量1.3ミリリットルにし、混合物を氷上にセットして細胞を調製します。最後の継代から約4日後に70%コンフルエンスで多能性幹細胞の健康なバッチから始めます。ヒト多能性幹細胞がマップ上に維持されている場合、形質導入実験の2〜3継代前にフィーダーフリー条件に移し、健康な多能性幹細胞培養物を表す必要があります。

自発的な分化はありません。HPSC培地を吸引し、6ウェルプレートのウェルごとに2ミリリットルのアキュテインなどの塩分剥離溶液を加え、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5〜7分間インキュベートします。次に、10マイクロモルの岩石阻害剤を含む2ミリリットルの完全な培地を追加し、分離した細胞を収集します。

均質な細胞懸濁液を調製した後、少量のアリコートを取り、トライアンブルー排除法により生細胞をカウントします。次に、細胞をGの200倍で5分間遠心分離し、ペレットを10マイクロモルの岩石阻害剤を含む完全培地に最終濃度10の3.4倍で11ミリリットルあたり6個の生細胞に再懸濁します。次いで、先に調製した1.3ミリリットルの形質導入培地のそれぞれに、6つの細胞に0.68×10を含有する細胞懸濁液200マイクロリットルを添加する。

マトリックスコーティングされた6枚のウォールプレートを摂氏37度から取り外します。次に、マトリックス溶液を吸引し、各形質導入混合物をウェルに移し、プレートを渦巻いて細胞をウェル内に均一に分布させます。24時間。

形質導入後、顕微鏡でウェルを視覚化し、細胞の少なくとも80%が接着していることを確認します。ウイルス溶液を廃棄し、付着した細胞を成長因子を含まない不完全な培地で洗浄します。次に、サイトカインを補充した培地3ミリリットル(3 F.Medium)を細胞に加えます。

細胞を翌日一晩インキュベートします。培地をpur mycinの1ミリリットルあたり1マイクログラムを含む新鮮な3つのF培地に交換します。残留した非形質導入細胞を除去するため。

この培地を24時間ごとに交換して、死んだ細胞を取り除きます。治療の48時間後、purマイシンを中止し、4日目に新鮮な3つのFミディアムのみを使用してください。.形質導入後、顕微鏡下で細胞を観察し、内皮形態を持つクラスター化細胞の出現を確認し、血液内皮細胞の形成を決定します。

まず、培養皿から3日目または4日目の間の細胞を細胞剥離溶液と関連付けます。分離した細胞を完全な培地に集めて遠心分離し、室温で最大バッファーに細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞をカウントし、その後、v catrin、CD 2 26、CD 73、およびCD 43の検出に適した抗体を使用して、染色反応ごとに10〜5番目の細胞を1回インキュベートします。細胞表面マーカー。

フローサイトメトリーの実行は、4日目からのテキストプロトコルに記載されています。形質導入後、各ウェルから培地の半分を置き換えることにより細胞の分化を続け、5〜7日の間の48時間ごとに、丸い血液細胞が緩く凝集して現れ、内皮細胞層の上に再ファイルされます。培養液を最大14日間保持し、その間に浮遊細胞は大幅に拡大するはずです。

ETV 2、gata 1、ETV 2のフローサイトメトリー解析。Gata 2形質導入細胞は、テリン陽性の血液内皮の形成を示しており、これは、ETV 2、gata 1、およびETV 2の分化フローサイトメトリー解析の3日目から4日目のCD2 26の発現およびCD73の発現の欠如によって同定できる。Gata 2形質導入細胞は、7日目にCD43を発現する血液細胞の誘導を示しています。

形質導入後14日目のgata two TAL 1 one LMO two induced cellsの形質導入フローサイトメトリー解析後、CD 2、35 AおよびCD 41 Aを発現する血液細胞の形成、およびgata two TAL 1 one lmo two induced hematopoietic細胞の右染色シトシン調製物は、コロニー形成細胞アッセイにおいて赤血球マクロファージおよびメガキャリオ酸性細胞の形態を示した。ヒト多能性幹細胞の形質導入は、形質導入手順の実行中に1時間以内に行うことができます。幹細胞の生存率を常に考慮し、反応混合物に岩石阻害剤を含め、最初の3日間は細胞あたり最適な量のウイルスを使用することが重要です。

形質導入後は、免疫染色、結腸形成アセイ、フローサイトメトリーなどの方法を使用して、分化の効率と誘発される血液疾患の種類に関する質問に答えることができます。このビデオを見れば、ヒト多能性幹細胞を化石化して感染させる方法と、最初の7〜10日以内に培養を分化する際に何を期待すべきかについて十分に理解できるはずです。転写因子がヒトの意図した幹細胞にうまく送達された後、細胞はその効力を失い、徐々に造血の運命に陥ります。

したがって、研究者は、内皮から造血への移行の分子メカニズムを研究するための便利なinvitroモデルを手に入れることができます。レンチウイルスを含む領域での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、個人用保護具の着用やウイルスを含む領域の適切な廃棄などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。