リン酸化ペプチドの強化充実のためのマクロポーラスポリマーモノリスの高度に多孔性配位高分子コーティングの製造

次の実験の全体的な目標は、リン酸化ペプチドの選択的抽出における性能が向上した新しい支持材料を調製することです。これは、適切な官能基を有する多孔質ポリマー毛細管モノリスを適切に調製することによって達成されます。まず、金属種がポリマーモノリスの官能基に固定化され、支持体がリン酸化ペプチドの抽出に選択的になります。

次に、金属有機構造体の多層を段階的に成長させることで、金属部位の量を増やし、リン酸化ペプチドの選択性を高めます。この結果は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化、飛行時間型質量分析に基づくタンパク質消化物からのリン酸化ペプチドの抽出に対する選択性の向上を示しています。Oペプチドの濃縮は、通常、従来のシリカ粒子またはポリマー粒子のいずれかで行われる金属ライオンアフィニティークロマトグラフィーによって行われ、これらはクロマトグラフィーカラムに充塡されます。

当社の材料は、良好な物質輸送特性を持つマクロ多孔性ポリマーモノリスの利点と、金属有機フレームワークの高い結合能力を兼ね備えています。これを達成する方法は、モノリスの表面から金属有機フレームワークを順次成長させることで、最終的に分析対象物と相互作用するために利用可能な金属線の複数の層を持つことです。良好な表面特性と多孔性を備えたモノリスを実現するためには、注意しなければならないいくつかの重要なステップがあります。

まず、ポリアミドコーティングされ、内径100ミクロンのフューズドシリカキャピラリーをポイント25ミリリットルのガラスシリンジに接続し、キャピラリーをアセトンで洗浄します。次に、キャピラリーを水ですすいでアセトンを取り除きます。次に、0.2モルの水酸化ナトリウム水溶液で満たされた250マイクロリットルのガラスシリンジをシリンジポンプに置き、毎分25マイクロリットルの点で溶液をキャピラリーに30分間流して、内部シリカコーティングを活性化します。

30分後、廃液が中性になるまでキャピラリーを水ですすいでください。紙のpHストリップを使用して、中性のpHフローを確認します。次に、0.2モルの塩化水素水溶液をシリンジにロードし、30分の流れの後にciol基をプロトン化するために毎分25マイクロリットルのポイントで毛細管を通して溶液をポンプで送り、再び、流れが中性になるまで水で毛細血管をすすぎます。

pHが中性になったら、100%エタノールを充填した250マイクロリットルのシリンジで毛細血管をすすぎます。次に、エタノール中の3つのトリメチルプロピルメタクリレートの20%溶液をポイント25マイクロリットル/分で1時間ポンプで送り込み、表面をビニル基で官能基化します。次に、毛細血管をアセトンですすぎ、窒素の流れで乾燥させます。

サンプルを室温で一晩休ませてから、20センチメートルの長さのセクションにカットします。重合混合物を、添付のテキストプロトコルに記載されているように、ゴム製のセプタムを備えた1ミリリットルのガラスバイアルで調製します。開始剤としてモノマーに対して1%A IBNを添加し、混合物を10分間超音波処理する。

次に、非官能化シリカキャピラリーを窒素流に付着させ、ゴムセプタムを介して重合混合物に挿入します。バイアルキャップを少し緩め、混合物を通して窒素を10分間ゆっくりと泡立てます。10分後、窒素流キャピラリーを重合混合物からバイアルのヘッドスペースまで持ち上げ、キャップをしっかりと閉めます。

官能基化されたキャピラリーの1つをセプタムから重合混合物に挿入します。窒素によって発生する過剰な圧力を使用して、重合混合物を機能化された毛細管にポンプで送り込みます。重合混合物を数滴キャピラリーの廃液から流して、キャピラリーが完全に満たされていることを確認してから、ゴム製のセプタムで閉じます。

キャピラリーをバイアルから非常に慎重に取り出し、キャピラリーに含まれる混合物をキャピラリーに含まれる混合物を摂氏60度の温水浴に6時間かけて重合させるゴム製のセプタムで入口を閉じます。終了したら、キャピラリーを室温まで冷却し、キャピラリーの両端を数ミリメートル切り取ります。次に、HPLCポンプを使用して、カラムをアセトニトリルで毎分 4 マイクロリットルで 30 分間フラッシングします。

これにより、反応性のないモノマーや形成不良の薬剤が除去されます。キャピラリーカラムの背圧を確認してください。次に、ここに示す試薬を使用してキャピラリーモノリスを周期的に洗い流し、最終的な有機金属コーティングを成長させます。

コーティングの厚さは、実行されるサイクル数によって決まります。アセトニドトライアルと0.1%トリオール酢酸水溶液の4対1の混合物を100マイクロリットル使用して、調製した金属有機コーティングで毛細血管を洗い流します。次に、タンパク質消化物を毎分2マイクロリットルでカラムに送り

30分間、アセチルNI試験と0.1%Tri Fluor酢酸の4対1の混合物で、1分間1マイクロリットル/分の流速で10分間、非リン酸化ペプチドを再度洗い流します。1分間に1マイクロリットルの流量で10分間水で洗浄します。pH 7の250マイクロモルリン酸緩衝液を使用してリン酸化ペプチドを溶出し、1分間に1マイクロリットルでキャピラリーにポンプで送り込み、バイアルにエルを回収し、標準プロトコルを使用して溶液を脱塩します。

次に、メタノール中の2つの5ジヒドロキシ安息香酸の1ミリグラムあたり2ミリグラムの溶液を調製し、この溶液の2マイクロリットルを言及されたリン酸化ペプチド溶液の2マイクロリットルと混合します。ピペットチップ内で、この混合物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化プレートに直接スポットし、スポットを完全に乾燥させます。マトリックス支援レーザーによるスポットの分析 脱離イオン化飛行時間型質量分析法は、最終的に水で完全に洗い流すことでカラムを再生し、続いて利用可能な鉄の複数の層で修飾されたメタノールキャピラリー

3つのグループは固定化金属イオン親和性クロマトグラフィーでの使用に理想的です ここに示されているのは、濃縮前後に消化されたタンパク質から得られたスペクトルであり、12種類のリン酸化ペプチドに対して顕著な選択性を示しています。代表的な特性評価実験は、新しい細孔の出現に関する貴重な情報を提供します。これは、走査型電子顕微鏡を使用したPCPサイクルとして知られる30の多孔質配位ポリマーサイクル後のバルク粉末モノリスの画像です。

30回のPCPサイクル後、材料中の細孔幅のサイズは、バルクポリマーと比較して直径が3ナノメートル未満であることがわかりました。ハイブリッドは、小さな細孔を持つ大量の増分領域を持っています。これにより、フーリエ変換赤外分光法を使用したさまざまな圧力による窒素吸収が増加します。

カルボン酸官能基の初期取り込みと、10、20、および30 PCPサイクル後のコーティングの成長が見られました。最後に、熱重量分析を使用して、各サイクルで蓄積する追加の金属サイトの量を測定しました。ここに示されているのは、さまざまな温度での重量分析であり、サイクル数の増加に伴う金属サイトの数の増加が確認されています。

このプロトコルに従って、有機リガンドのさまざまな金属中心に対して同様の手順を開発して、特定のフレームワークに対する親和性に基づいてさまざまな分析物の効率的な分離を標的にすることができます。マクロ多孔質ポリマーと金属有機フレームワークを組み合わせた私たちのような複合材料は、分析スケールと分取スケールの両方で選択性結合能力と分離の全体的な効率を大幅に向上させることができるため、分離科学の分野で大きな期待が寄せられていると信じています。