Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von Plasmodium Rhoptry Proteine

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Plasmodium-Proteine mit Hilfe von hela-basierten zellfreien Expressionssystemen zu translatieren und die Proteine aus Mikrovolumina des translatierten Produkts zu reinigen. Dies wird durch die Klonierung von Plasmodium-Genen erreicht, um rekombinante Plasmide für die zweistufige und einstufige In-vitro-Translation, die zellfreie Expression von rekombinanten RT-Baumproteinen aus der Malaria, vorzubereiten. Um die rekombinanten Proteine zu translatieren, wird das präparierte Plasmid mit einer Transkriptionsmischung inkubiert.

Bei Verwendung des zweistufigen Expressionssystems, das mRNA transkribiert, wird die resultierende mRNA dann zur Proteintranslation in die Translationsmischung gegeben. Bei Verwendung des einstufigen Expressionssystems wird das rekombinante Plasmid mit Helazelllysat zur Transkription und Translation rekombinanter Proteine inkubiert. Rekombinante Proteine werden dann aus Mikrovolumina des Translationsprodukts aufgereinigt.

Die Ergebnisse zeigen eine erfolgreiche Expression und Reinigung auf der Grundlage der Western-Blotting-Analyse. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen, wie dem Weizenkeimexpressionssystem und dem Kaninchen-Retikulozyten-Lysat-System, besteht darin, dass dieses System Proteine in drei Stunden exprimieren kann. Es ist keine Codierungsoptimierung erforderlich.

Es ist erschwinglich und einfach zu bedienen. Mehrere Antigene können auf Microarrays gescreent werden, was den Nachweis von Antigenen für Therapie und Diagnose ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es sich um eine zellfreie Expression handelt, die Proteine in Mikrovolumina exprimiert, was die Proteinreinigung extrem schwierig macht.

Wir hatten zuerst die Idee, dieses System zu verwenden, da wir Proteine nicht mit E-coli exloexzieren konnten und andere Expressionssysteme zu teuer und zeitaufwändig fanden. Wir haben uns entschieden, das hela-basierte zellfreie Expressionssystem als alternatives System zu erforschen. Bereiten Sie 20 Mikroliter Transkriptionsgemisch vor, das rekombinante Plasmid-Vektor-DNA enthält, wie im Textprotokoll für die zweistufige In-vitro-Proteinexpression beim Menschen beschrieben.

Verwendung von DNA-Vorlagen. Mischen Sie die Komponenten in einem Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie 75 Minuten bei 30 Grad Celsius in einem Wasserbad. Nehmen Sie dann zwei Mikroliter des Transkriptionsgemisches und fügen Sie es zu 23 Mikrolitern Translationsgemisch hinzu, das Helazelllysat enthält.

Inkubieren Sie die resultierende Mischung 90 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Lagern Sie die übersetzten Produkte bei minus 20 Grad Celsius. Als nächstes bereiten Sie 25 Mikroliter des Transkriptions- und Translationsgemisches her, das den rekombinanten Plasmidvektor, die DNA und das Lysat enthält, wie im Textprotokoll für die einstufige Expression des humangekoppelten In-vitro-Translationsproteins für DNA-Templates beschrieben.

Inkubieren Sie dieses Reaktionsgemisch für 90 Minuten bis sechs Stunden bei 30 Grad Celsius und lagern Sie die Translationsprodukte bei minus 20 Grad Celsius. Um die exprimierten rekombinanten Proteine zu reinigen, fügen Sie 75 Mikroliter eines X-Reinigungspuffers zu 25 Mikrolitern Translationsprodukt hinzu, um 100 Mikroliter Reinigungsmischung herzustellen. Waschen Sie das Nickelharz zweimal, indem Sie 300 Mikroliter destilliertes Wasser und 300 Mikroliter des Bindepuffers hinzufügen.

Resuspendieren Sie das Harz und zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei 14.000 g, um überschüssiges Ethanol zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Reinigungslösung zu 100 Mikrolitern Nickel-Chelatharz hinzu und inkubieren Sie die Mischung an einem Ende. Den Schüttler 60 Minuten bei Raumtemperatur beenden.

Zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 14.000 g und sammeln Sie das Supernat in einem frischen Röhrchen, das als Durchfluss gekennzeichnet ist. Waschen Sie das Harz mit 100 Mikrolitern eines x Waschpuffers, zentrifugieren Sie dann eine Minute lang bei 14.000 GS und sammeln Sie den Super in einer frischen Tube mit der Aufschrift Wash. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal nach dem Waschen.

Geben Sie 100 Mikroliter eines x Elutionspuffers zum Harz und inkubieren Sie es 15 Minuten lang auf einem Endschüttler. Dann eine Minute lang bei 14.000 g zentrifugieren. Führen Sie den Ellucian-Schritt jedes Mal zweimal aus.

Den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen geben und nach Ellucian als Eluat kennzeichnen. Waschen Sie das Harz zweimal wie zuvor und lagern Sie es dann bei vier Grad Celsius. Lagern Sie den Durchfluss durch Wasch- und Elutionsproben bei minus 20 Grad Celsius oder niedriger, um Western Blotting durchzuführen.

Bereiten Sie zunächst separate Röhrchen mit Schön-Extrakten aus P falsy parum e coli, exprimierten rekombinanten R-3-Proteinen, den hergestellten rekombinanten Proteinen und den Proteinprodukten her, die unter Verwendung des Affinitätsverfahrens gereinigt wurden. Geben Sie anschließend Elektrophorese-Probenpuffer mit Mercaptoethanol in jedes Röhrchen, um ein Endvolumen von 20 Mikrolitern zu erhalten. Um lösliche Proteinproben herzustellen, kochen Sie die Röhrchen zwei Minuten lang.

Laden Sie die löslichen Proteinproben auf 10%SDS-Page-Gele, um die Proteine nach dem Ausführen der Gele zu trennen. Die abgetrennten Proteine aus den SDS-Page-Gelen werden durch Elektrophorese bei 35 Milliampere Strom pro Gel in einer halbtrockenen Western-Blotting-Kammer zwei Stunden lang auf Nitrozellulosepapier übertragen, nachdem das Nitrozellulosepapier mit 2 % fettfreier Milch übertragen und blockiert wurde. Inkubieren Sie das Nitrozellulosepapier mit den polyklonalen Antikörpern, die im Textprotokoll für Negativkontrollen aufgeführt sind.

Inkubieren Sie auch Nitrozellulosepapier in einem bis 100 verdünnten normalen Maus- und Kaninchenserum und verbrauchter Kultur, die aus zwei Myelomzellen SB benannt ist. Nach der Inkubation des Nitrozellulosepapiers bei vier Grad Celsius über Nacht viermal mit Blot-Puffer waschen und mit speziesspezifischen Sekundärantikörpern inkubieren, konjugiert an Meerrettichperoxidase, eins auf 1000 in 2%Milch verdünnen. Waschen Sie dann das Nitrozellulosepapier noch einmal viermal mit Kleckspuffer.

Inkubieren Sie schließlich das gewaschene Nitrozellulosepapier mit einer Farbentwicklungslösung, A plus B für 30 Minuten im Dunkeln, die erfolgreiche Expression von Plasmodiumproteinen unter Verwendung von in vitro humanen zellfreien Expressionssystemen wurde durch RT-Baum-spezifisches Kaninchen-Antier bestätigt, wie gezeigt wurde. Zuvor exprimierte rekombinante Proteine wurden von Antiseren gegen Parasitose vae-Proteine aus p FALs parem und P Yoi Lee nicht erkannt. Nachweis der Spezifität von Kaninchen-Antiseren 6 76 gegenüber den exprimierten Proteinen. Normales Kaninchenserum reagierte nicht mit rekombinanten Proteinen. Übersetzt unter Verwendung des zweistufigen in vitro humanen zellfreien Expressionssystems und des einstufigen gekoppelten in vitro Translationssystems.

Hier wird die erfolgreiche Aufreinigung von translatierten Proteinen aus 25 Mikrolitern translatierter Proteinprodukte gezeigt. Insbesondere wird die erfolgreiche Aufreinigung des Spalttransmembranproteins der Mara gezeigt. Die erfolgreiche Aufreinigung eines hypothetischen Proteins aus dem für Gene kodierenden Plasmodium RT-Baumprotein wird ebenfalls gezeigt.

Schließlich wird die erfolgreiche Aufreinigung von Gürteltier-Repeats gezeigt, die das Plasmodium RT-Baumprotein enthalten. Die Proteinausbeute nach der Reinigung beträgt 3,5 Mikrogramm pro 25 Mikroliter nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Parasitologie den Weg für die Proteincharakterisierung in Parasiten, Protein-Protein-Interaktionen, antikörperhemmende Studien und die Entwicklung von Impfstoffen auf dem Gebiet der Parasitologie.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie das zellfreie Zellexpressionssystem von Healer verwenden, um Plasmodiumproteine in drei Stunden zu exprimieren. Sie werden auch verstehen, wie die Proteine aus Mikrovolumina des translatierten Produkts gereinigt werden können.