Name: Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Synthese biokompatibler Lipidnanopartikel mit der Phaseninversions-Temperaturmethode für intrazelluläre Targeting-Anwendungen. Diese schonende Technik ermöglicht präzise Charakterisierung und Untersuchung von Zell-Partikel-Interaktionen.

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde unterstützt von der Forschungs- und Erkundungsentwicklungsabteilung des Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, dem Office of Technology Transfer und dem Stuart S. Janney Fellowship Program, zusätzlich zum National Heart, Lung, and Blood Institute der National Institutes of Health unter der Fördernummer R21HL127355.

1. Die Verarbeitung von SLNs <ol><li> Synthese von SLNs Hinweis: Mit der PIT-Methode 1,17,20, um die Unter 20 nm SLNs 1 vorzubereiten. <ol><li> Verwenden Sie aseptisch, Bioreagenzien oder Zellkultur-Reagenzien und sterilen Materialien (dh, Pipetten, Spatel, Fläschchen, etc.). </li><li> Verwenden Sie ein Biosicherheitswerkbank für die Synthese von SLN (Abbildung 2). </li><li> Kombinieren 0,6 mg Fluoreszenzfarbstoff (Nile Red (NIR) ist NiR Konzentration etwa 0,3 mg / ml) und 0,10 g Heneicosan (Lipid, 5 w / w% Lipid-Konzentration) in einem Glasfläschchen (15 ml), Co-Schmelze mit 90 ° C und umrühren. </li><li> Hinzufügen 0,11 g Polyoxyethylen (10) oleylether (Tensid, 5,5 Gewicht / Gewicht% Tensidkonzentration). Co-Schmelzen der resultierenden Mischung bei 90 ° C und rühren. </li><li> Hinzufügen 1,79 g steriles Wasser zu der Mischung, Erhitzen auf 90ºC und Rühren, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet. Hinweis: Unter fortgesetztem Rühren und kontrollierte Kühlung, SLNs erzeugt. Diese Bedingungen verursachen eine Inversion der Wasser-in-Öl-Emulsion zu einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Lipophile Moleküle wie NiR Partition auf die Lipidtröpfchen. </li><li> Bereiten Sie eine Nanoemulsion parallel ohne Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs, um als Kontrollprobe zu dienen. Kombinieren 0,10 g Heneicosan und 0,11 g Polyoxyethylen (10) oleylether in ein Fläschchen (15 ml) Co-Schmelze bei 90 ° C und umrühren. <ol><li> Hinzufügen 1,79 g steriles Wasser zu der Mischung, Erhitzen auf 90ºC und Rühren, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet. </li></ol></li><li> Weitere Sterilisierung jedes Nanoemulsion mit einer sterilen 0,2 um Filter. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Synthese von SLN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </li><li> Teilchengröße und Polydispersity <ol><li> Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung (DLS), um die Teilchengröße und Polydispersität der SLN 1 unter Verwendung einer Glasküvette und ein Gerät zur Partikelgröße zu messen messen. </li><li> Vor den Messungen der Proben zu messen, die Teilchengrößen der beiden bekannten Normen nach Herstellerprotokoll für die Standards Vorbereitung und Messung. </li><li> Füllen Sie das Glas Küvetten mit 1,5 ml Standardlösung und messen Sie die Standardlösung mit den gleichen Messbedingungen wie die Proben. Hinweis: Vorheriger Schritt wurde für jeden Standard wiederholt. </li><li> Messen Sie die Proben vorbereitet. Für jeden, die folgenden Versuchsparameter: eine Laufzeit von 100 sec, Brechungsindex von Wasser (1,33), die Viskosität von Wasser bei 20 ° C (1.002 mPa · s). Anmerkung: Diese Technik verwendet frequenzverschobenen Lichts, um die Größe der Nanopartikel zu messen. </li><li> Berichten über den mittleren Teilchendurchmesser und Polydispersität particle Größenverteilung. </li></ol></li><li> Schmelzpunkt und latente Schmelzwärme <ol><li> Verwenden eines Differential-Scanning-Kalorimeter (DSC) mit einem Auto-Sampler und Flüssigstickstoffkühlquelle ausgestattet, um das thermische Verhalten von SLNs 1 zu untersuchen. </li><li> Pipettieren Sie den bei der Herstellung SLNs in einen 40 ul Aluminiumschale mit einer Masse von etwa 25 mg und hermetisch abzudichten die Pfanne mit einer Universal crimper drücken, um den Feuchtigkeitsverlust während der DSC-Scan zu minimieren. </li><li> Messen jedes Nanoemulsion 5 bis 80 ° C. </li><li> Bericht der Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme aus dem DSC-Diagramm, wo das Tal stellt den Schmelzpunkt und das Integral der Fläche unter der Kurve in der DSC-Diagramm, geteilt durch die Menge des Materials stellt die latente Schmelzwärme. </li></ol></li></ol> 2. SLNs Wechselwirkungen mit Fibroblasten und dendritischen Zellen <ol><li> Kultur von primären humanen Fibroblasten <ol><li> Kultur primären humanen fiFibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem flüssigen Medium für die Kultur von humanen dermalen Fibroblasten (Medium 106) mit der niedrigen Serum-Wachstumsergänzung (LSGS) -Kit ergänzt. Aufrechtzuerhalten Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C, 5% CO 2 und Subkultur bei Erreichen 80% Konfluenz. </li><li> Für beide MTT und Bildanalyse, Samenzellen in einem 96-Well-Platte, bei einer Dichte von 2 × 10 4 Zellen pro Vertiefung, und lassen Sie sie bei 37 ° CO / N vor der SLN Belichtung ausgleichen lassen. </li><li> Zum Zeitpunkt Null, verdünnter SLNs in Komplettmedium ab (Abbildung 4), in Bezug auf Lipidkonzentration und Zugabe von 10 ul pro Vertiefung an jedem Replikat auch in der 96-Well-Platte. </li><li> Aufrechtzuerhalten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 während der Inkubationszeit. </li></ol></li><li> MTT Toxizitätstest <ol><li> Nach 24 h Inkubation mit SLNs bestimmen zelluläre Lebensfähigkeit unter Verwendung des MTT-Assay nach dem Protokoll des Herstellers. &lt;/ li&gt; <li> Waschen Sie die Zellen einmal und fügen Sie frisches Medium in jede Vertiefung (100 ul / Vertiefung). Getötet Kontrolle Wells durch Inkubation in einer 70% igen Methanol-Lösung für 10 min vor dem Ersetzen mit frischem Medium. </li><li> Hinzufügen MTT-Reagens (10 ul pro Vertiefung) zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte und Inkubieren O / N bei 37 ° C. </li><li> Nach O / N Inkubation solubilisieren intrazellulärem Formazin Kristalle mit dem vorgesehenen Detergenslösung (100 ul pro Vertiefung) gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Nach 3 h Inkubation bei RT erhalten Absorptionswerte bei einer Meßwellenlänge von 570 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät. Anmerkung: MTT-Reagenz verwendet wird, sollte weniger als 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid. </li></ol></li><li> Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Dosierung von Fibroblasten mit SLN, wäscht die Fibroblasten zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und fixieren 10 min mit kaltem 70% igem Methanol. </li><li> Nach 10 min, Ersetzen Sie das Methanol mit PBS und die Aufnahmen mit einem inversen Mikroskop, mit einem Bandpass (BP) 690/50-nm-Filter-Set. </li></ol></li><li> Kultur von Knochenmark der Maus Dendritic Cells <ol><li> Induzieren Maus-Knochenmark gewonnene dendritische Zellen (BMDC) wie zuvor beschrieben 23,24. Kurz gesagt, Platte Einzelzellsuspensionen von C57BL / 10 Knochenmark in 100 mm Petrischalen bei 2 × 10 6 / Platte mit rekombinantem murinen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF, 300 U / ml) und rekombinantem murinem IL-4 (B-Zell-stimulierender Faktor, 200 U / ml). Ändern Medien alle 3 Tage. </li><li> Am 7. Tag hinzuzufügen NiR belastet SLN auf die Schalen in einer Endkonzentration von 0,5 und 5,0 ug / ml Lipid und Aufrechterhaltung der Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für die gewünschte Dauer der Exposition. </li><li> Sammeln Zellen von den Schalen durch Ansaugen alle Medien in der Platte gesammelt wird in ein 50 ml Röhrchen, gefolgt von gründlichem Waschen der Platte (lose ad verdrängenrente Zellen) mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 4 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in der gleichen 50-ml-Tube. </li></ol></li><li> Beurteilung der SLNs Incorporation über Durchflusszytometrie <ol><li> Bestimmen Sie die Konzentration des in Punkt 2.4.3 erhaltene Zellsuspension und vertreiben 3x10 5 Zellen in eine 12 mm x 75 mm Rund FACS-Röhrchen. </li><li> Die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml PBS und anschließendem Zentrifugieren der Röhrchen für 5 min bei 400 · g, bei einer Temperatur von 4 ° C. </li><li> Der Überstand verworfen und das Pellet mit 100 ul PBS / 2 mM EDTA / 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) (Färbepuffer) mit anti-CD11c-FITC monoklonalen Antikörper (0,25 ug / ml final). Inkubieren für 30 min auf Eis im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 1 ml PBS und dann zentrifugieren Röhrchen 5 min bei 400 · g, bei einer Temperatur von 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren jedesPellet mit 400 &amp; mgr; l Färbepuffer. Die Zellen sind nun bereit für die Übernahme der Proben mit einem Durchflusszytometer (möglicherweise mit blauen und roten Lasern ausgestattet ist). </li><li> Mit Hilfe der Durchflusszytometrie-Analyse-Software, zu bewerten den Grad der Einbeziehung der SLN von DC durch Gating auf die Bevölkerung von CD11c + Zellen (FITC positiv) und Vergleichen der Intensität der SLN-assoziierte Fluoreszenz (in der PerCP-Cy5.5 oder APC-Kanälen gemessen). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In dieser Studie wurden die Synthese SLNs und ihre Anwendbarkeit für eine intrazelluläre Targeting-Anwendungen erforscht. Diese biokompatible Nanopartikel versprechen als Lieferfahrzeuge für mehrere Anwendungen einschließlich der Arzneimittelabgabe, Gen-Silencing, und Impfstoff-Technologien 25-30 gezeigt. Ultrakleine SLNs wurden unter Verwendung eines einfachen Prozesses hergestellt, und ihre Wechselwirkungen mit primären Hautzellen und primären Immunzellen wurden untersucht. SLNs wurden zur Verkapselung von ...

Nanopartikel-basierten Lieferfahrzeuge haben ein großes Versprechen für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen gezeigt, die Bereitstellung eines Mechanismus, um gezielt zu verändern zellulären Signaltransduktion und Genexpression. Diese Fahrzeuge können mit Medikamenten, Proteinen und Nukleinsäuren, einen Aufprall zellulären Reaktionen und erreichen eine gewünschte Wirkung auf Zielgewebe beladen werden. Viele Arten von Nano zu therapeutischen und diagnostischen Nutzen, einschließlich Lipide, Polymere, Silizium und magnetischen Materialien untersucht worden. Diese Systeme sind attraktiv aufgrund ihres Potentials zur lokalisierten Arzneimittelabgabe, erhöhten therapeutischen Konzentration im Zielgewebe, und eine Verringerung der systemischen Toxizität. Feste Lipidnanopartikel (SLN) sind ein gut untersuchtes Beispiel einer Nanopartikel-Abgabesystem, das als vielversprechende Arzneimittelabgabevehikel in den letzten Jahren abzeichnet. SLNs kann leicht für mehrere Anwendungen einschließlich Bio-Sensing 1, Kosmetika 2 und t formulierenherapeutic Lieferung 3-7. Ihr Nutzen ergibt sich aus der Tatsache, dass sie vollständig aus resorbierbaren, ungiftig Lipiden, was zu einer verbesserten Biokompatibilität. Während der Synthese können lipophile Medikamente in SLN Fahrzeuge aufgenommen werden, wodurch Arzneimittellöslichkeit und Eignung Erhöhung für die parenterale Verabreichung. SLN Fahrzeugen auch dazu beitragen, eingekapselt Therapeutika zu stabilisieren, wodurch deren Abbau und Freiraum, und die Maximierung der therapeutischen Wirkung. Diese Fahrzeuge sind vor allem für Langzeitwirkung, kontrollierte Trennöle gut geeignet aufgrund ihrer Stabilität bei Körpertemperatur 3,4,8,9. Wichtiger ist, Verkapselung von Wirkstoffen in Lipidnanopartikel ändert die intrinsische die pharmakokinetischen Profile der Arzneimittelmoleküle. Dies bietet einen Vorteil, indem sie die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen mit einem engen therapeutischen Index. Die Freisetzungsrate des SLN-einge Therapeutika kann abgestimmt basieren auf der Lipidabbaurate oder das Medikament Diffusionsgeschwindigkeit in dieLipidmatrix. SLNs werden oft entwickelt, um in spezifischen Zielgeweben ansammeln. Beispielsweise ihre Größe (typischerweise größer als 10 nm) potenziert Retention im Blutkreislauf, wobei der Leaky-Vaskulatur Tumorgewebe erleichtert Abscheidung. Darüber hinaus hat der Weg der Verabreichung Partikel wurde gezeigt, daß die biologische Verteilung, die das Potenzial zu verändern, wie Lymphknoten 10,11 um spezifische physiologische Zielstrukturen. Bei der Abscheidung in Zielgeweben zu erzielen geeigneten zellulären Wechselwirkungen und eventuelle Internalisierung von Nanopartikeln ist schwierig aufgrund der Fähigkeit der Zellmembranen, um den Fluss von Ionen und Molekülen in die und aus der Zelle 12 selektiv zu steuern. Um die zelluläre Aufnahme zu erleichtern, ist es möglich, Nano mit spezifischen Liganden einschließlich Peptiden, kleine Moleküle, als auch monoklonale Antikörper 13,14 modifizieren. Verschiedene Mechanismen, die sowohl passive Penetration und aktiven Transport von Nanopartikelnüber die Zellmembran sind zuvor beschrieben worden 3,12,15. Im allgemeinen hat es sich gezeigt, daß zell Nanopartikel Wechselwirkungen werden durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Nanopartikel einschließlich der Größe, Form, Oberflächenladung und Oberflächenchemie beeinflusst neben zellspezifischen Parameter wie Zelltyp oder Zellzyklus-Phase 12. Eine frühere Untersuchung zeigte die Synthese von Sub-10 nm SLNs zur topischen 16 und Biomarker-Erkennungsanwendungen 1 unter Verwendung der Phaseninversionstemperatur (PIT) Verfahren 17. Dies ist eine schonende Syntheseverfahren, wobei 2 die Zusammensetzung konstant bleibt, während die Temperatur allmählich verändert wird. Kontinuierliches Rühren der erhitzten Lösung beim Abkühlen auf Raumtemperatur führt zu einer Nanoemulsion. Dieses Verfahren resultiert in der Synthese von SLNs mit kleinerer Teilchengrße 1 als die zuvor unter Verwendung verschiedener Verfahren für die Synthese von Lipid nan gemeldetoparticles 17-22. Die resultierende Größenskala von weniger als 20 nm beträgt, stellt einen Vorteil für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen aufgrund der erhöhten Oberfläche und dem Potential für erhöhte zelluläre Interaktionen. Eine schematische Darstellung SLNs designt einen fluoreszierenden Farbstoff oder therapeutischen liefern, ist in Abbildung 1 dargestellt. Die SLN bestehen aus einer Lipid Innenraum (zB lineares Alkan), die die Einarbeitung von lipophilen Verbindungen (beispielsweise Farbstoffe oder Therapeutika) und einem Tensid Außen (zB lineares nichtionisches Tensid) von Wasser umgeben ist. In dieser Studie wurden SLNs mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen, und als ein Modell verwendet, um Partikel-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Primäre humane dermale Fibroblasten und Maus dendritischen Zellen wurden farbstoffbeladenen SLN über die Zeit ausgesetzt, um Wechselwirkungen im Hinblick auf Toxizität und Partikelaufnahme charakterisieren. A 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) -Assay wurde utilium geeignete Dosierung Ebenen zu etablieren zed. Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie zwei eingesetzt werden, um Partikelaufnahme in vitro zu untersuchen Methoden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des SLN, die die Hauptbestandteile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Nilrot (NiR)</td><td>Sigma</td><td>19123</td><td>BioReagenz, geeignet für Fluoreszenz, &ge; 98,0%</td></tr><tr><td>Heneicosan</td><td>Aldrich</td><td>286052</td><td>98%</td></tr><tr><td>Brij O10</td><td>Sigma</td><td>P6136</td><td>Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylen (10) Oleylether</td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Sterilfiltriert, BioReagenz, geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>Spritzenfilter 0,2 & Mikro; m Supor Membran Low Protein Binding</td><td>Life Sciences</td><td>PN4612</td><td>Nicht-pyrogener</td></tr><tr><td>Nanotrac Ultra&nbsp;</td><td>Microtrac</td><td>Seriennummer U1985IS</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Differential Scanning Calorimeter</td><td>Mettlet-Toledo</td><td></td><td>Instument</td></tr><tr><td>Primäre humane Fibroblasten&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C-004-5C</td> Medium <td>für Neugeborene (HDFn)</td></tr><tr><td>Medium 106</td><td>Life Technologies</td><td>M-106-500</td><td>Ein steriles, flüssiges Medium für die Kultivierung von humanen dermalen Fibroblasten.</td></tr><tr><td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td><td>Life Technologies</td><td>S-003-K</td><td>Alle Komponenten des kompletten LSGS</td></tr><tr><td>MTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-025-K</td><td>Sensitives Kit für die Messung der Zellproliferation basierend auf der Reduktion des Tetrazoliumsalzes, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromid (MTT)</td></tr><tr><td>Safire2 Mikroplatten-Reader</td><td>Tecan</td><td>----</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Rekombinantes murines GM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td>>97%, von SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und sichtbar durch Silberfärbung.</td></tr><tr><td>Rekombinante murine IL-4&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td>>97%, durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und sichtbar durch Silberfärbung.</td></tr></tbody></table>

feste lipidnanopartikel (sln) für die intrazelluläre targeting-anwendungen

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanopartikel-basierte Verabreichungsvehikel haben sich als vielversprechend für intrazelluläre Targeting-Anwendungen erwiesen und bieten einen Mechanismus, um die zelluläre Signalübertragung und Genexpression spezifisch zu verändern. In einer früheren Untersuchung wurde die Synthese von ultrakleinen festen Lipid-Nanopartikeln (SLNs) für die topische Wirkstoffverabreichung und den Biomarker-Nachweis demonstriert. SLNs sind ein gut untersuchtes Beispiel für ein Nanopartikel-Verabreichungssystem, das sich als vielversprechendes Vehikel zur Verabreichung von Medikamenten erwiesen hat. In dieser Studie wurden SLNs mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen und als Modell zur Untersuchung von Partikel-Zell-Wechselwirkungen verwendet. Die Phaseninversionstemperatur-Methode (PIT) wurde für die Synthese ultrakleiner Populationen biokompatibler Nanopartikel verwendet. Ein 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wurde verwendet, um geeignete Dosierungsniveaus vor den Nanopartikel-Zell-Interaktionsstudien festzulegen. Darüber hinaus wurden primäre humane dermale Fibroblasten und dendritische Zellen der Maus über die Zeit mit farbstoffbeladenem SLN exponiert und die Wechselwirkungen in Bezug auf Toxizität und Partikelaufnahme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie charakterisiert. Diese Studie zeigte, dass ultrakleine SLNs als Nanopartikel-Abgabesystem für das intrazelluläre Targeting verschiedener Zelltypen geeignet sind.

Die PIT-Verfahren wurde verwendet, um die SLN zu synthetisieren und die Phaseninversionstemperatur wurde bestimmt unter Verwendung eines Wasserbades. Die Proben wurden langsam erwärmt und vorsichtig gerührt, bis die Lösung klar erschien. Der Phaseninversionstemperatur für die SLNs unter Verwendung Heneicosan Lipid 45 ° C. Tabelle 1 faßt die Teilchengröße, Polydispersität, Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme für den SLN. Die synthetisierten Verwendung der oben beschriebenen Verarbeitungsbedingungen...

In dieser Studie wurde eine Methode zur Synthese ultrakleiner Populationen biokompatibler Nanopartikel beschrieben, sowie mehrere in vitro Methoden, mit denen ihre zellulären Wechselwirkungen bewertet werden können.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ultrakleine Populationen biokompatibler Nanopartikel herzustellen, ihre physikalischen Eigenschaften zu charakterisieren und die Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Zellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Phasenumkehrtemperatur-Methode zur Synthese der Lipidnanopartikel verwendet wird. Dabei werden Lipid und Tensid zunächst gemeinsam geschmolzen.Nach Zugabe einer bestimmten Wassermenge wird das Gemisch erhitzt, bis eine Phasentrennung eintritt. Anschließend wird kontinuierlich gerührt, bis eine Nanoemulsion gebildet ist und die Synthese von festen lipidbasierten Nanopartikeln oder SLN abgeschlossen ist. Danach wird die Partikelgröße und die Polydispersität mittels dynamischer Lichtstreuung oder DLS gemessen.Differenzielle Scanning-Kalorimetrie oder DSC ist eine zusätzliche Methode, die verwendet wird, um den Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme zu bestimmen, um die Partikel weiter zu charakterisieren. Letztendlich können Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie eingesetzt werden, um die Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Zellen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Hochenergie-Methoden wie Ultraschallmikrofluidik und Hochdruckhomogenisierung besteht darin, dass es sich um eine vergleichsweise schonende Synthesemethode handelt, die sowohl einfach als auch skalierbar ist. Zum Synthetisieren der LNS werden 0,6 Milligramm eines fluoreszierenden Farbstoffs oder einer anderen lipophilen Verbindung mit 0,10 Gramm des linearen Alkans oder Lipids kombiniert.In einem 15-Milliliter-Gefäß schmelzen Sie die Komponenten bei 90 Grad Celsius im Kern und rühren 0,11 Gramm eines linearen, nichtionischen Tensids unter. Anschließend mischen Sie das resultierende Gemisch bei 90 Grad Celsius und rühren. Danach geben Sie 1,79 Gramm sterilem Wasser zum Gemisch hinzu, erhitzen es auf 90 Grad Celsius und überwachen die Lösung visuell, bis zwei Phasen beobachtet werden.Rühren Sie nun die Mischung, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet ist. Bereiten Sie parallel eine separate Nanoemulsion zu, ohne den fluoreszierenden Farbstoff hinzuzufügen, um sie als Kontrollprobe zu verwenden. Sterilisieren Sie anschließend jede Nanoemulsion zusätzlich mit einem sterilen 0,2-Mikron-Filter.Verwenden Sie DLS, um die Partikelgröße und Polydispersität der S-Lns unter Verwendung eines Glases in einem Geräteaufbau zur Partikelgrößenmessung zu bestimmen, wobei vor der Messung der Proben die Partikelgröße von zwei bekannten Standards gemäß der Herstelleranleitung zur Vorbereitung und Messung der Standards ermittelt werden sollte. Anschließend messen Sie die entsprechend vorbereiteten Proben. Verwenden Sie eine Messdauer von 100 Sekunden, den Brechungsindex von Wasser und die Viskosität von Wasser bei 20 Grad Celsius.Geben Sie den durchschnittlichen Partikeldurchmesser und die Polydispersität der Partikelgrößenverteilung an, um das thermische Verhalten der SLNs mittels DSC zu untersuchen. Pipettieren Sie zunächst die SLNs in eine 40-Mikroliter-Aluminiumpfanne mit einer Masse von etwa 25 Milligramm. Versiegeln Sie die Pfanne hermetisch mit einer Universal-Crimp-Presse, um den Feuchtigkeitsverlust während der DSC-Messung zu minimieren. Berichten Sie vor der Messung jeder Nanoemulsion im Temperaturbereich von fünf bis 80 Grad Celsius den Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme aus dem DSC-Diagramm, wobei das Minimum den Schmelzpunkt und das Integral der Fläche unter der Kurve darstellt.Im DSC-Diagramm, dividiert durch die Menge des Materials, stellt die latente Wärme des Schmelzens der Kultur dar. Primäre humane Fibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers in flüssigem Medium für die Kultivierung humaner dermaler Fibroblasten. Ergänzt mit dem Low-Serum-Wachstumszusatzkit, pflegen Sie die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und passagieren Sie sie bei Erreichen von 80 % Konfluenz für die MTT- und Bildanalyse, indem Sie Zellen ansäen.In einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Well. Die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius equilibrieren lassen, bevor zum Zeitpunkt Null SLMs in vollständigem Medium auf die gewünschte Lipidkonzentration verdünnt und 10 Mikroliter pro Well in jedes Replikat-Well der 96-Well-Platte gegeben werden. Nach 24 Stunden Inkubation mit SLNs die Zellviabilität mittels MTT-Assay gemäß Herstellerprotokoll bestimmen. Die Zellen einmal waschen und 100 Mikroliter frisches Medium zu jedem hinzufügen.Die Kontrollbrunnen werden dadurch getötet, dass sie 10 Minuten lang in einer 70 %igen Methanollösung inkubiert und anschließend mit frischem Medium ersetzt werden. Geben Sie das MTT-Reagenz mit 10 Mikrolitern pro Brunnen zu jedem Brunnen der Mikrotiterplatte hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der Übernachtinkubation lösen Sie die intrazelluläre Form und die Kristalle mit 100 Mikrolitern der beigefügten Detergenslösung auf. Gemäß Herstellerprotokoll inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang bei Raumtemperatur in der Detergenslösung, bevor Sie die Absorptionswerte bestimmen.Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts zur Vorbereitung auf die Mikroskopie. Waschen Sie die Fibroblasten zweimal mit steriler, gepufferter Phosphatlösung. Fixieren Sie die Zellen für 10 Minuten mit kaltem Methanol (70 %) zu bestimmten Zeitpunkten nach der Behandlung der Fibroblasten mit lns.Nach 10 Minuten ersetzen Sie das Methanol durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS, bevor Sie Bilder mit einem umgekehrten Mikroskop aufnehmen. Die synthetisierten S-SLNs führten zu kontrollierten SLNs mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 18,59 und einer Polydispersität von 5,83 sowie zu mit Nile Red beladenen SLMs mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 16,87 Nanometern und einer Polydispersität von 4,47, gemessen mittels eines MTT-Assays. Der Dosis-Wirkungs-Effekt auf den zellulären Stoffwechsel wurde bestimmt, wobei eine zunehmende Partikelkonzentration zu einer Abnahme der zellulären Vitalität führte.Es wurde kein beobachteter Unterschied in der Toxizität zwischen Zellen, die allein SLN ausgesetzt waren, und Zellen, die mit Nile Red beladene SLN ausgesetzt waren, festgestellt. Parallel dazu wurden die Zellen visuell auf ihre Anheftung an die Gewebekultur überprüft. Polystyrol und Bilder wurden angefertigt, um sowohl die repräsentative zelluläre Morphologie als auch die Aufnahme fluoreszierender Partikel über die Zeit hinweg zu demonstrieren, wobei eine Dosis von fünf Mikrogramm pro Milliliter verwendet wurde.Die Aufnahme von Lipidpartikeln wurde zwei Stunden nach der Exposition beobachtet. Der Grad der Nanopartikel-Inkorporation wurde durch Messung der Intensität der Nile-Red-Fluoreszenz in dendritischen Zellen aus murinem Knochenmark, oder BMDCs, mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Es wurde eine direkte Korrelation zwischen der verwendeten Konzentration von SNS und der in BMDCs gemessenen Menge an Fluoreszenz beobachtet.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ultrakleine Populationen biokompatibler Nanopartikel synthetisiert, ihre physikalischen Eigenschaften charakterisiert und die Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Zellen untersucht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Wir berichten über eine intelligente Anwendung von Kohlenstoffnanoröhren zur kinetischen Stabilisierung von Lipidpartikeln, die selbstorganisierte Nanostrukturen in ihren Kernen enthalten. Die Herstellung von Lipidpartikeln erfordert relativ geringe Konzentrationen von Kohlenstoffnanoröhren, die ihren Einsatz in biomedizinischen Anwendungen wie der Verabreichung von Medikamenten ermöglichen.

Facile Herstellung von Intern Selbstorganisierte Lipidpartikel stabilisiert durch Kohlenstoff-Nanoröhren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, kationische/anionische Liposomen mit einem Neuro-Targeting-Peptid als ZNS-Verabreichungssystem zu verwenden, damit siRNA die BHS passieren kann.  Die Optimierung eines Verabreichungssystems für Behandlungen wie siRNA würde mehr Behandlungsoptionen für Prionen und andere neurodegenerative Erkrankungen ermöglichen.

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Eine Flüssigkristall-Nanopartikel (LCNP) Nanotransporter wird als Träger für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Ladung an die Plasmamembran lebender Zellen ausgenutzt.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von Falcarindiol in Lipid-beschichtete 74 nm Nanopartikel. Die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln durch menschliche Stammzellen in Lipid Tröpfchen wird durch fluoreszierende und confocal Imaging überwacht. Nanopartikel werden hergestellt durch die schnelle Injektion Methode des Lösungsmittels verschieben und ihre Größe wird mit der dynamischen Lichtstreuung Technik gemessen.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Es werden Methoden zur Vorbereitung und Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Bioaktivität von neutral aufgeladenen, pH-responsiven siRNA-Nanopartikeln vorgestellt. Es werden Kriterien für erfolgreiche siRNA-Nanomedizine wie Größe, Morphologie, Oberflächenaufladung, siRNA-Ladung und Gen-Schweigung diskutiert.

Vorbereitung von Neutral-aufgeladenen, pH-responsiven polymischen Nanopartikeln für zytosolische siRNA Delivery

Diese Studie beschreibt die klassische Hydratation mit der Dünnschichtmethode zur Nanoliposomenpräparation, gefolgt von der Nanopartikelcharakterisierung. Ein 47 kDa-hydrophiles und kugelförmiges Protein, Tarin, wird erfolgreich als Strategie zur Verbesserung der Stabilität verkapselt, schnelle Clearance vermieden und eine kontrollierte Freisetzung gefördert. Die Methode kann an hydrophobe Moleküle angepasst werden.

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Das Protokoll stellt die optimierten Parameter für die Herstellung thermoempfindlicher Liposomen mit dem gestaffelten Fischgrät-Mikrofluidikgerät vor. Dies ermöglicht auch die Kokapselung von Doxorubicin und Indocyaningrün in die Liposomen und die photothermal ausgelöste Freisetzung von Doxorubicin zur kontrollierten/ausgelösten Wirkstofffreisetzung.

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Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

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