Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ultrakleine Populationen biokompatibler Nanopartikel zu synthetisieren, ihre physikalischen Eigenschaften zu charakterisieren und die Wechselwirkungen von Partikelzellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Phaseninversionstemperaturmethode zur Synthese der Lipid-Nanopartikel verwendet wird. Dabei werden Lipid und Tensid zunächst mitgeschmolzen.

Nach Zugabe einer bestimmten Menge Wasser wird das Gemisch bis zur Phasentrennung erhitzt. Das Gemisch wird dann kontinuierlich gerührt, bis eine Nanoemulsion entsteht und die Synthese von festen Lipid-Nanopartikeln oder SLN abgeschlossen ist. Als nächstes wird die dynamische Lichtstreuung (DLS) verwendet, um die Partikelgröße und die Polydispersität zu messen.

Die dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) ist eine zusätzliche Technik, die zur Bestimmung des Schmelzpunkts und der latenten Schmelzwärme verwendet wird, um die Partikel weiter zu charakterisieren, letztendlich können Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie verwendet werden, um die Wechselwirkungen der Partikelzellen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Hochenergiemethoden wie Ultraschall-Mikrofluid und Hochdruck-Homogenisierung besteht darin, dass es sich um eine vergleichsweise schonende Synthesetechnik handelt, die sowohl einfach als auch skalierbar ist. Zur Synthese des LNS kombinieren Sie 0,6 Milligramm Fluoreszenzfarbstoff oder eine andere lipophile Verbindung und 0,10 Gramm des linearen Alcan oder Lipids.

In einem 15-Milliliter-Fläschchen die Komponenten bei 90 Grad Celsius aufschmelzen und unter Rühren 0,11 Gramm eines linearen nichtionischen Tensids zugeben. Dann mlt die resultierende Mischung bei 90 Grad Celsius und rührt um. Fügen Sie dann 1,79 Gramm steriles Wasser zu der auf 90 Grad Celsius erhitzten Mischung hinzu und überwachen Sie die Lösung visuell, bis zwei Phasen beobachtet werden.

Nun rührst du die Mischung so lange, bis eine transparente Nanoemulsion entsteht. Parallel dazu wird eine separate Nanoemulsion ohne Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs hergestellt, um als Kontrollprobe zu dienen. Sterilisieren Sie jede Nanoemulsion mit einem sterilen 0,2-Mikron-Filter weiter.

Verwendung von DLS zur Messung der Partikelgröße und Polydispersität des S lns unter Verwendung eines Glases in einem Instrumentendesign zur Messung der Partikelgröße Vor der Messung der Proben sollte die Partikelgröße von zwei bekannten Standards gemäß dem Protokoll des Herstellers für die Vorbereitung und Messung der Standards gemessen werden. Messen Sie anschließend die Proben, wie sie jeweils vorbereitet sind. Verwenden Sie eine Laufzeit von 100 Sekunden, den Brechungsindex von Wasser und die Viskosität von Wasser bei 20 Grad Celsius.

Ermitteln Sie den durchschnittlichen Partikeldurchmesser und die Polydispersität der Partikelgrößenverteilung, um das thermische Verhalten des S lns mit DSC zu untersuchen. Pipettieren Sie zunächst das S LNS in eine 40-Mikroliter-Aluminiumwanne mit einer Masse von ca. 25 Milligramm. Versiegeln Sie die Pfanne hermetisch mit einer Universal-Bördelpresse, um den Feuchtigkeitsverlust während des DSC-Scans zu minimieren. Bevor Sie jede Nanoemulsion von fünf bis 80 Grad Celsius messen, geben Sie den Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme aus dem DSC-Diagramm an, wobei das Tal den Schmelzpunkt und das Integral der Fläche unter der Kurve darstellt.

Im DSC-Diagramm stellt dividiert durch die Materialmenge die latente Wärme der Schmelzkultur dar. Primäre humane Fibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers in flüssigem Medium für die Kultur von humanen dermalen Fibroblasten. Ergänzend mit dem Ergänzungskit für niedriges Serumwachstum halten Sie die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und Subkultur bei Erreichen einer Konfluenz von 80 % sowohl für MTT- als auch für bildgebende Analyse-Samenzellen.

In einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Well. Lassen Sie die Zellen über Nacht vor der SLN-Exposition bei 37 Grad Celsius äquilibrieren, verdünnen Sie s SLMs in vollständigem Medium, um die gewünschte Lipidkonzentration zu erreichen, und fügen Sie nach 24 Stunden Inkubation mit S lns 10 Mikroliter pro Vertiefung zu jeder replizierten Vertiefung in der 96-Well-Platte hinzu, bestimmen Sie die zelluläre Lebensfähigkeit unter Verwendung des MTT-Assays gemäß dem Protokoll des Herstellers. Waschen Sie die Zellen einmal und fügen Sie jeweils 100 Mikroliter frisches Medium hinzu.

Töten Sie die Kontrollvertiefungen ab, indem Sie sie 10 Minuten lang in einer 70%igen Methanollösung inkubieren, bevor Sie sie durch frisches Medium ersetzen. Geben Sie das MTT-Reagenz mit 10 Mikrolitern pro Vertiefung in jede Vertiefung der Mikroplatte und inkubieren Sie nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius, lösen Sie die intrazelluläre Form und die Kristalle mit 100 Mikrolitern der bereitgestellten Detergenzlösung auf. Gemäß dem Protokoll des Herstellers werden die Zellen drei Stunden lang bei Raumtemperatur in der Detergenzienlösung inkubiert, bevor die Absorptionswerte erreicht werden.

Verwendung eines Mikroplatten-Readers zur Vorbereitung auf die Mikroskopie. Waschen Sie die Fibroblasten zweimal mit steriler, mit Phosphat gepuffter Kochsalzlösung. Fixieren Sie die Zellen für 10 Minuten mit kaltem, 70%igem Methanol zu bestimmten Zeitpunkten nach der Dosierung von Fibroblasten mit lns.

Ersetzen Sie nach 10 Minuten das Methanol durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS, bevor Sie Bilder mit einem inversen Mikroskop aufnehmen. Das synthetisierte S SLN führte unter Verwendung eines MTT-Assays zu Kontroll-S-LNS mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 18,59 und einer Polydispersität von 5,83 und Nilrot-beladenen SLMs mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 16,87 Nanometern und einer Polydispersität von 4,47. Der Dosis-Wirkungs-Effekt auf den zellulären Stoffwechsel wurde gemessen, wobei eine Erhöhung der Partikelkonzentration zu einer Abnahme der zellulären Lebensfähigkeit führte.

Es wurde kein Unterschied in der Toxizität zwischen Zellen beobachtet, die nur SLN ausgesetzt waren, und Zellen, die mit Nilrot beladen waren. SLN. Parallel dazu wurden die Zellen visuell auf ihre Adhärenz an der Gewebekultur untersucht. Polystyrol und Bilder wurden aufgenommen, um sowohl die repräsentative zelluläre Morphologie als auch die Aufnahme von fluoreszierenden Partikeln im Laufe der Zeit mit einer Dosis von fünf Mikrogramm pro Milliliter zu demonstrieren.

Die Aufnahme von Lipidpartikeln wurde zwei Stunden nach der Exposition beobachtet. Der Grad des Einbaus von Nanopartikeln wurde durch Messung der Intensität der Nilrotfluoreszenz in dendritischen Zellen (B-MDCs) der Maus im Knochenmark mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Es wurde eine direkte Korrelation zwischen der Konzentration der verwendeten SNS und der in B-MDCs gemessenen Fluoreszenzmenge beobachtet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ultrakleine Populationen biokompatibler Nanopartikel synthetisiert, ihre physikalischen Eigenschaften charakterisiert und die Wechselwirkungen zwischen Partikelzellen untersucht.