Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die optimalen Bedingungen für die zweidimensionale Kristallisation zur Strukturaufklärung von Membranproteinen mittels Elektronen-Kristallographie zu identifizieren. Dies wird zunächst erreicht, indem während der Reinigung ein verträgliches Detergens verwendet wird, um das Protein aus der nativen Lipiddoppelschicht zu lösen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, exogenes Lipid zuzugeben und das Detergens durch Dialyse des Protein-Lipid-Detergens-Gemischs zu entfernen, wodurch unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen zweidimensionale Kristalle entstehen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Proben durch Flash-Freezing in einen glasartigen Zustand zu überführen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Datensammlung mittels Kryo-EM. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch computergestützte Bildverarbeitung der Daten die endgültige Struktur des Proteins liefern.

Hallo, ich komme aus dem Labor. Ich bin an der School of Biology am Georgia Institute of Technology. Hallo, ich bin Tina dreaded.

Ich komme aus dem Berry-Labor der Fakultät für Chemie und Biochemie und dem Schmidt-Kray-Labor der Fakultät für Biologie am Georgia Institute of Technology. Und ich bin Matt Johnson aus dem Labor von Ingleborg Schmidt Cry aus der Fakultät für Biologie am Georgia Institute of Technology. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Beurteilung von 2D-chiralen Anordnungsversuchen mittels EM.

Wir verwenden dieses Protokoll in unserem Labor, um Bedingungen für die zweidimensionale Kristallisation zu identifizieren und zu optimieren. Beginnen wir damit: Zunächst werden negativ gefärbte Proben auf mit Kohlenstoff beschichteten 400-Mesh-Kupfer-Transmissionselektronenmikroskopie- oder TEM-Gittern hergestellt. Geben Sie zwei µL der Protealiposomen-Probe unter ein mit Kohlenstoff bedecktes TEM-Gitter und inkubieren Sie 60 Sekunden lang.

Falls die Probe nicht gleichmäßig verteilt ist, streichen Sie sie vorsichtig mit der Seite der Pipettenspitze ab. Danach blockieren Sie den Rand mit einem zerrissenen Stück Watman Nr. 4 Filterpapier. Dies gewährleistet eine optimale Entfernung der Flüssigkeit, ohne dass zu viele Protealiposomen entfernt werden, und hilft, den empfindlichen Kohlenstofffilm zu erhalten.

Unmittelbar nach dem Abtupfen. Nach 30 Sekunden zwei Mikroliter der 1 %igen Urinacetat-Färbung auftragen und von der Kante des Rasters abtupfen. Falls die Probe hohe Konzentrationen an viskosem Glycerin oder Saccharose enthält, typischerweise im Bereich von 10 bis 20 %, können mehrere Waschzyklen des Rasters mit einem glycerinfreien oder saccharosefreien Puffer vor der Negativfärbung hilfreich sein, um eine geeignete Färbung mit der Urinacetat-Lösung zu ermöglichen.

Nachdem die Gitter vorbereitet wurden, wird die Elektronenmikroskopie verwendet, um die Probe bei niedriger Vergrößerung zu visualisieren, um Vorkommen, Verteilung und Morphologie der Membran sowie die allgemeine Gitterqualität zu beurteilen. Anschließend werden bei hoher Vergrößerung Bilder aufgenommen und RIA-Transformationen der Bilder durchgeführt, um 2D-Kristalle zu identifizieren. Um mit der Untersuchung bei niedriger Vergrößerung im Probenträger des Elektronenmikroskops zu beginnen und einen ersten Eindruck von der durchschnittlichen Membranverteilung zu erhalten, verwenden Sie eine mittlere Vergrößerung von 2000 bis 10.000x.

Notieren Sie das Ausmaß der Verteilung der Membranen, ihre Morphologie und Größe in einem Laborjournal. Dokumentieren Sie repräsentative Ansichten mit einer CCD-Kamera. Danach, falls erforderlich, betrachten Sie die Proben mit niedriger Vergrößerung im Bereich von etwa 400 bis 800 x, um einen Überblick über die Raster zu erhalten.

Dies kann wertvolle Informationen zur Beurteilung der Gitterpräparation liefern, indem Probleme mit der Probenkonzentration, ungleichmäßiger Protea-, Liposomenverteilung und teilweisem Bruch des Kohlenstofffilms aufgedeckt werden. Identifizieren Sie einen interessierenden Gitterbereich entweder bei niedriger oder mittlerer Vergrößerung. Anschließend verwenden Sie hohe Vergrößerung, um mögliche Ordnung in verschiedenen Membranen zu bewerten.

Dies ist in den frühen Phasen von 2D-Kristallisationsversuchen entscheidend. Um aussichtsreiche Protea-Liposomen mit gut geordneten Bereichen zu identifizieren und die Reproduzierbarkeit in späteren Experimenten zu überprüfen, bestimmen Sie zunächst die optimale Einstellung der hohen Vergrößerung zur Untersuchung von 2D-Kristallen, indem Sie mit einer Vergrößerung zwischen 50.000- und 60.000-facher Vergrößerung beginnen. Abhängig von den Abmessungen der 2D-Kristalle und der Größe der Elementarzelle kann die Einstellung der hohen Vergrößerung auf bis zu 30.000-fach verringert oder auf bis zu 80.000-fach erhöht werden.

Hier an einer benachbarten Stelle zum interessierenden Bildbereich defokussieren wir um etwa minus 400 Nanometer oder mehr, falls unklar ist, ob der interessierende Bereich tatsächlich eine Membran darstellt. Untersuchen Sie die Probe auf Rückstände von Kohlenstofffilm, Glimmer oder andere Artefakte, die mit Protealiposomen verwechselt werden könnten. Achten Sie zudem auf die Ränder, um typische Membranfaltungen und die Morphologie zu erkennen.

Als Nächstes untersuchen Sie den Bereich von Interesse mit einer CCD-Kamera. Bei Aufnahme eines CCD-Bildes mit optimaler hoher Vergrößerung kann das Gitter eines kleineren und/oder weitgehend hydrophoben Membranproteins durch visuelle Beurteilung des CCD-Bildes selbst nicht erkennbar sein. In diesem Fall wird das gesamte Bild für eine Online-Fourier-Transformation oder FT verwendet.

Wenn das geordnete Array jedoch klein ist, wird diese FT ein erhebliches Maß an Rauschen enthalten; um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, verkleinern Sie die Bildbox, verschieben Sie die reduzierte Box über das Bild und führen Sie eine Live-FT durch. Stellen Sie die Gamma-Funktion der Live-FT zur optimalen Identifizierung geordneter Arrays ein. Ein zu hoher Gamma-Wert kann die Flecken aufgrund von Rauschanteilen verdecken, während ein zu niedriger Wert verhindert, dass schwächere Flecken erkannt werden. Erwarten Sie eine Auflösung der negativ gefärbten 2D-Kristalle von etwa 15 Ångström bei einem DFO von minus 400 Nanometern.

Es ist damit zu rechnen, ein bis drei Ordnungen von Flecken zu identifizieren. Achten Sie auf die Schärfe der Flecken und auf eventuelles Mosaikmuster. 2D-Kristalle eines kleinen membranständigen Proteins mit einem Molekulargewicht von 18 Kilodalton können mehrere Mikrometer groß sein.

Punkte auf der FTS, scharf und leicht identifizierbare Bewegung des lebenden FT-Kästchens, zeigen, dass das Gitter kontinuierlich ist und kein Mosaik aufweist. Das Gitter eines größeren Proteins mit einer umfangreicheren löslichen Domäne kann auf dem kleinen Bildschirm der T-E-M-C-C-D-Bilddatenerfassung identifiziert werden, und FT ist erforderlich, um eine bessere Beurteilung der Gitterqualität zu erhalten, einschließlich Eigenschaften wie Mosaikrauschen in der FT eines ungeordneten Proteas. Liposomen könnten irrtümlich als schwache Punkte angesehen werden; es ist notwendig zu bestimmen, ob die Punkte auf kleinen zweidimensionalen Protein-Kristallen oder auf Rauschen beruhen.

Bewegen Sie das Feld für das Live-ft. Wenn die Flecken sofort verschwinden, handelt es sich um Rauschen; bleiben sie jedoch selbst über einen kleinen Bereich unverändert, sind wahrscheinlich Kristalle vorhanden, da Lipidkristalle eine charakteristische Morphologie und ft aufweisen. Diese Lipidkristalle können ebenfalls durch visuelle Inspektion eines Bildes und konsistente Elementarzellgrößen erkannt werden.

Bei ersten Versuchen kann es zu Ausfällungen kommen. Die Untersuchung bei hoher Vergrößerung dient dazu, zwischen Proteinpräzipitation und Lipidaggregaten zu unterscheiden. Im Fall von Lipidaggregaten könnte die Rekonstitution tatsächlich stattgefunden haben, und die nächsten Experimente erfordern lediglich eine Anpassung der Parameter, die notwendig ist, um die Membrangröße zu vergrößern und Ordnung statt Rekonstitution bei 30.000 bis 50.000 x zu erzeugen.

Die Ränder dieser dunklen Strukturen zeigen, dass sie aus Membranen ohne Protein bestehen. Niederschlagsproben unter optimalen Bedingungen enthalten einen hohen Anteil an zweidimensionalen Kristallen. Es ist nicht notwendig, auf ein homogenes Erscheinungsbild der Membranen abzuzielen, da die größten und am besten geordneten zweidimensionalen Kristalle visuell für die Datensammlung ausgewählt werden.

Diese Arten von Proben werden leicht erkannt, wenn die Kristallisation solcher Proben für die Kryo-EM-Datenerfassung verwendet wird, um die maximale Anzahl an hochauflösenden Bildern zu erhalten. Wir zeigen Ihnen lediglich, wie man mittels TEM nach 2D-Kristallen kleiner Membranproteine screenen kann, wenn man dieses Verfahren durchführt. Es ist wichtig, gründlich zu bleiben, um keine vielversprechende Kristallisationsbedingung zu übersehen, da bis zu diesem Punkt bereits ein erheblicher Zeitaufwand und viel Mühe investiert wurden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.