Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Hallo und herzlich willkommen in der Gruppe für membranäre Struktur- und Funktionsbiologie. Mein Name ist Martin Caffery. Dies ist ein weiterer Artikel aus einer Reihe von JO-Artikeln zur Kristallisation membranständiger Proteine zur Strukturbestimmung mit der in-meso- oder lipidischen kubischen Phasen-Methode.

Im ersten Artikel, JoVE 1 7 1 2, haben wir gezeigt, wie die proteinhaltige kubische Phase hergestellt wird und wie die viskose und klebrige Mischphase manuell in Glas-Sandwich-Platten für Kristallisationsversuche abgegeben wird. Dieser Videoartikel beschreibt Methoden zur Verwendung eines In-Meso-Kristallisationsroboters. Ein Roboter bietet die Vorteile von Geschwindigkeit, Genauigkeit, Präzision, Miniaturisierung und der Fähigkeit, über längere Zeiträume unter ungünstigen Bedingungen wie im Dunkeln oder bei niedrigen Temperaturen zu arbeiten.

Roboter können, wenn sie richtig eingesetzt werden, die Produktivität der Forschung zu Struktur und Funktion von Membranproteinen erheblich verbessern. In diesem Video-Artikel demonstrieren wir den Einsatz von drei kommerziell verfügbaren Robotern. Der erste Roboter wurde in der Arbeitsgruppe für Membran-Struktur- und Funktionsbiologie entwickelt und ist im Detail in Referenz eins beschrieben.

Die anderen beiden sind erst kürzlich verfügbar geworden und werden hier der Vollständigkeit halber aufgeführt. Die Vorbereitung der Kristallisationsplatte, um einen Kristallisationsversuch robotisch durchzuführen, beginnt mit der Vorbereitung der Basisplatte der in Glas-Sandwich-Bauweise hergestellten Kristallisationsplatte. Wie im Detail beschrieben, muss die Basisplatte zuerst silanisiert werden, und der perforierte doppelseitige Klebespacer, der die Vertiefungen bildet, muss auf die Platte aufgebracht werden. Die hierfür benötigten Materialien sind hier dargestellt.

Sie umfassen eine Glas-Kristallisationsgrundplatte, einen perforierten Doppelkleber-Abstandshalter, Kristallisationslösung, ein Roll- oder Walzgerät, Papiertücher und einen Becher mit UE-Wasser. Die Platte wird auf ein Papiertuch auf der Laborbank platziert. Einige Tropfen der Kristallisationslösung werden aufgetragen und dann mithilfe eines Papiertuchs gleichmäßig über die Oberfläche der Platte verteilt.

Die Platte wird gewaschen, um überschüssige Silanisierungslösung zu entfernen, indem sie vollständig in einen Becher mit Wasser eingetaucht wird. Die Platte wird aus dem Becher genommen und auf ein trockenes Papiertuch gelegt, wobei die silanisierte Seite nach oben zeigt, und ihre freiliegende Oberfläche wird vorsichtig durch Abtupfen mit Papiertüchern getrocknet.

Danach wird die Schutzabdeckung des perforierten doppelseitigen Klebeabstandshalters entfernt, und der Abstandshalter wird auf der silanisierten Oberfläche der Glasplatte angebracht. Es ist wichtig, dass der Abstandshalter korrekt auf der Grundplatte positioniert wird, sodass die obere linke Ecke sowie die beiden angrenzenden Seiten des Abstandshalters und der Platte exakt übereinstimmen. Eine Rolle oder Walze wird verwendet, um den Abstandshalter auf der Grundplatte glatt zu drücken und eine dichte Verbindung zwischen beiden zu erzeugen.

Beiläufig bemerken wir, dass siloisierte Platten zusammen mit perforierten Abstandshaltern gemäß dem im Referenzabschnitt Beschriebenen kommerziell erhältlich sind. Nachdem die Kristallisations-Grundplatte vorbereitet wurde, fahren wir als Nächstes mit dem Aufbau und der Nutzung des In-meso-Roboters fort. Wie im Folgenden erläutert, demonstrieren wir die Verwendung von drei In-meso-Robotern.

In allen gezeigten Fällen werden die Roboter in einem temperaturgeregelten Raum betrieben, der auf 20 Grad Celsius eingestellt ist, im Meso-Roboter eins, dem ersten Meso-Roboter, der in diesem Video vorgestellt wird. Der Artikel wurde im Labor des leitenden Wissenschaftlers entwickelt und ist nun kommerziell erhältlich. Vollständige Angaben finden sich im Referenzabschnitt.

Die Materialien und Geräte, die für die robotergestützte Durchführung eines Kristallisationsversuchs benötigt werden, sind hier dargestellt. Dazu gehören ein Laborbuch, mit Protein beladene Mease, frisch hergestellt wie in JoVE Artikel 1 7 1 2 beschrieben und in einer Hamilton-Spritze aufbewahrt, silanisierte Basisplatten mit Abstandshaltern und passendem Deckglas, eine Wasserflasche und Tücher sowie der in-miso-Roboter.

Die erste Ansicht zeigt den Roboter mit freier Plattform. Die nächste Ansicht zeigt den Roboter vollständig mit befeuchteter Parkstation, Kristallisationsgrundplatte und Tiefbrunnenblock, der Präzipitationslösungen enthält. Wir beginnen die Einrichtung, indem wir die Grundplatte auf die Plattform des Roboters stellen.

Es verfügt über eine eigene Plattform, die deutlich mit Markierungen für die Brunnenpositionen zur Ausrichtung der Basisplatte versehen ist. Die Platte sollte zur Identifizierung eindeutig beschriftet sein. Der 96-Brunnen-Block, der die Präzipitanzlösungen enthält, ist auf einer separaten Plattform an der Roboteroberfläche neben der Kristallisationsplatte befestigt.

Der Block wird geöffnet, indem die Kunststoffdeckelkappe vorsichtig abgezogen wird. Der Feuchtigkeitsstrom aus dem Luftbefeuchter wird so gelenkt, dass er über die Basisplatte auf der Oberfläche des Roboters strömt, während der Roboter eingerichtet wird. Der Roboter wird gemäß den Herstelleranweisungen initialisiert.

Dies wird hier nicht im Detail demonstriert, da sich die genauen Protokolle im Laufe der Zeit ändern werden. Wesentlich ist, dass während der Initialisierung der Arm zur Probenausgabe am Roboter mit Referenzpositionen in drei orthogonalen Richtungen, x, Y und Z, versehen wird. Anschließend wird die mit Protein beladene Meza-Phase in einer Hamilton-Spritze zusammen mit einer Ausgabenadel an Arm eins des Roboters befestigt. Detaillierte Angaben zur Herstellung der Meza-Phase und der Spritze finden sich in JoVE Artikel 1 7 1 2 sowie in Referenz eins. Die Nadelspitze der Ausgabespritze muss nun mit dem Boden und der Mitte des obersten Wells in der linken Ecke der Kristallisationsplatte ausgerichtet werden. Dies entspricht dem Well-Identifikator A1, wobei die Ausrichtung mit dem Boden von Well A1 die erste Aufgabe darstellt.

Dies geschieht, indem man nach dem Ausschleudern die Höhe oder die Z-Koordinate des Applikationsarms anpasst, während man beobachtet, wie nahe die Nadelspitze dem Boden des Wells kommt. Dass die Spitze gerade den Boden des Wells berührt, kann beurteilt werden, indem man die Platte von Hand leicht von Seite zu Seite auf der Plattform bewegt und gleichzeitig die Höhe des Applikationsarms minimal verändert. Die Z-Koordinate des Applikationsarms, bei der die Spitze die Platte berührt, wird in den Computer eingegeben. Die Applikation wird so programmiert, dass sie stattfindet, wobei sich die Nadelspitze um mehrere Mikrometer von dieser Referenz-Z-Position entfernt befindet, was der Oberfläche der Basisplatte entspricht. Anschließend wird der Roboter aktiviert, um eine Reihe von vom Benutzer ausgelösten Schritten durchzuführen, um die Nadelspitze in der Mitte von Well A1 zu positionieren.

Die Referenz-XY-Koordinate des Dosierarms, an der sich die Spitze zentriert befindet, wird im Computer gespeichert, der den Roboter steuert. Sie dient dazu, die Mitte der verbleibenden Wells auf der Platte zu definieren. Nachdem diese Referenzkoordinaten im Computer festgelegt wurden, wird der Mease-Dosierarm angewiesen, in seine Ausgangsposition zurückzukehren und die Spritze zu spülen.

Die Dosierspritze muss nun geprimt werden. Dies dient dazu, sicherzustellen, dass frische Mease die Dosierkanüle füllt und dass das erste Loch in der Platte seine volle Menge an Mease erhält. Im Programm, das die Roboteraktivierung steuert, gibt es einen Befehl zum Primen.

Es bewirkt, dass sich der Kolben in der Spritze schrittweise unter Benutzerkontrolle vorwärts bewegt. Währenddessen wird die Nadelspitze daraufhin überprüft, ob Mease austritt; die Mease-Phase wird mit einem Tuch entfernt. Damit ist der Spülvorgang des Roboters abgeschlossen.

Der Roboter ist nun bereit, im automatischen Modus mit dem Lauf zu beginnen. Das Roboters XAP-Programm startet eine Reihe von Spülschritten, bei denen die Tropfspitzen für Präzipitanzien am zweiten Arm des Roboters gereinigt und anschließend zur Aufnahme der Präzipitanzlösungen aus dem Deep-Well-Block vorbereitet werden. Die Aktivierung der Dosierfunktion am Roboter setzt die sequenzielle Befüllung der Vertiefungen in Gang: zunächst jeweils acht Vertiefungen mit proteinhaltiger Mease, gefolgt von Präzipitanzlösungen zwischen den einzelnen Applikationen. Der Mease-Dosierarm kehrt danach in eine Parkposition zurück, bei der die Nadelspitze in einen angefeuchteten Schwamm eingetaucht wird, um zu verhindern, dass die Mease an der Spitze austrocknet.

Üblicherweise werden bei Kristallisationsversuchen, die in der Arbeitsgruppe für Struktur- und Funktionsbiologie durchgeführt werden, 50 Nanoliter Mease und 800 Nanoliter Fällungslösung verwendet. Das Programm, das den Roboter in dieser Demonstration steuert, wurde so eingerichtet, dass sich beide Arme gleichzeitig bewegen.

Auf diese Weise ist es möglich, das Beladen einer 96-Loch-Platte mit Mease und Präzipitant innerhalb von fünf Minuten abzuschließen. Unmittelbar nachdem die Platte gefüllt ist und die Roboterarme in ihre Parkpositionen zurückgekehrt sind, wird die Platte vom Deck des Roboters genommen und auf eine ebene, feste Oberfläche gestellt.

Ein Deckglas wird vorsichtig auf die Basisplatte gelegt, sodass es mit der oberen klebrigen Oberfläche des Abstandshalters in Kontakt kommt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass alle 96 Vertiefungen vollständig abgedeckt sind, dass das Deckglas exakt parallel zur Basisplatte ausgerichtet ist und dass kein Teil des Deckglases über die Grundfläche der Basisplatte hinausragt. Eine Walze oder Rakel wird verwendet, um eine feste und gleichmäßige Dichtung zwischen dem Deckglas und dem Abstandshalter zu erzeugen.

Die Platte sollte an dieser Stelle überprüft werden, um sicherzustellen, dass der Versuchsaufbau wie vorgesehen verlaufen ist. Gesucht wird ein Aussehen wie ein Spiegelei in der Pfanne. In jedem Brunnen entspricht das Eigelb der Meza-Phase.

Das Eiweiß ist die Fällungslösung, und der Rand der Pfanne stellt den Randbereich der Kristallisation dar. Im Idealfall sind alle drei konzentrisch angeordnet. Die Platte ist nun bereit, in einem temperaturgeregelten Lagerraum zur Kristallisation aufbewahrt zu werden.

Wenn keine weiteren Platten mehr eingerichtet werden sollen, sollte der Präzipitationsblock vom Deck des Roboters entfernt, ordnungsgemäß verschlossen und wieder in die Lagerung zurückgestellt werden. Die Spritze, die die Mease enthält, wird vom Dosierarm des Roboters entfernt, ihre verschiedenen Teile – einschließlich Dosierkanüle und Ferial – auseinandergenommen, sorgfältig mit Methanol gewaschen und für den nächsten Einsatz an einem Meso-Roboter zwei Moskito-LCP getrocknet.

Der nächste Videoclip zeigt den Moskito-LCP-Roboter, der für die Einrichtung von in-meso-Kristallisationsversuchen verwendet werden kann. Er verfügt über ein ähnliches Meph-Phasen-Dosiersystem wie das zuvor in diesem Artikel beschriebene. Bei Roboter eins wird das Fällungsmittel jedoch mit Einwegspitzen dosiert.

Das Instrument selbst ist hier dargestellt. Es umfasst eine Plattform, auf der die Kristallisationsplatte und der Präzipitantenblock sowie eine Kammer mit Fenstern zur Feuchtigkeitskontrolle angeordnet sind. In dieser Ansicht wurden die Fenster der Feuchtigkeitskammer geöffnet, sowie eine Spule mit Dosierspitzen, ein Dosierarm, ein sensorbasiertes Lasersystem zur Bestimmung der Position der Nadel für die Dispensierung der Meph-Phase.

Eine erhöhte Plattform, auf der die Kristallisationsplatte steht, und eine versenkte Plattform zur Aufnahme des Präzipitant-Screen-Blocks. In dieser Abfolge hat der Roboter eine Initialisierungssequenz von Aktionen durchlaufen, die beim Einschalten des Instruments erfolgt. Mit Hilfe einer Programmier-Software wird das Instrument für den Einsatz mit bestimmten Kristallisationsplatten und Präzipitant-Blöcken eingerichtet und um festgelegte Volumina von Mease und Präzipitant in einer vorgegebenen Reihenfolge abzugeben.

Solche Einzelheiten werden vom Hersteller bereitgestellt und hier nicht dargestellt. Die Verwendung des Roboters zur Vorbereitung einer Kristallisationsplatte beginnt wie folgt: Eine Hamilton-Spritze, komplett mit Nadel und gefüllt mit proteinhaltigem Mesophase, wird wie oben unter „in meso robot one“ und in JoVE 1 7 1 2 beschrieben vorbereitet. Die Spritze wird unter dem Dosierarm des Roboters in einer Halterung fixiert.

Die X- und Y-Koordinaten der Nadel an der Dosierspritze werden mithilfe des am Deck montierten Lasersensors festgelegt. Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Mease genau in der Mitte jedes Wells der Kristallisationsplatte abgegeben wird. Mit einem Tastendruck am Bedienfeld wird die Spritze befüllt, um Mease aus der Nadelspitze auszustoßen.

Das extrudierte Mease wird anschließend mit einem Tuch entfernt, um die Verwendung des Roboters zum Befüllen der Vertiefungen vorzubereiten, bevor die Kristallisationsplatte auf der Robotereinheit montiert wird. Die Oberfläche der Plattform wird mit einigen Tropfen Wasser angefeuchtet, um die Platte an ihrem Platz zu halten. Durch Kapillarwirkung wird die Schutzabdeckung von der Platte entfernt, und die Platte wird fest auf ihrer Plattform platziert, um eine gute Haftung sicherzustellen.

Es gibt drei Referenzmarken auf der Plattform, über denen die drei Ecklöcher zentriert sind, um eine korrekte Positionierung der Platte bezüglich der Dosierspitze sicherzustellen; das Gerät ist nun bereit, einen Einrichtungszyklus zu beginnen. Dieser beginnt mit einem zweiten Ansaugschritt, bei dem Mease auf eine kleine Glasplatte abgegeben wird, unmittelbar bevor das Beladen der Platte mit frischer Mease erfolgt. In dieser Abfolge sehen wir, wie der Roboter zunächst Mease in eine vertikale Spalte mit acht Löchern auf der Platte einbringt und anschließend mit Einwegspitzen die Präzipitationslösung auf den Mease-Tropfen aufgibt.

Dieser Vorgang wird entlang der Länge der Platte 11-mal wiederholt, bis alle Vertiefungen gefüllt sind. Der gesamte Vorgang dauert etwa fünf Minuten. In diesem speziellen Video wurden in jede Vertiefung 50 Nanoliter Mease und 800 Nanoliter Präzipitationslösung gegeben.

Die befüllte Platte wird vom Plattformroboter, der auf einem Pult steht, entfernt. Das Deckglas wird aufgebracht und die Platte wie oben unter Meso-Roboter eins beschrieben mit einem Büstenhalter versiegelt. Die ordnungsgemäß beschriftete Platte kann nun in einer temperaturgeregelten Umgebung für das Kristallwachstum im Meso-Roboter drei, dem Griffin LCP, platziert werden.

Dieser letzte Videoclip zeigt den Griffin-LCP-Roboter bei der Einrichtung von in-meso-Kristallisationsversuchen. Der Griffin verfügt über ein ähnliches System zur Dosierung der Meph-Phase wie das oben für Roboter eins beschriebene. In diesem Fall werden jedoch alle 96 Fällungslösungen gleichzeitig dosiert.

Das Instrument selbst ist hier dargestellt. Es umfasst eine Plattform, auf der die Kristallisationsplatte und der Präzipitantblock stehen, einen Dosierarm und einen Phoenix-96-Tip-Kopf. Zum Dosieren von Präzipitanzlösungen wird der Roboter in Aktion in dieser abschließenden Videosequenz gezeigt.

Der 96-Tip-Kopf wird zunächst mit Präzipitatorlösung beladen. Eine benutzerdefinierte Verzögerung ermöglicht das Ansaugen viskoser Präzipitanzien. Die MEA-Phase wird nacheinander in die 96 Vertiefungen ausgegeben, wobei der Vorgang etwa eine Minute dauert.

Schließlich gibt der 96-Tip-Kopf alle 96 Präzipitantenlösungen gleichzeitig auf die MEA-Phasenbolusse in den Kristallisationsmulden ab. Der gesamte Plattenbeladeprozess wird innerhalb von zwei Minuten abgeschlossen. Die befüllte Platte wird vom Deck des Roboters entfernt, mit einem Deckglas versiegelt und zur Kristallzüchtung unter kontrollierten Temperaturbedingungen gelagert.

Die nächsten Schritte im Gesamtverfahren der Strukturaufklärung mittels makromolekularer Kristallographie bestehen darin, die Kristalle zu ernten und kryogenisch abzukühlen sowie Röntgenbeugungsdaten von ihnen aufzuzeichnen und zu verarbeiten. Diese Themen werden in separaten JoVE-Artikeln dieser Serie behandelt.