Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

Mikrofluidik ist eine neue Technik zur Herstellung von Liposomen mit einer einstellbaren Nanopartikelgröße und mit großer Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit. Dieses Protokoll ermöglicht die kontinuierliche hohe Produktion von niedrigtemperaturempfindlichen Liposomen zum Co-Laden mit einem Chemotherapeutikum wie Doxorubicin und einem Fluoreszenzfarbstoff wie Indocyaningrün. Die Zellpräparation verwendet in erster Linie einen Top-Down-Ansatz wie Lipidfilmhydratation und Extrusion.

Es bleibt schwierig, große und reproduzierbare Chargen für klinische Anwendungen vorzubereiten. Ein großer Vorteil der Mikrofluidik ist die Fähigkeit, kleine Flüssigkeitsmengen mit hoher Bedienbarkeit in Raum und Zeit zu handhaben, während sie kontinuierlich und automatisiert arbeiten. Das Verfahren mit Calvin Cheung demonstrieren Guanglong Ma und Amalia Ruiz, die Postdoktoranden aus meinem Labor.

Um die Spritzenpumpen zu montieren, verwenden Sie das Pumpen-zu-Pumpen-Netzwerkkabel, um den An-Computer-Anschluss der sekundären Spritzenpumpe an den Zu-Netzwerk-Anschluss der Master-Spritzenpumpe anzuschließen. Verwenden Sie den PC, um netzwerkkabel zu pumpen, um den Ananschluss der Masterpumpe an den seriellen RS-232-Anschluss des Computers anzuschließen. Um das staggard Heringbone Mikromixer Mikrofluidische Gerät zu montieren, verwenden Sie eine Mutter und Ferrule, um Schläuche an jeden der Ein- und Auslässe des Geräts zu verbinden.

Verwenden Sie dann eine zweite Mutter und Ferrule und eine Union-Montage, um die Klemme des Schlauches für beide Einlässe in einen weiblichen Luer umzuwandeln. Um die Pumpensteuerungssoftware einzurichten, verwenden Sie die Setup-Taste der Spritzenpumpe, um die Adresse der Hauptspritzenpumpe bzw. der Sekundärspritzenpumpe Ad:01 bzw. Ad:02 zuzuweisen, und öffnen Sie dann die Pumpensteuerungssoftware am Computer. Die beiden Spritzenpumpen sollten automatisch erkannt werden, gefolgt von einem Piepton.

Wählen Sie HSW Norm-Ject 5cc Durchmesser entspricht 12,45, um den Durchmesser 12,45 Millimetern zuzuweisen. Stellen Sie die Rate auf 0,25 Milliliter pro Minute für Pumpe eins und 0,75 Milliliter pro Minute für Pumpe zwei ein. Legen Sie das Volumen auf einen beliebigen Wert über fünf Milliliter fest, und wählen Sie den Infusionsmodus für beide Pumpen aus.

Klicken Sie dann auf Set, um die Einstellungen zu bestätigen. Um eine LTSL10 oder LTSL10 ICG Lipidmischung vorzubereiten, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Luer-Sperrspritze, um einen Milliliter Lipidgemisch und eine weitere Fünf-Milliliter-Luer-Sperrspritze zu ziehen, um mindestens drei Milliliter Ammoniumsulfatlösung zurückzuziehen. Schieben Sie den Fassflansch der Spritze an den Spritzenhalter der Pumpe, um die geladenen Spritzen in aufrechter Position auf die Spritzenpumpen zu montieren, und befestigen Sie den Kolbenflansch der Spritze am Schubblock der Pumpe und wickeln Sie das andere Ende des Heizbandes und den Temperaturfühler mit dem Thermostat um die Spritze, die die Lipidlösung enthält.

Wickeln Sie das Ende des Heizbandes in die Spritze, die die wässrige Lösung enthält, schließen Sie die Spritze, die das Lipidgemisch enthält, an den Ethanoleinlass an, und verbinden Sie die Spritze, die die Ammoniumsulfatlösung enthält, an den wässrigen Einlass. Passen Sie die Kolbenposition an, um bei Bedarf Luftblasen aus den Spritzen zu entfernen, und stecken Und trennen Sie das Heizband in 10-Sekunden-Intervallen, bis die Temperatur der Spritzen etwa 51 Grad erreicht. Wenn der Thermostat eine entsprechende Temperatur anzeigt, klicken Sie auf Alle in der Pumpensteuerungssoftware ausführen, um die Spritzenpumpen auszuführen und zu überprüfen, ob der Flüssigkeitsfluss frei von Luftblasen und Leckagen ist.

Sammeln Sie die Liposomenproben in eine Durchstechflasche und halten Sie die Infusion an oder stoppen Sie die Infusion, wenn eine der beiden Spritzen fast leer ist. Anneal die gesammelten Liposomenlösungen in einem 60 Grad Celsius Wasserbad für 1-1/2 Stunden vor der Übertragung der Lösungen auf Dialyserohre für die Dialyse gegen einen Liter von 240 Millimolar Ammoniumsulfat für mindestens vier Stunden bei 37 Grad Celsius. Dann die gereinigten Liposomen bei vier Grad Celsius lagern.

Für die Fernbeladung der Liposomen durch Transmembran-pH-Gradienten 25 Milliliter HBS auf die Oberseite einer Größenausschlusschromatographiesäule laden und das gesamte Eluent durch die Säule fließen lassen. Laden Sie einen Milliliter dialysierte Liposomen auf die Säule. Wenn die gesamte Lipidlösung durch die Spalte gegangen ist, fügen Sie 1,5 Milliliter frischehbS in die Spalte ein.

Wenn der gesamte Puffer durch die Spalte gegangen ist, fügen Sie der Spalte drei Milliliter frischen HBS hinzu, und sammeln Sie das Eluent. Als nächstes fügen Sie DOX-Lösung bei einem 1:20 DOX:Phospholipid-Molarenverhältnis zu einem Milliliter Pufferaustausch Liposomlösung in eine Biju-Durchstechflasche und legen Sie die Durchstechflasche in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 1-1/2 Stunden. Reinigen Sie nach dem Beladen die Liposomen durch Größenausschlusschromatographie, wie gerade nachgewiesen.

Für laserinduzierte Triggerfreisetzung des Liposomeninhalts stellen Sie das Wasserbad auf 37 Grad Celsius ein. Wenn sich die Temperatur stabilisiert hat, fügen Sie 200 Mikroliter DOX geladene Liposomen zu jedem Brunnen einer klaren 96-Well-Platte hinzu und legen Sie die Platte in das Wasserbad, wobei der Boden in swassergetaucht ist. Stellen Sie dann den Lasersystemstrom auf 2,27 Ampere ein und platzieren Sie den Lasersystemkollimator fünf Zentimeter vertikal über der Oberfläche der 96-Well-Platte.

Schalten Sie den Laser ein und verwenden Sie einen Lichtwellenleiter-Temperaturfühler, um die Temperatur einmal pro Minute zu überwachen. Nach fünf und zehn Minuten 10 Mikroliter DOX-Lutome aus jedem Brunnen der klaren 96-Well-Platte ansaugen und 190 Mikroliter HBS zu drei einzelförmigen Brunnen einer schwarzen 96-Well-Platte hinzufügen. Um die vollständige Wirkstofffreisetzung zu bewerten, mischen Sie 10 Mikroliter der Liposomen mit 170 Mikroliter HBS und 20 Mikroliter 1%Triton X-100 Waschmittellösung in drei Einzelbrunnen der schwarzen 96-Well-Platte.

Messen Sie dann die DOX-Fluoreszenzintensität auf einem Plattenleser. Die mikrofluidische Produktion von LTSL4 führt zu einer gelartigen viskosen Lösung, die durch die große Anzahl von eingeschlossenen Luftblasen veranschaulicht wird, während die Herstellung von LTSL10 zur Bildung einer klaren, nicht viskosen Flüssigkeit führt. Die dynamische Lichtstreuung von LTSL10 bei 51 Grad Celsius zeigt den erwarteten Z-Durchschnittsdurchmesser und die Dispergität, die den Erfolg des Experiments anzeigen.

Wenn LTSL10 jedoch bei 20 Grad Celsius hergestellt wird, werden größere und dispergiertere Liposomen erhalten, die zu einem suboptimalen Produkt führen. LTSLs, die nach der herkömmlichen Methode der Lipidfilmhydratation mit Extrusion hergestellt werden, weisen eine DOX-Verkapselungseffizienz von 50-80% auf. LtSL10, das durch Mikrofluidik hergestellt wird, führt zu einer signifikanten Erhöhung der DOX-Verkapselungseffizienz auf einen Mittelwert von 85%, was auf den Erfolg der Fernbelastung von DOX und das Vorhandensein des PH-Gradienten der Transmembran hindeutet. Das DOX-Freigabeprofil von LTSL10 wurde als temperaturempfindlich ermittelt.

LTSL10 hat einen relativ breiten Phasenübergang mit Beginn bei 41,6 Grad Celsius, der bei 42,6 Grad Celsius seinen Höhepunkt erreicht. Die Effizienz der ICG-Belastung hängt von der anfänglichen ICG-Konzentration sowie der Größe und Dispergität der Proben ab. Darüber hinaus induziert die LTSL10 ICG-Bestrahlung mit einem Nahinfrarotlaser eine photothermische Erwärmung, die die Freisetzung von DOX auslöst.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, einen stabilen Flüssigkeitsfluss zu gewährleisten, so dass das Mischen von Flüssigkeit und damit die Bildung von Liposomen reproduzierbar bleibt. Liposomenglühen und Dialyse sind zwei wichtige Schritte, um eine stabile Liposomenformulierung mit hoher Belastbarkeit zu gewährleisten. In-vivo-Tests können auch durchgeführt werden, um LTSL10 Bio-Verteilung, Freisetzung von Medikamenten und Anti-Krebs-Aktivität zu bewerten.

Unser Protokoll kann für die erfolgreiche mikrofluidische Produktion von cholesterinfreien Lysolipid-haltigen thermoempfindlichen Liposomen für Arzneimittelabgabeanwendungen eingesetzt werden.