Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen in einem Substrat zu kultivieren, dessen Topographie sich im Laufe der Zeit verändert. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Formgedächtnispolymer in eine dauerhafte Form programmiert wird, die gespeichert werden kann. Das Formgedächtnispolymer wird dann in eine temporäre Form programmiert, auf die die Zellen später aufgebracht werden.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Formgedächtnispolymer durch Erhöhung der Temperatur dazu zu bringen, in seine dauerhafte Form zurückzukehren, schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch Fluoreszenzmikroskopie eine Veränderung des Zellverhaltens zeigen. Hallo, mein Name ist Pat Mather. Ich bin Professor für biomedizinische und chemische Technik und Direktor des Syracuse Biomaterials Institute hier an der Syracuse University.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber kommerziellen oder kundenspezifischen Geräten zum Dehnen von Zellen besteht darin, dass wir in einem einzigen Polymersystem in der Lage sind, eine Vielzahl komplexer Stämme auf Zellen aufzubringen. Mein Name ist Jay Henderson. Ich bin Assistenzprofessorin für Biomedizin- und Chemieingenieurwesen und Mitglied des Syracuse Biomaterials Institute.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mechanobiologie zu beantworten, etwa wie Zellen auf dynamische Veränderungen in ihrer physikalischen Umgebung reagieren. Mein Name ist Kevin Davis und ich bin Doktorand an der Syracuse University im Department of Biomedical Engineering und Chemical Engineering. Obwohl diese Methode Einblicke in die mechanische 2D-Biologie geben kann, kann sie auch für andere Systeme wie 3D-Formveränderungsgerüste für das Tissue Engineering verwendet werden.

Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens eine individuelle Aushärtungskammer aus einem Glasobjektträger, einem ein Millimeter dicken Teflon-Abstandhalter und einer Aluminiumplatte vor. Sichern Sie die Kammer zunächst mit kleinen Bindeklammern und injizieren Sie NOA 63 mit einer 18-Gauge-Nadel durch ein Loch im Teflon-Abstandshalter in die Kammer. Stellen Sie die Kammer dann in eine auf 125 Grad Celsius eingestellte Kochplatte.

Lassen Sie die Kammer nach dem Erhitzen der Kammer fünf Minuten lang auf eine gleichmäßige Temperatur aufheizen. Besorgen Sie die NOA 63 für 20 Minuten, indem Sie eine UV-Lampe 6,5 Zentimeter von der Glasoberfläche entfernt positionieren. Nehmen Sie den NOA 63 mit einer Rasierklinge noch warm aus der Kammer.

Anschließend härten Sie das Formgedächtnispolymer unter dem UV-Licht drei Stunden und 40 Minuten direkt auf der Heizplatte bei 125 Grad Celsius nach. Um das Formgedächtnis des NOA 63 zu charakterisieren, bereiten Sie eine Hantelprobe vor, indem Sie den ausgehärteten Film mit einem kundenspezifischen Stempel heißpressen. Zum Schluss wird die Probe in einen dynamisch-mechanischen Analysator mit Zugvorrichtung gelegt.

Stellen Sie das Gerät in den zwangsgesteuerten Modus und programmieren Sie das Prüfverfahren wie im schriftlichen Protokoll zu diesem Video beschrieben. Das Ergebnis des Verfahrens ist eine isotherm ausgehärtete, geformte Memory-Polymer- oder SMP-Folie, die CSMP in eine Heizplatte legt und die Temperatur höher als die Glasübergangstemperatur einstellt, um den Modul zu reduzieren und das Schneiden zu erleichtern. Zur Präparation von Einzelproben aus dem isotherm ausgehärteten s und p Film.

Schneiden Sie die S- und P-Folie mit einem Rasiermesser auf die gewünschte Probengröße zu. Die temporäre Form kann auf verschiedene Arten fixiert werden. Hier. Eine hydraulische Tischpresse mit Platten, die beheizt und gekühlt werden können, wird verwendet, um eine temporäre Topographie zu prägen.

Stellen Sie zunächst die Temperatur der PLAs auf eine Temperatur oberhalb der tg ein. Für diese Demonstration wurde ein Prägegerät hergestellt, indem Epoxidharz auf einer Schallplatte ausgehärtet wurde, um eine temporäre Form paralleler Rillen zu erzeugen. Die Prägemaschine kann aus anderen Materialien und mit unterschiedlichen Topographien hergestellt werden, muss aber steifer sein als die NOA 63.

Legen Sie bei der Prägetemperatur die Proben s und p mit der bedruckten Seite nach unten auf die Prägemaschine. Legen Sie dann die Muster und den Präger in die Presse. Tragen Sie eine Vorspannung von ca. 100 Kilopascal auf, um den Kontakt zwischen den Heiz-PLAs herzustellen und die Proben etwa fünf Minuten lang zu halten, damit die Proben eine gleichmäßige Temperatur erreichen können.

Sobald eine gleichmäßige Temperatur erreicht ist, ein bis sechs Megapascal auf die Proben auftragen und eine Minute lang halten. Das SMP bricht. Wenn eine größere Spannung angewendet wird.

Wenden Sie kleinere Spannungen an, um Topographien mit kleineren Amplituden einzuführen. Nachdem der Druck ausgeübt wurde, senken Sie die Temperatur unter den TG-Wert, indem Sie die Wasserkühlung der Pressplattformen nutzen. Wenn die Temperatur unter dem tg liegt, entfernen Sie die ausgeübte Kraft, bevor Sie das aktive Zellkulturexperiment starten.

Zur Sterilisation der Proben wird das UV-Licht der biologischen Sicherheitswerkbank verwendet. Ordnen Sie die Proben mit der Vorderseite nach unten in sterilen Schalen ohne Deckel an und schalten Sie das UV-Licht sechs Stunden lang ein. Drehen Sie die Proben dann mit der Vorderseite nach oben in neue sterile Schalen.

Schalten Sie das UV-Licht für weitere sechs Stunden ein. Die Proben müssen vor der Beschichtung mit Zellen in einen relativ stabilen Zustand gebracht werden. Geben Sie die Proben in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 150 Mikroliter vollständiges Wachstum hinzu.

Mittel pro Vertiefung. Legen Sie die Platte in einen 30 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2, bis die gewünschte Teilrückgewinnung erreicht ist. Für diese Demonstration werden die Proben 30 Stunden lang inkubiert, um eine ausreichend große Amplitude zu erzeugen, um die Zellen auszurichten.

Sobald eine Teilrückgewinnung erreicht ist, können die Proben mit Zellen plattiert werden. Legen Sie die Proben in eine neue 96-Well-Platte. Geben Sie dann zu jeder der Proben hier 150 Mikroliter Zelllösung, C3 H 10 1/2 t.

Die meisten embryonalen Fibroblasten werden mit 20.000 Zellen pro Milliliter verwendet. Um isolierte Zellen zu erhalten, lassen Sie die Zellen sich auf der temporären Topographie anheften und ausbreiten, indem Sie 9,5 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes wird die Zellmorphologie vor dem Übergang untersucht, indem Proben entnommen und Färbe- und Fluoreszenzbildgebung der Proben durchgeführt werden.

Dieses Material weist Autofluoreszenz über den größten Teil des UV- und sichtbaren Bereichs auf. Fluorvier am äußersten roten Ende des Spektrums, wie z. B. Alexa Fluor 6 47, werden empfohlen, um den Hintergrund zu reduzieren, um die Genesung der Proben auszulösen, die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator zu bringen und die Kultur 19 Stunden lang fortzusetzen. Dadurch kann sich das Material erholen und die Zellen können ihre Morphologie an die neue Topographie anpassen. Tragen Sie nach der Inkubation die entsprechenden Färbungen wie Fallin für die filamentöse Aktinbildgebung auf.

Als letzten Schritt können die Zellen auf der neuen Topographie abgebildet werden, hier ist der Bulk One Way Shape Memory einer einzelnen NOA 63-Aushärtung zu sehen. Dreimal wiederholt, wobei das Sternchen anzeigt, dass der experimentelle Beginn geheilt ist. NOA 63 ist ein transparenter, glasartiger Feststoff mit hervorragenden Formgedächtniseigenschaften.

In diesem Fall wurde das Material ausgehärtet und zeigt eine gleichmäßige TG von 51,1 Grad Celsius, die ab dem Einsetzen des Abfalls des Speichermoduls bestimmt wird. Der hier zu beobachtende Dehnungsabfall tritt bei der gemessenen tg auf. Ein großer Prozentsatz der aufgebrachten Dehnung von 4,7 % wurde nach dem Entladen um 20 Grad Celsius fixiert, was einem Fixierungsverhältnis von 89,3 % entspricht. Die feste Dehnung wurde dann in einem Verhältnis von 84,4 % in einem relativ kleinen Temperaturbereich während des Erhitzens wiederhergestellt.

Die Leistung des Formgedächtnisses zeigte bis zu drei Zyklen keine Verschlechterung, wie alle Kurven zeigen, die fast genau dem gleichen Pfad folgten. Die Amplitude der temporären Topographie nimmt mit der Zeit bei 30 Grad Celsius um 30 Stunden ab. Bei 30 Grad Celsius.

Die Amplitude wurde um ca. 50% reduziert, hier zum Zeitpunkt Null angezeigt. In den nächsten 9,5 Stunden reduziert er sich um weitere 10 %. Wenn die Wiederherstellung durch Erhöhen der Temperatur auf 37 Grad Celsius ausgelöst wird, reduziert sich die Amplitude innerhalb von 9,5 Stunden auf 0,5 % der ursprünglichen Amplitude bei verwendetem Prägegerät und einer Prägespannung von 4,9 Megapascal.

Dies entspricht einer Funktionsänderung von 13 Mikrometer Rillen zu einer nahezu ebenen Fläche. Dieses Polymer erholt sich im Temperaturbereich von 30 bis 37 Grad unter Zellkulturbedingungen. Dies ist auf die Wasseraufnahme aus dem Nährmedium zurückzuführen, der Wasserkunststoff dimensioniert das Polymer, was die Tg senkt und eine Erholung bei Temperaturen unter dem trockenen TG von 51 Grad ermöglicht.

Ein Beispiel für ein Zellverhalten, das durch die Verwendung aktiver Zellkultursubstrate gesteuert wird, ist eine Veränderung der Zytoskelettorganisation auf temporär gerillten Substraten. Bevor die Wiederherstellung ausgelöst wird, richten sich die Aktin-Mikrofilamente entlang der Richtung der Rillen aus. Nach der Erholung durch Temperaturerhöhung haben sich die Mikrofilamente neu organisiert und sind zufällig orientiert.

Umgekehrt reorganisieren sich Kontrollproben mit statischen, flachen oder statischen Rillen nach einem Temperaturanstieg nicht neu. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Geometrie der Aushärtungskammer, die Übergangstemperatur des Polymers, die Methode der Dehnungsfixierung und die Zusammensetzung des Polymers selbst angepasst werden können, um den gewünschten Übergang in Ihrem eigenen Experiment zu erreichen. Andere Methoden, wie z. B. die Echtzeit-PCR, können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie sich die Genexpression als Reaktion auf die mechanische Stimulation durch das Substrat nach seiner Entwicklung verändert.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellmechanobiologie den Weg, um die Physik des Zellzytoskeletts, der Umlagerung und der weichen Materie in zwei Dimensionen zu untersuchen. Vielen Dank für Ihr Interesse an unserer Arbeit und danke fürs Zuschauen.