Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ultrakleine Populationen biokompatibler Nanopartikel herzustellen, ihre physikalischen Eigenschaften zu charakterisieren und die Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Zellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Phasenumkehrtemperatur-Methode zur Synthese der Lipidnanopartikel verwendet wird. Dabei werden Lipid und Tensid zunächst gemeinsam geschmolzen.

Nach Zugabe einer bestimmten Wassermenge wird das Gemisch erhitzt, bis eine Phasentrennung eintritt. Anschließend wird kontinuierlich gerührt, bis eine Nanoemulsion gebildet ist und die Synthese von festen lipidbasierten Nanopartikeln oder SLN abgeschlossen ist. Danach wird die Partikelgröße und die Polydispersität mittels dynamischer Lichtstreuung oder DLS gemessen.

Differenzielle Scanning-Kalorimetrie oder DSC ist eine zusätzliche Methode, die verwendet wird, um den Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme zu bestimmen, um die Partikel weiter zu charakterisieren. Letztendlich können Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie eingesetzt werden, um die Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Zellen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Hochenergie-Methoden wie Ultraschallmikrofluidik und Hochdruckhomogenisierung besteht darin, dass es sich um eine vergleichsweise schonende Synthesemethode handelt, die sowohl einfach als auch skalierbar ist. Zum Synthetisieren der LNS werden 0,6 Milligramm eines fluoreszierenden Farbstoffs oder einer anderen lipophilen Verbindung mit 0,10 Gramm des linearen Alkans oder Lipids kombiniert.

In einem 15-Milliliter-Gefäß schmelzen Sie die Komponenten bei 90 Grad Celsius im Kern und rühren 0,11 Gramm eines linearen, nichtionischen Tensids unter. Anschließend mischen Sie das resultierende Gemisch bei 90 Grad Celsius und rühren. Danach geben Sie 1,79 Gramm sterilem Wasser zum Gemisch hinzu, erhitzen es auf 90 Grad Celsius und überwachen die Lösung visuell, bis zwei Phasen beobachtet werden.

Rühren Sie nun die Mischung, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet ist. Bereiten Sie parallel eine separate Nanoemulsion zu, ohne den fluoreszierenden Farbstoff hinzuzufügen, um sie als Kontrollprobe zu verwenden. Sterilisieren Sie anschließend jede Nanoemulsion zusätzlich mit einem sterilen 0,2-Mikron-Filter.

Verwenden Sie DLS, um die Partikelgröße und Polydispersität der S-Lns unter Verwendung eines Glases in einem Geräteaufbau zur Partikelgrößenmessung zu bestimmen, wobei vor der Messung der Proben die Partikelgröße von zwei bekannten Standards gemäß der Herstelleranleitung zur Vorbereitung und Messung der Standards ermittelt werden sollte. Anschließend messen Sie die entsprechend vorbereiteten Proben. Verwenden Sie eine Messdauer von 100 Sekunden, den Brechungsindex von Wasser und die Viskosität von Wasser bei 20 Grad Celsius.

Geben Sie den durchschnittlichen Partikeldurchmesser und die Polydispersität der Partikelgrößenverteilung an, um das thermische Verhalten der SLNs mittels DSC zu untersuchen. Pipettieren Sie zunächst die SLNs in eine 40-Mikroliter-Aluminiumpfanne mit einer Masse von etwa 25 Milligramm. Versiegeln Sie die Pfanne hermetisch mit einer Universal-Crimp-Presse, um den Feuchtigkeitsverlust während der DSC-Messung zu minimieren. Berichten Sie vor der Messung jeder Nanoemulsion im Temperaturbereich von fünf bis 80 Grad Celsius den Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme aus dem DSC-Diagramm, wobei das Minimum den Schmelzpunkt und das Integral der Fläche unter der Kurve darstellt.

Im DSC-Diagramm, dividiert durch die Menge des Materials, stellt die latente Wärme des Schmelzens der Kultur dar. Primäre humane Fibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers in flüssigem Medium für die Kultivierung humaner dermaler Fibroblasten. Ergänzt mit dem Low-Serum-Wachstumszusatzkit, pflegen Sie die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und passagieren Sie sie bei Erreichen von 80 % Konfluenz für die MTT- und Bildanalyse, indem Sie Zellen ansäen.

In einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Well. Die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius equilibrieren lassen, bevor zum Zeitpunkt Null SLMs in vollständigem Medium auf die gewünschte Lipidkonzentration verdünnt und 10 Mikroliter pro Well in jedes Replikat-Well der 96-Well-Platte gegeben werden. Nach 24 Stunden Inkubation mit SLNs die Zellviabilität mittels MTT-Assay gemäß Herstellerprotokoll bestimmen. Die Zellen einmal waschen und 100 Mikroliter frisches Medium zu jedem hinzufügen.

Die Kontrollbrunnen werden dadurch getötet, dass sie 10 Minuten lang in einer 70 %igen Methanollösung inkubiert und anschließend mit frischem Medium ersetzt werden. Geben Sie das MTT-Reagenz mit 10 Mikrolitern pro Brunnen zu jedem Brunnen der Mikrotiterplatte hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der Übernachtinkubation lösen Sie die intrazelluläre Form und die Kristalle mit 100 Mikrolitern der beigefügten Detergenslösung auf. Gemäß Herstellerprotokoll inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang bei Raumtemperatur in der Detergenslösung, bevor Sie die Absorptionswerte bestimmen.

Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts zur Vorbereitung auf die Mikroskopie. Waschen Sie die Fibroblasten zweimal mit steriler, gepufferter Phosphatlösung. Fixieren Sie die Zellen für 10 Minuten mit kaltem Methanol (70 %) zu bestimmten Zeitpunkten nach der Behandlung der Fibroblasten mit lns.

Nach 10 Minuten ersetzen Sie das Methanol durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS, bevor Sie Bilder mit einem umgekehrten Mikroskop aufnehmen. Die synthetisierten S-SLNs führten zu kontrollierten SLNs mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 18,59 und einer Polydispersität von 5,83 sowie zu mit Nile Red beladenen SLMs mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 16,87 Nanometern und einer Polydispersität von 4,47, gemessen mittels eines MTT-Assays. Der Dosis-Wirkungs-Effekt auf den zellulären Stoffwechsel wurde bestimmt, wobei eine zunehmende Partikelkonzentration zu einer Abnahme der zellulären Vitalität führte.

Es wurde kein beobachteter Unterschied in der Toxizität zwischen Zellen, die allein SLN ausgesetzt waren, und Zellen, die mit Nile Red beladene SLN ausgesetzt waren, festgestellt. Parallel dazu wurden die Zellen visuell auf ihre Anheftung an die Gewebekultur überprüft. Polystyrol und Bilder wurden angefertigt, um sowohl die repräsentative zelluläre Morphologie als auch die Aufnahme fluoreszierender Partikel über die Zeit hinweg zu demonstrieren, wobei eine Dosis von fünf Mikrogramm pro Milliliter verwendet wurde.

Die Aufnahme von Lipidpartikeln wurde zwei Stunden nach der Exposition beobachtet. Der Grad der Nanopartikel-Inkorporation wurde durch Messung der Intensität der Nile-Red-Fluoreszenz in dendritischen Zellen aus murinem Knochenmark, oder BMDCs, mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Es wurde eine direkte Korrelation zwischen der verwendeten Konzentration von SNS und der in BMDCs gemessenen Menge an Fluoreszenz beobachtet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ultrakleine Populationen biokompatibler Nanopartikel synthetisiert, ihre physikalischen Eigenschaften charakterisiert und die Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Zellen untersucht.