Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die optimalsten 2D-Kristallisationsbedingungen für die strukturierte Bestimmung von Membranproteinen mittels Elektronenkristallographie zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst während der Reinigung ein kompatibles Detergens verwendet wird, um das Protein aus der nativen Lipiddoppelschicht zu lösen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, exogenes Lipid hinzuzufügen und das Detergens durch Dialyse des Protein-Lipid-Detergens-Gemisches zu entfernen, was zu 2D-Kristallen unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen führt.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Proben in einen glasartigen Zustand einzufrieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Datenerfassung per Kryo-em. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch computergestützte Bildverarbeitung der Daten die endgültige Struktur des Proteins liefern.

Hallo, ich bin aus dem Labor. Ich begrabe die Schule für Biologie am Georgia Institute of Technology. Hallo, ich bin Tina gefürchtet.

Ich komme vom Berry Lab in der Fakultät für Chemie und Biochemie und dem Schmidt Kray Lab an der Fakultät für Biologie am Georgia Institute of Technology. Und ich bin Matt Johnson aus dem Labor von Ingleborg Schmidt Cry an der Fakultät für Biologie am Georgia Institute of Technology. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Begutachtung von 2D-Chorversuchen durch em.

Wir verwenden dieses Protokoll in unserem Labor, um 2D-Kristallisationsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Fangen wir also an Um dieses Verfahren zu beginnen, werden negativ gefärbte Proben auf kohlenstoffbeschichteten 400-Mesh-Kupfer-Transmissionselektronenmikroskopie- oder TEM-Gittern hergestellt. Pipettieren Sie zwei Mikroliter der Protea-Liposomenprobe unter ein mit Kohlenstoff bedecktes TEM-Gitter und inkubieren Sie es 60 Sekunden lang.

Wenn sich die Probe nicht gleichmäßig verteilt, wischen Sie vorsichtig mit der Seite der Pipettenspitze darüber. Nächster Block vom Rand mit einem zerrissenen Stück Watman Nummer vier Filterpapier. Dies gewährleistet eine optimale Entfernung von Flüssigkeit ohne übermäßige Entfernung von Protea-Liposomen und hilft, den empfindlichen Kohlenstofffilm zu erhalten.

Unmittelbar nach dem Abtupfen. Tragen Sie nach 30 Sekunden zwei Mikroliter des 1%igen Urinalacetatflecks auf und tupfen Sie ihn vom Rand des Gitters ab. Auch hier gilt: Wenn die Probe hohe Konzentrationen an viskosem Glycerin oder Saccharose enthält, typischerweise im Bereich von 10 bis 20 %, können mehrere Waschgänge des Gitters mit einem glycerin- oder saccharosefreien Puffer vor einer negativen Färbung hilfreich sein, um eine ordnungsgemäße Färbung mit der Urinallösung zu ermöglichen.

Sobald die Gitter vorbereitet sind, wird die Elektronenmikroskopie verwendet, um die Probe bei geringer Vergrößerung zu visualisieren, um die Verteilung des Membranvorkommens, die Morphologie und die Gesamtqualität des Gitters zu beurteilen. Dann wird eine hohe Vergrößerung verwendet, um Bilder zu erhalten und RIA-Transformationen der Bilder durchzuführen, um 2D-Kristalle zu identifizieren. Um mit einem niedrigen Gitter im elektronenmikroskopischen Probenhalter zu beginnen und einen ersten Eindruck von der durchschnittlichen Membranverteilung zu erhalten, verwenden Sie eine Zwischenvergrößerung von 2000 bis 10.000 x.

Notieren Sie das Ausmaß der Verteilung der Membranen, ihre Morphologie und Größe in einem Labornotizbuch. Nehmen Sie repräsentative Ansichten mit einer CCD-Kamera auf. Betrachten Sie anschließend die Proben bei Bedarf mit geringer Vergrößerung im Bereich von etwa 400 bis 800 x, um einen Überblick über die Raster zu erhalten.

Dies kann wertvolle Informationen zur Bewertung der Gittervorbereitung liefern, indem es Probleme mit der Probenkonzentration, ungleichmäßigen Protea, Liposomenverteilung und teilweisem Bruch des Kohlenstofffilms aufdeckt. Identifizieren Sie einen Rasterbereich, der bei niedriger oder mittlerer Vergrößerung von Interesse ist. Verwenden Sie dann eine hohe Vergrößerung, um die mögliche Ordnung in verschiedenen Membranen zu bewerten.

Dies ist in den frühen Stadien von 2D-Kristallisationsversuchen von entscheidender Bedeutung. Um vielversprechende Protea-Liposomen mit wohlgeordneten Bereichen zu identifizieren und die Reproduzierbarkeit in späteren Experimenten zu überprüfen, um die optimale Einstellung für das Screening von 2D-Kristallen mit hoher Vergrößerung zu bestimmen, beginnen Sie mit einer Vergrößerung zwischen 50.000 und 60.000 x. Abhängig von den Abmessungen des 2D-Kristalls und der Größe der Einheitszelle kann die Einstellung für die hohe Vergrößerung auf bis zu 30.000 verringert oder auf bis zu 80.000 erhöht werden.

Hier an einer benachbarten Stelle Zum Bildbereich von Interesse defokussieren wir um etwa minus 400 Nanometer oder höher, wenn Unsicherheit darüber besteht, ob es sich bei dem interessierenden Bereich tatsächlich um eine Membran handelt. Untersuchen Sie die Probe auf Stücke von Kohlenstofffilm, MICA oder anderen Artefakten, die mit Protea-Liposomen verwechselt werden könnten. Beobachten Sie auch die Kanten, um die typische Membranfaltung und Morphologie zu erkennen.

Überprüfen Sie als Nächstes den interessierenden Bereich mit einer CCD-Kamera. Durch die Aufnahme eines CCD-Bildes bei der optimalen Einstellung für hohe Vergrößerung ist das Gitter eines kleineren und/oder meist hydrophoben Membranproteins durch die visuelle Beurteilung des CCD-Bildes selbst möglicherweise nicht beobachtbar. In diesem Fall wird das gesamte Bild für eine Online-Foer-Transformation oder ft verwendet.

Wenn das geordnete Array jedoch klein ist, enthält dieses FT eine signifikante Menge an Rauschen, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, die Größe des Boxed-Bildes zu reduzieren, das reduzierte Quader über das Bild zu verschieben und ein Live-FT durchzuführen, die Gammafunktion des Live-FT für eine optimale Identifizierung geordneter Arrays anzupassen. Ein zu hoher Gamma-Wert kann Flecken aufgrund von Rauschanteilen verdecken, während ein zu niedriger Wert verhindert, dass schwächere Stellen identifiziert werden. Rechnen Sie mit einer Auflösung der negativ gefärbten 2D-Kristalle von etwa 15 Ångström bei einem DFO von minus 400 Nanometern.

Rechnen Sie damit, ein bis drei Ordnungen von Flecken zu identifizieren. Achten Sie auf die Schärfe der Flecken und des Mosaiks. 2D-Kristalle eines 18 Kilodalton großen Membranproteins sind bis zu mehreren Mikrometer groß.

Flecken auf dem FTS Eine scharfe und leicht erkennbare Bewegung der stromführenden FT-Box zeigt, dass das Gitter ohne Mosaik durchgehend ist. Das Gitter eines größeren Proteins mit einer umfangreicheren löslichen Domäne kann auf dem kleinen Bildschirm der T-E-M-C-C-D-Bildsammlung identifiziert werden, und FT sind notwendig, um eine bessere Beurteilung der Gitterqualität zu erhalten, einschließlich Eigenschaften wie Mosaikrauschen in der FT einer ungeordneten Protea. Liposomen können mit Schwachstellen verwechselt werden, um festzustellen, ob die Flecken auf kleine Protein-2D-Kristalle oder Rauschen zurückzuführen sind.

Verschieben Sie die Box für den Live-Fernseher. Wenn die Flecken sofort verschwinden, sind sie Rauschen, aber wenn sie auch nur über eine kleine Fläche unverändert bleiben, sind wahrscheinlich Kristalle vorhanden, da Lipidkristalle eine ausgeprägte Morphologie und ft aufweisen. Diese Lipidkristalle können auch durch visuelle Inspektion eines Bildes und konsistente Einheitszellgrößen erkannt werden.

In ersten Versuchen kann es zu Ausfällungen kommen. Die Inspektion bei hoher Vergrößerung wird verwendet, um zwischen Proteinfällung und Lipidaggregaten zu unterscheiden. Im Falle von Lipidaggregaten könnte eine Rekonstitution tatsächlich stattgefunden haben, und die nächsten Experimente werden nur eine Anpassung der Parameter erfordern, die notwendig sind, um die Membrangröße zu erhöhen und Ordnung zu erzeugen, anstatt eine Rekonstitution bei 30.000 bis 50.000 x zu induzieren.

Die Ränder dieser dunklen Strukturen zeigen, dass sie aus Membranen ohne Protein bestehen. Fällungsproben enthalten unter optimalen Bedingungen einen hohen Prozentsatz an 2D-Kristallen. Es ist nicht notwendig, ein homogenes Erscheinungsbild der Membranen anzustreben, da die größten und am besten geordneten 2D-Kristalle visuell für die Datenerfassung ausgewählt werden.

Diese Art von Proben wird leicht erkannt, wenn die Kristallisation solcher Proben für die Kryo-EM-Datenerfassung verwendet wird, um die maximale Anzahl hochauflösender Bilder zu erhalten. Wir zeigen Ihnen nur, wie Sie bei diesem Verfahren nach 2D-Kristallen von kleinen Speicherproteinen mittels TEM suchen können. Es ist wichtig, daran zu denken, gründlich zu sein, um einen vielversprechenden Kristallisationszustand nicht zu übersehen, da Sie bis zu diesem Zeitpunkt bereits viel Zeit und Mühe investiert haben.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.