Herstellung eines bioaktiven, PCL-basierte "Self-Montage" Formgedächtnispolymer Scaffold

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein Formgedächtnis-Polymer- oder SMP-Gerüst herzustellen, das in der Lage ist, sich selbst in einen unregelmäßigen kranio-mandalen Defekt einzupassen, um die osteointegrative Einheilung zu fördern. Dies wird erreicht, indem zunächst eine zusammengeschmolzene Salzform mithilfe von Lösungsmittelabguss und der photochemischen Aushärtung von Polycaprolacton-Diacryl erzeugt wird. Auf dieser Salzform entsteht ein Gerüst mit der hochgradig miteinander verbundenen Porosität, die für die Osteokonduktivität erforderlich ist.

Als zweiter Schritt wird das Gerüst mit Polydopamin beschichtet, das Bioaktivität verleiht. Anschließend wird das Gerüst mit warmer Kochsalzlösung behandelt, wodurch es formschlüssig in ein unregelmäßiges Modell eingepasst werden kann. Die Ergebnisse der Defektanalyse zeigen eine Eigenpassung, jedoch geringe Vernetzung und Bioaktivität, basierend auf den Pressfit-Ergebnissen, Aufnahmen mittels Rasterelektronenmikroskopie und der in-vitro-Bildung von Hydroxylapatit.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der autologen Transplantation, liegt darin, dass die erzielte anpassungsfähige Passform maßgeblich die Osteointegration und Knochenheilung unterstützt. Lindsey Nail, eine Doktorandin in meinem Labor, demonstriert dieses Verfahren. Um mit der Vorbereitung des Gerüsts zu beginnen, sieben Sie zunächst Natriumchlorid durch ein 425 µm-Sieb und geben Sie 1,8 Gramm davon in vier Portionen in ein 3-Liter-Glaskolben. Geben Sie langsam 146 Milligramm entionisiertes Wasser zum Kolben hinzu und mischen Sie mit einem Metallspatel.

Nach jeder Zugabe das Gefäß verschließen, in ein Tuch einwickeln und senkrecht in ein Zentrifugenröhrchen stellen. Das Röhrchen 15 Minuten lang zentrifugieren, anschließend öffnen und die Lösung über Nacht an der Luft trocknen lassen. Nach der Synthese von P-C-L-D-A gemäß dem schriftlichen Protokoll eine Makerationlösung herstellen, die 150 Milligramm P-C-L-D-A pro Milliliter Chloromethan in einem Glasgefäß enthält, das Gefäß verschließen, in Aluminiumfolie einwickeln und eine Minute lang verwirbeln.

Bereiten Sie anschließend eine Photoinitiatorlösung vor, die 115 Milligramm DMP in einem Milliliter eines Vinyls, zwei Peron in einem Glasfläschchen enthält. Verschließen Sie das Fläschchen erneut, wickeln Sie es in Folie ein und wirbeln Sie es eine Minute lang im Vortex. Pipettieren Sie die Photoinitiatorlösung in die Makerationlösung, um eine Mischung mit einem Volumenanteil von 15 % zu erhalten, und wirbeln Sie das Fläschchen eine Minute lang im Vortex.

Als Nächstes umwickeln Sie das Gefäß, das das Salzgerüst enthält, mit Folie und geben die Mischung aus Photoinitiator und Macerat so lange hinzu, bis das Salz bedeckt ist. Verschließen Sie das Gefäß, wickeln Sie es in Tissue ein und stellen Sie es senkrecht in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang.

Als Nächstes die Folie entfernen, das Fläschchen entkorken und die Lösung drei Minuten lang ultraviolettem Licht aussetzen. Anschließend die Lösung über Nacht an der Luft trocknen lassen, das Glas anritzen und mit einer Pinzette den oberen Teil des Fläschchens abbrechen. Das Scaffold vier Tage lang in einer Wasser-Ethanol-Lösung im Verhältnis 1:1 umfüllen, wobei die Lösung täglich erneuert wird.

Entfernen Sie abschließend das SMP-Gerüst und lassen Sie es über Nacht an der Luft trocknen. Um zunächst die Polydopamin-Beschichtung aufzubringen, führen Sie eine 20-Gauge-Nadel zur Hälfte durch das SMP-Gerüst und wickeln anschließend einen Draht um den Nadelaufsatz. Tauchen Sie das Gerüst in 200 Milliliter einer gerührten Dopaminlösung ein und halten Sie den Nadelaufsatz durch Befestigung des Drahtes am Rand des Bechers über der Lösung.

Als Nächstes setzen Sie eine Spritze in die Nadelhalterung ein und ziehen den Kolben, um die Luft aus dem Gerüst zu entfernen. Nachdem das Gerüst vollständig entgast ist, lassen Sie es 16 Stunden lang untergetaucht. Entfernen Sie das Gerüst aus der Lösung und nehmen Sie die Nadel heraus.

Anschließend den Scaffhold mit entionisiertem Wasser spülen und 24 Stunden im Vakuumofen bei Raumtemperatur trocknen. Den Scaffhold dann eine Stunde lang in einem Trocknungsofen bei 85 Grad Celsius platzieren. Zum Schluss den Scaffhold entfernen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.

Zunächst bereiten Sie ein Defektmodell vor, indem Sie eine unregelmäßige Hohlräume mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa sechs Millimetern in eine fünf Millimeter dicke Platte aus hartem Kunststoff bohren. Anschließend wird das SMP-Gerüst zwei Minuten lang in einem Becher mit entionisiertem Wasser bei etwa 60 Grad Celsius eingetaucht. Prüfen Sie, ob das Gerüst deutlich weicher geworden ist, indem Sie mit einer Pinzette seine Form verändern.

Entfernen Sie das aufgeweichte Gerüst mit einer Pinzette aus dem Wasser und drücken Sie es von Hand in das Defektmodell. Lassen Sie das Gerüst auf Raumtemperatur abkühlen und nehmen Sie es anschließend aus dem Defektmodell heraus. Untersuchen Sie die neu fixierte temporäre Form, um Füllung, Durchgängigkeit und Größe zu beurteilen.

Zuerst tauchen Sie das SMP-Gerüst mithilfe einer Pinzette für eine Minute in flüssigen Stickstoff ein. Danach brechen Sie das Gerüst mit einer sauberen Rasierklinge entlang der Mitte. Befestigen Sie anschließend eine der Gerüst-Hälften mit der Bruchfläche nach oben auf der Probenhalterung.

Das Gerüst mit einem Gold-Platin-Legierung durch Kohlenstoffband-Bedampfung auf einer Tiefe von etwa vier Nanometern beschichten. Die Probe in das REM laden und das Bild bei einer Beschleunigungsspannung von 10 bis 15 Kilovolt aufnehmen. Zur Charakterisierung der in-vitro-Bioaktivität.

Schneiden Sie zunächst ein zylindrisches SMP-Gerüst mit einer sauberen Klinge entlang der kreisförmigen Kante in zwei Hälften. Geben Sie eine Hälfte des Gerüsts in ein Reagenzglas mit 30 Milliliter simulierte Körperflüssigkeit und stellen Sie das Gefäß nach 14 Tagen in ein stationäres Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie das Gerüst aus dem Gefäß und lassen Sie es 24 Stunden lang an der Luft trocknen.

Als Nächstes befestigen Sie das Gerüst mit der Schnittfläche nach oben auf der Probenhalterung eines Elektronenmikroskops mit Hilfe von Kohleband. Danach beschichten Sie die Oberfläche des Gerüsts durch Sputtern mit einer Gold-Platin-Legierung bis zu einer Tiefe von etwa vier Nanometern. Wie zuvor laden Sie die Probe in das REM ein und nehmen das Bild bei einer Beschleunigungsspannung von 10 bis 15 Kilovolt auf.

Ein SMP-Gerüst wird bei Erwärmung auf 60 Grad Celsius formbar und kann in ein Defektmodell eingebracht werden. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird das SMP-Gerüst entfernt und behält seine neue, vorübergehend fixierte Form bei. Im Rasterelektronenmikrograf des unbeschichteten SMP-Gerüsts sind die Porenstruktur und die stark miteinander vernetzte Morphologie zu sehen.

Die Bioaktivität des mit Polydopamin beschichteten SMP-Gerüsts wird durch die Bildung von Hydroxylapatit in den Poren demonstriert, wie im Rasterelektronenmikrogramm gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein bioaktives, selbstanpassendes Formgedächtnis-Polymergerüst mithilfe eines Verfahrens herstellt, das aus Lösungsguss über einer Salzpartikelschablone, anschließendem Auslaugen der Partikel und Aufbringen einer Polydopamin-Beschichtung besteht.