Name: Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidischen Mesophasen mit Robotersystemen. Diese Methode verbessert Geschwindigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit in der Strukturbiologie.

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Es gibt viele, trugen zu dieser Arbeit und die meisten sind von der Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group, beide in Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder. Um alles, was wir verlängern unsere wärmsten Dank und Anerkennung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), den National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 und U54GM094599) und FP7 COST Action CM0902 unterstützt.

Ein. Vorbereiten der Kristallisation Platte Einrichten eine Kristallisation Studie Roboter zu tun beginnt mit der Vorbereitung der Bodenplatte des Glas-Sandwich Kristallisationsplatte (Abbildung 2), im Detail Reference 2 beschrieben. Die Bodenplatte muss zunächst silanisiert und die perforierte Doppel-stick Abstandshalter, die Brunnen erstellt, muss auf die Platte aufgetragen werden. Die Hilfs-und Betriebsstoffe für diese benötigt werden unter Materialien aufgeführt. <ol><li> Legen Sie die Platte auf einem Papiertuch, ein paar Tropfen der Silanisierung Lösung und verteilen sie gleichmäßig über die Plattenoberfläche mit einem Papiertuch. </li><li> Entfernen überschüssigen Silanisierungsmittel Lösung durch Eintauchen der Platte in ein Becherglas mit Wasser. </li><li> Nehmen Sie die Platte aus dem Becher, legen Sie sie auf ein trockenes Papiertuch, silanisiert Seite nach oben, und trocknen ihre exponierte Oberfläche durch Wischen leicht mit einem Papiertuch. </li><li> Ziehen Sie die Schutzabdeckung auf dem perforierten, Doppel-stick Abstandhalterund Anwendung des Abstandshalters, klebrigen Seite nach unten, um das trockene, silanisierte Oberfläche der Glasplatte. Stellen Sie sicher, dass der Abstandshalter richtig auf der Grundplatte positioniert ist, mit der oberen linken Ecke und den beiden benachbarten Seiten der Abstandshalter und der Platte zusammenfällt. </li><li> Mit einer Walze oder Brayer abzuflachen, um den Abstandshalter an der Basisplatte und um eine dichte Dichtung zwischen ihnen zu schaffen. </li></ol> Fertigteilplatten sind kommerziell erhältlich (HR3-151, Hampton Research; MD11-55-100, Molecular Abmessungen und LCP96T-UVP70U, Swissci). Aus Kostengründen bevorzugen wir unsere eigenen Platten nach dem Protokoll über zusammenzubauen. 2. In Meso Robot 1 Der erste in meso-Roboter in diesem Video Artikel gezeigt werden, ist das ein derzeit in der MS &amp; FB Group (Abbildung 3). Alle Einzelheiten der Roboter kann unter Materialien und in der Referenz 5 gefunden werden. Die Materialien und equipment zum Einrichten einer Kristallisation Studie mit Hilfe des Roboters sind unter Materialien aufgeführt. <ol><li> Legen Sie die Bodenplatte mit Abstandshalter in Abschnitt 1 auf dem Deck des Roboters vorbereitet. Es hat seine eigene Plattform mit gut Positionen für Zwecke der Grundplatte Ausrichtung markiert. Die Platte sollte für Identifizierungszwecke markiert werden. </li><li> Sichern den 96-well Block in Fällungsmittel eigene Plattform auf dem Deck des Roboters neben dem Kristallisationsplatte. </li><li> Öffnen Sie den Baustein sorgfältig durch Abziehen der Kunststoff-Verschlusskappe. </li><li> Einschalten des Befeuchters und lenken den Strom der feuchten Luft über und über der Basis-Platte auf dem Deck des Roboters. Der Befeuchter ist gezeigt worden, um die Verdampfung des Fällungsmittels Lösung zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit über der Kristallisationstemperatur Platte 5 zu verbessern. Es kann nach vorheriger gedreht werden, um Set-up vor, befeuchten die Gegend, wenn relative Luftfeuchtigkeit niedrig ist, oder nicht, kurz vor der Abgabe von Mesophase beginnt. </li><li> Initialisieren des Roboters nach den Anweisungen des Herstellers. Instrument spezifische Anweisungen werden hier nicht im Detail beschrieben werden, weil genaue Verfahren im Laufe der Zeit verändern wird. Im Wesentlichen, was während der Initialisierung ist, dass der Arm auf Mesophase Abgeben des Roboters mit Referenzpositionen in drei orthogonalen Richtungen X, Y und Z bereitgestellt wird </li><li> Bringen Sie die Protein-beladenen Mesophase in einem Hamilton-Spritze, komplett mit Dosiernadel, um Arm 1 des Roboters (Abbildung 3). Ausführliche Informationen, wie man die Mesophase und wie bereiten Sie es in die Spritze geladen haben Referenzen 3,7-10 beschrieben worden. </li><li> Entfernen Sie die obere Schutzabdeckung von der Abstandshalter auf der Kristallisation Grundplatte und richten Sie die Vertiefungen auf der Platte mit Passermarken auf der Grundplatte Plattform. Anmerkung für die Zwecke dieser Video wurde die Schutzabdeckung an ihrem Platz gelassen, um das Viewer während der Ausrichtungsschritt unterstützen. </li><li> Richten Sie die Nadelspitze der Abgabe syringe mit der Unterseite des obersten gut in der linken Ecke der Kristallisation Platte (Well A1). Dies wird durch Einstellen der Höhe Auges oder Z-Koordinate des Abgeben Arm während beobachten, wie nahe die Nadelspitze auf den Grund des Bohrlochs kommt getan. Dass die Spitze gerade berührt den Boden des Bohrlochs kann durch Bewegen der Platte von Seite zu Seite auf der Plattform während immer so leicht Einstellen der Höhe der Abgabearm beurteilt werden. </li><li> Eintragen in den Computer die Z-Koordinate des Armes, wo die Abgabevorrichtung Spitze kontaktiert die Platte. Abgabevorrichtung programmiert ist, um Platz mit der Nadelspitze 80 Mikrometer von diesem Bezugspunkt Z-Position, die der Fläche der Grundplatte entspricht nehmen. </li><li> Position mit dem Auge die Spitze der Nadel in der Mitte des Well A1. Laden in dem steuernden Rechner der Verweis X, Y-Koordinate des Abgeben Arm, wo die Spitze zentriert ist. Dieses Koordinatensystem wird verwendet, um den Mittelpunkt der übrigen Vertiefungen auf der Platte zu definieren. </li><li> Prime die Spritze mit einem entsprechenden Befehl an den Roboter Computer dass frisches Mesophase sicherzustellen füllt die Dosiernadel und dass die ersten und nachfolgenden Vertiefungen erhalten ihre volle Ergänzung der Mesophase. Abzuwischen extrudierten Mesophase an der Nadelspitze mit Gewebe. </li><li> Starten Sie den Run Robot (X-AP) Programm, um eine Runde Spülschritte wo die Fällungsmittel Abgabe Tipps Arm 2 des Roboters gewaschen und bereit sind, Lösungen aus dem Fällungsmittel Block absaugen zu initiieren. </li><li> Aktivierung des Spendefunktion am Roboter in Bewegung zu setzen die sequentielle Laden von Vertiefungen mit Protein-beladenen Mesophase (üblicherweise 50 nl) erste, eine Spalte von acht Vertiefungen zu einer Zeit, durch Fällungsmittel Lösungen (in der Regel 800 nl) gefolgt. Spalten zwischen dem Laden, befeuchtet die Mesophase Abgabearm kehrt zu einer Parkposition, wo das Ende der Nadel in einen Schwamm gelegt wird, um den Mesophase an der Spitze zu verhindern das Austrocknen. Verfahren des Abgebens Mesophase und Fällungsmittel wird wiederholt11-mal über die Platte, bis die Platte gefüllt. Die Beladung einer 96-Well-Platte mit Mesophase und Fällungsmittel in 5 min in Anspruch. </li><li> Sobald die Platte gefüllt ist und die Roboterarme haben, um ihre Parkpositionen zurückgekehrt, entfernen Sie die Platte aus dem Deck des Roboters und legen Sie es auf eine ebene feste Oberfläche. </li><li> Unmittelbar, dichten die Platte mit einem Deckglas, um zeitabhängige Veränderungen in gut Zusammensetzung zu minimieren. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass alle 96 Wells vollständig abgedeckt werden, dass das Deckglas ausgerichtet ist mit der Grundplatte quadratisch und dass keiner der Deckglas erstreckt sich über den Fußabdruck der Grundplatte. Eine Walze oder Brayer verwendet wird, um eine feste und eine gleichmäßige Abdichtung zwischen dem Deckglas und dem Abstandhalter zu schaffen. </li><li> Überprüfen Sie die Platte sicher zu sein das set up ging, wie es sollte. Was man sucht, ist ein &quot;Spiegelei auf einem pan &#39;Auftritt in jede Vertiefung. Das Eigelb des Spiegelei entspricht der Mesophase. Das Weiß des Eies ist das Fällungsmittel Löauf und der Rand der Pfanne ist vom Rand der Kristallisation gut. Idealerweise sind die drei konzentrischen. </li><li> Die Platte wird in einem temperierten Lagerraum für Kristallwachstum. </li><li> Wenn keine weiteren Platten eingerichtet werden sollen, entfernen Sie das Fällungsmittel Block vom Deck des Roboters, verschließen Sie diese sorgfältig und steckte es zurück ins Lager. </li><li> Entfernen Sie die Spritze mit der Mesophase aus dem Abgeben Arm des Roboters, demontieren und wäscht seine Teile einschließlich Dosiernadel und Ferrule, vorsichtig mit Methanol und trocken in Vorbereitung für den nächsten Einsatz. </li></ol> 3. In Meso Robot 2. Mosquito LCP Die Moskito LCP Roboter (Abbildung 4) eine ähnliche Ausgabevorrichtung Mesophase dem von Roboter 1 verwendet. Im Gegensatz zu Roboter 1, verzichtet er Fällungsmittel durch Einwegspitzen. Programmier-Software wird verwendet, um das Instrument für die Zusammenarbeit mit bestimmten Kristallisation Platten und precipitant-Blöcke, und die Benutzerfreundlichkeit definierter Volumina von Mesophase und Fällungsmittel in einer bestimmten Reihenfolge zu verzichten. Solche Details sind vom Hersteller bereitgestellt und wird hier nicht beschrieben werden. <ol><li> Bereiten Sie eine Hamilton-Spritze, komplett mit Nadel und gefüllt mit Protein-beladenen Mesophase, wie oben unter Robot 1 und in JoVE Artikel 1712 1 beschrieben. </li><li> Klemmen die Spritze in Position auf der Abgabevorrichtung Arm des Roboters. </li><li> Verwenden Sie das Deck montiert Lasersensor, um die X-und Y-Koordinaten der Nadel auf der Dosierspritze etablieren. Dies ist ein wichtiger Schritt erforderlich, um sicherzustellen, daß die Mesophase genau in der Mitte jeder Vertiefung auf der Platte verteilt. </li><li> Mit einem Tastendruck auf dem Bedienfeld, prime die Spritze Mesophase von der Nadel zu vertreiben. Entfernen extrudierten Mesophase von der Nadelspitze mit Gewebe in Vorbereitung für die Verwendung des Roboters zu Vertiefungen laden. </li><li> Vor dem Einsetzen der Kristallisation Platte auf dem Deck des Roboters feuchteen der Oberfläche der Plattform mit ein paar Tropfen Wasser zu helfen, halten Sie die Platte an Ort und Stelle durch Kapillarwirkung. </li><li> Entfernen Sie die Schutzkappe von der Abstandhalter auf dem Glas Bodenplatte und legen Sie es auf seiner Plattform fest gute Haftung zu gewährleisten. Mit den drei Bezugsmarkierungen auf der Plattform, um die drei Vertiefungen Ecke wodurch eine ordnungsgemäße Positionierung der Vertiefungen auf der Platte in Bezug auf die Abgabe Nadelspitze auszurichten. Das Instrument ist nun um einen befohlenen Abgabezyklus Kraft. </li><li> Der Zyklus beginnt mit einer zweiten Priming-Schritt, wo Mesophase auf eine kleine Glasplatte verzichtet wird sofort, bevor sie zu Brunnen mit frischem Mesophase laden. Die Roboter zunächst Lasten mit Mesophase eine vertikale Säule von 8 Vertiefungen auf der Platte und verwendet dann die Einweg-Tipps Fällmittellösung auf der Mesophase Bolus verzichten. Der Prozeß wird 11 Mal entlang der Länge der Platte wiederholt, bis alle Vertiefungen gefüllt werden. Der gesamte Prozess dauert etwa 5 min zu vervollständigen. </li><li> Entfernender gefüllte Platte von der Plattform des Roboters und versiegeln mit einem Deckglas, wie oben unter 1 beschriebenen Roboter. </li><li> Legen Sie die Platte, ordnungsgemäß beschriftet, in einer temperaturkontrollierten Umgebung für das Kristallwachstum. </li></ol> 4. In Meso Robot 3. Gryphon LCP Der Greif LCP Roboter (Abbildung 5) eine ähnliche Mesophase Abgabesystem zu dem oben beschriebenen für Roboter 1 und 2. Was sie von den anderen beiden ist, dass alle 96 Fällungsmittels Lösungen gleichzeitig ausgegeben werden. <ol><li> Bereiten Sie die Protein-beladenen Mesophase und laden Sie es in die Dosierspritze, wie oben beschrieben, unter Robots 1 und 2, und in JoVE Artikel 1712 ein. </li><li> Klemmen die Spritze in Position auf der Abgabevorrichtung Arm des Roboters. </li><li> Platzieren Sie die Fällungsmittellösung Block und Kristallisation Platte auf dem Deck des Roboters. </li><li> Laden Sie die 96-tip head mit Fällungsmittel Lösungen. Ein Benutzer-definierten Verzögerungszeit ist vorgesehen, um zu erleichtern Absaugen viskose Fällungsmittel. </li><li> Befiehl das Instrument an einen Ausgabezyklus geben. Der Zyklus beginnt mit dem Mesophase sequentiell in die 96 Vertiefungen in einem Prozess, der etwa 1 min in Anspruch nimmt verzichtet. Der 96-Spitzenkopf gibt dann alle 96 Fällungsmittel Lösungen auf einmal am Anfang der Mesophase Boli in der Kristallisation Brunnen. Die gesamte Platte Ladevorgang in 2 min beendet. </li><li> Die gefüllte Platte von der Plattform des Roboters und versiegeln mit einem Deckglas, wie oben unter 1 beschriebenen Roboter. </li><li> Legen Sie die Platte, ordnungsgemäß beschriftet, in einer temperaturkontrollierten Umgebung für das Kristallwachstum. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Der Zweck dieses Video Artikel soll zeigen, wie Sie automatisch Kristallisation Studien mit einer viskosen, Membranprotein-beladenen Mesophase in Glas Sandwichpaneelenh 96-well Platten Kristallisation. Der Schwerpunkt liegt auf der Automatisierung durch den Einsatz von spezialisierten Roboter, die minimale manuelle Eingriffe erfordern. Reproduzierbarkeit und Präzision in Bezug auf Volumina von Mesophase und Fällungsmittel verzichtet und die Platzierung von sowohl innerhalb des Bohrlochs, werden erwartet, wenn ein Roboter verwendet wird. Dies sind aus der Sicht der wirksame Abschirmung von Bedingungen, Kristallogenese unterstützt wichtig. Sie sind auch kritisch für den nächsten Schritt in der Analyse Rohrleitung, die zu einem Kristallwachstum oft getan mit bildgebenden Geräten auswerten kann. Drop oder Bolus Ort ist der Schlüssel zum bildgebenden Verfahren und unregelmäßig und falsche Platzierung des Bolus in den Brunnen erfordert in der Regel Eingreifen des Benutzers zur Korrektur und braucht Zeit. Zum Zwecke der Darstellung sind Beispiele von ordnungsgemäß und nicht ordnungsgemäß eingelegt Platten in 6 gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> <html> Abbildung 1. Das Flussdiagramm fasst die Schritte bei der Herstellung, Ernte und Kryo-Kühlung in meso-grown-Kristallen Membranprotein beteiligt. Schritte durch die gestrichelte rote Linie umgeben sind der Schwerpunkt dieser JoVE Artikel. Roboter wurden verwendet, um Lösungen und Fällungsmittel Mesophase in den Schritten 29 bis 32 verzichtet werden. Von Reference 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein voll beladen und verschlossen 96-well Glas-Sandwich Kristallisationsplatte. Jede Vertiefung enthält 50 nl kubischen Phase und 1 ul Fällmittellösung. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die kubische Phase mit dem Sudan Red angefärbt und die Fällmittellösung enthält Methylenblau. Von Reference 5. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Abbildung 3 &quot;/&gt; Abbildung 3. Die in meso Roboter (Robot 1). Der Roboter hat zwei Arme. Arm 1 verzichtet das Protein beladenen Lipid Mesophase. Arm 2 verzichtet Fällungsmittel Lösungen. Beim Befüllen bleibt der 96-Well-Platte in ihrer Position auf dem Deck des Roboters, die selbst stationär befestigt. Die beiden Arme bewegen Mesophase und Fällungsmittel Lösungen zu liefern. Von Reference 3. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Die Mosquito LCP Roboter (Robot 2). Im Gegensatz zu Robot 1, dem Deck des Mosquito LCP, auf denen die 96-Well-Platte und der Fällmittellösung Block sitzen, bewegt sich horizontal während der Befüllung. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Die Gryphon LCP Roboter (Robot 3). Während eineinzurichten, bewegt sich die Lipid-kubischen Phase Spender Protein-beladenen Mesophase auf die 96-Well-Platte zu liefern. Das Deck übersetzt dann horizontal, um die Platte unter dem Fällmittellösung Spitzenkopf positionieren. Alle 96 Fällungsmittel Lösungen werden gleichzeitig ausgegeben. Bild des Herstellers (bezogen <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) und beschriftet. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Ein voll beladen und verschlossen 96-well Glas-Sandwich Platte (A) und Brunnen richtig (B) und falsch (C, D) gefüllt mit dem in meso Roboter (Robot 1). Die Barcode-Etikett auf der Platte in A wird verwendet, um die Platte in der Platte Inkubator / Bildgebungsvorrichtung verfolgen. Einsatzplatten BD, Fällungsmittellösung und Mesophase markiert sind P und M sind. Die erwarteten &quot;Spiegelei auf einem pan &#39;Erscheinungsbild des Bohrlochs in B ist charakteristisch für eine ordnungsgemäß geladen und abgedichtet gut. In C, hat das Fällungsmittel in das Bohrloch unsachgemäß worden in einer außermittigen Position dispensiert und in Kontakt mit dem Abstandshalter kommen. In C wäre es auch ersichtlich, dass das Volumen der Mesophase kleiner als sie sein sollte. Ein Beispiel für unvollständige Beladung mit Fällungsmittellösung in D. Für Maßstab dargestellt ist, ist der Durchmesser aller Kavitäten 6 mm.

<ol><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712(2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501(2011).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Bio.l+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Autom.+Sci.+Eng%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li>
<li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II%3A+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li>
<li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li>
<li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001(2012).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video Artikel haben wir gezeigt, wie man einen Roboter verwenden, um automatisch in meso Kristallisation Studien in 96-well Glas-Sandwich-Platten mit einem Protein-beladenen Lipid Mesophase. Die Roboter in dieser Arbeit verwendet wurden konstruiert, um eine positive Verschiebung Glasspritze für eine genaue und reproduzierbare Abgabe von Nanoliter des viskosen und klebrigen Mesophase umfassen, wie ursprünglich 7 beschrieben. Genauigkeit und Präzision sind wichtige Merkmale eines Roboters. Allerdings sind diese Eigenschaften nur so gut wie der Grad und die Regelmäßigkeit, die Roboter-Performance ausgewertet und Kalibrierung durchgeführt wird. Es versteht sich von selbst, dass die Leistung des Roboters ausgewertet werden, während die einzelnen Platten eingestellt ist oben zeigt. Es ist nicht angemessen, davon auszugehen, dass der Roboter einwandfrei funktionieren und den Roboter zu verlassen, um unbeaufsichtigt laufen. Das aufmerksame und aufmerksame Fahrer sollte in einem pos seinition von einem Ton oder einem Auftritt, wenn etwas nicht richtig funktioniert und es sofort zu korrigieren beachten. Außerdem sollte jede Platte sorgfältig von Auge, sind für Gleichförmigkeit sowie Inhalt inspiziert, sobald die Platte verschlossen ist und bevor es auswärts zur Kristallisation gebracht Studien. Dieses sollte nur wenige Sekunden erforderlich durchzuführen und können durchgeführt werden, während die nächste Platte geladen wird. Bemerken, kann zum Beispiel, dass bestimmte Brunnen sind nicht richtig gefüllt unterstreichen die Tatsache, dass ein bestimmter Fällungsmittel Dosierspitze ist defekt. Lieferung von Mesophase gesehen sollte unregelmäßig sein, wäre die relevanten fehlerhaften Artikel müssen unverzüglich behoben werden. Indem man diese Probleme und macht die entsprechenden Anpassungen während der Einrichtung spart Zeit und Materialien, darunter wertvolle Lipid-und Membran-Protein. Wenn eine Kamera wird verwendet, um das Kristallwachstum zu verfolgen, können die Genauigkeit und Präzision auch während der Bildgebung überwacht werden. Zum Beispiel, systematische Probleme mit Tropfen oder BolusLage der von der Kamera zeigen, dass etwas nicht stimmt und dass Korrekturmaßnahmen irgendwo stromaufwärts in dem Protokoll benötigt wird. Im Interesse der zuverlässigen Leistung daher muss der Roboter in regelmäßigen Abständen kalibriert werden und je nach Bedarf. Kalibrierungen sollten Volumen von Fällungsmittel und Mesophase sowie Bolus und Fällungsmittel Platzierung in der auch geliefert. Offensichtlich sollte möglichst Kalibrierung erfolgt über Volumen und Materialien, die ähnlich zu denen, die in Studien in der Zeit durch die Qualitätskontrolle Übung fallenden Gebieten eingesetzt werden wird. Ebenso wichtig wie die Kalibrierung so auch in Lager eine ausreichende Versorgung mit Roboter Teile und Zubehör. Katastrophal und unerwarteten Ausfällen, Blockaden und Abstürze können und tun auftreten. In einem solchen Fall, mit einen Ersatz verfügbar Fällungsmittel Abgabespitze zum Beispiel könnte bedeuten, dass eine extrem wertvolle Membranprotein Zubereitung, wie es sollte verwendet wird undwird nicht verschwendet. Einige der Vorteile eines Roboters gehört die Tatsache, dass es im Wesentlichen kontinuierlich arbeiten und dass sie nicht aus oder &quot;klagen&quot; Müdigkeit leiden. Ein Roboter kann auch unter Bedingungen, die nicht als menschliche ausgerichtet wie im Dunkeln verwendet werden, unter gesteuerten Beleuchtung und Umgebungsbedingungen und bei extremen Temperaturen. Die Roboter in diesem Artikel gezeigt wurden alle unter Umgebungsbedingungen bei ~ 20 ° C eingesetzt Allerdings gibt es Proteine ​​und nicht-Projekte, die Umgebungstemperaturen gesteuerten Lichts 11,12 und eine oxidierende oder eine reduzierende Umgebung 13 erfordern. Alle diese Faktoren können arrangiert werden, mit relativer Leichtigkeit, wenn eine Kristallisation Roboters verwendet wird. In einer früheren JoVE Video Artikel haben wir gezeigt, wie Kristallisation Studien durch die in meso Verfahren bis manuell 1 gesetzt. Das Mindestvolumen von Mesophasen, die zuverlässig von Hand verzichtet werden begrenzt by die Sehschärfe und stetige Händigkeit der Person der Einrichtung der Studien. Nach unserer Erfahrung sind Volumina von Mesophase so niedrig wie 100 nl leicht zu handhaben. Wir wissen von einem Labor, wo die Standard-Lautstärke verzichtet manuell etwa 40 nl. Allerdings sind wesentlich kleiner Volumina möglich mit einem Roboter. Getrennt haben wir gezeigt, dass Mesophase Volumen so niedrig wie 550 Picoliter robotically 14 verzichtet werden kann. Aus dieser Arbeit war es klar, dass eine weitere Miniaturisierung durch Roboter möglich, die, wenn sie umgesetzt würde zu einer starken Reduzierung der Menge an wertvollen Membranprotein, die zur Durchführung einer Kristallisation Studie zu führen. In diesem Video Artikel wurden drei kommerziell erhältlichen Roboter verwendet, um High-Throughput-Membranprotein Kristallisation mit Lipid-Mesophasen zu demonstrieren. Die erste davon wurde in der MS &amp; FB Group basieren auf unseren Erfahrungen Einrichten Studien manuell, wie in JoVE 1712 1 beschriebenen entwickelt. Dies ist das Instrumentment wir haben die meisten Vertrautheit mit und der Großteil des Stroms Gegenstand auf seine Verwendung gewidmet. Die beiden anderen Roboter waren am Demonstration in der MS &amp; FB Group zum Zeitpunkt der Artikel geschrieben wurde, und die entsprechenden Aufnahmen wird hier im Interesse der Vollständigkeit halber aufgeführt. Alle drei Roboter verwenden sehr viel die gleiche Mesophase Dosiersystem, das wesentliche Merkmal von denen eine positive Verschiebung Glasspritze 5,7 ist. Sie unterscheiden sich am deutlichsten im Hinblick auf die Fällungsmittel Lieferung. Roboter 1 und 2 können gleichzeitig Fällungsmittel verzichten in 8 Vertiefungen eine einzelne Spalte auf einem Kristallisationsplatte zu einer Zeit. Im Gegensatz dazu verzichtet Robot 3 alle 96 Fällungsmittel Lösungen in einer einzigen Aktion. Robot 2 ist das einzige Instrument mit Einweg Fällungsmittel Abgabe Tipps. Es gibt Vorteile und Nachteile der verschiedenen Instrumente, die von der jeweiligen Anwendung abhängen zugeordnet, diese werden hier nicht erarbeitet werden. Es genügt zu sagen, dass alle drei Arbeiten und haben erzeugten Kristalle von mirmbrane Proteine ​​durch die in meso-Methode. Die nächsten Schritte in den gesamten Prozess der Strukturaufklärung von makromolekularen Kristallographie sind bis zur Ernte und Kryo-cool Kristalle aus Platten wie in diesem Video Artikel beschrieben zu setzen und speichern und verarbeiten Röntgenbeugung von ihnen. Diese Themen werden in separaten JoVE Artikel in dieser Serie 1,15 abgedeckt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Komponenten </td></tr><tr><td> Brayer (Rolle) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Gasdichte Spritzen </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Deckgläschen </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Glasplatten </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Art Robbins </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> In meso-Roboter </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Lab Notebook </td><td> Verschiedene </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Mosquito LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Perforierte Doppel-stick Abstandshalterband </td><td> Saunders Corporation (gelocht) </td><td> maßgeschneiderte </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Fällungsmittel Lösungen </td><td> Verschiedene </td><td> Verschiedene </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Gereinigtes Wasser </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Regen-X </td><td> Shell Car Care </td><td> 80199200 </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Spritzenansätze </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (gauge 22) </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Tissues </td><td> Verschiedene </td><td> Verschiedene </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Wasserflasche </td><td> verschiedene </td><td> NA </td><td> Reagens </td></tr></tbody></table>

einsatz eines roboters für high-throughput-kristallisation von membranproteinen in lipidische mesophasen

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Struktur-Funktions-Studien von Membranproteinen stark von mit verfügbaren hochauflösenden 3-D-Strukturen von der Art durch makromolekulare Röntgenkristallographie (MX) profitieren. Ein wesentlicher Bestandteil der MX ist eine stetige Versorgung mit idealerweise Beugung Qualität Kristalle. Die im meso oder lipidische kubischer Phase (LCP) Verfahren zur Kristallisation von Membranproteinen ist eine von mehreren verfügbaren Methoden zur Kristallisation von Membranproteinen. Es nutzt eine bikontinuierliche Mesophase, in dem Kristalle wachsen. Als Methode wurde es hatte einige spektakuläre Erfolge zu spät und hat viel Aufmerksamkeit mit vielen Forschungsgruppen nun mit daran interessiert. Eine der Herausforderungen mit der Methode ist, dass das Hosting Mesophase extrem zähflüssig und klebrig, erinnert an einen dicken Zahnpasta ist. So Abgabe manuell in reproduzierbarer Weise in kleinen Mengen in die Kristallisation Brunnen erfordert Geschick, Geduld und eine ruhige Hand. Ein Protokoll dafür just, die in der Membran Structural &amp; Functional Biology (MS &amp; FB) Gruppe 1-3 entwickelt wurde. JoVE Video Artikel beschreibt die Methode zur Verfügung 1,4. Der manuelle Ansatz für die Gründung von meso Studien hat deutliche Vorteile mit speziellen Anwendungen, wie Kristall-Optimierung und Derivatisierung. Es ist jedoch davon, dass ein niedriger Durchsatz Verfahren leiden. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung in meso Kristallisation Studien Roboter. Ein Roboter bietet die Vorteile von Geschwindigkeit, Genauigkeit, Präzision, Miniaturisierung und in der Lage ist, kontinuierlich zu arbeiten für längere Zeiträume unter was als feindlichen Bedingungen wie im Dunkeln angesehen werden, in einer reduzierenden Atmosphäre oder bei niedrigen oder hohen Temperaturen. Ein in meso Roboter, wenn sie richtig eingesetzt, können erheblich zur Verbesserung der Produktivität von Membranprotein Struktur und Funktion der Forschung durch die Erleichterung Kristallisation, die eine der langsamen Schritten in der esGesamtstruktur Bestimmung Pipeline. In diesem Video Artikel zeigen wir die Verwendung von drei handelsüblichen Roboter, die den viskosen und klebrigen Mesophase integralen in meso Kristallogenese verzichten kann. Der erste Roboter wurde in der MS &amp; FB Group 5,6 entwickelt. Die anderen beiden sind seit kurzem verfügbar und werden hier der Vollständigkeit halber aufgeführt. Eine Übersicht über das Protokoll in diesem Artikel behandelt wird in Abbildung 1 dargestellt. Alle Manipulationen bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) unter Umgebungsbedingungen durchgeführt.

Hierin wird eine Roboter-Ansatz zur Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidische Mesophasen zur Verwendung in Strukturbestimmung mittels makromolekularen Röntgenkristallographie beschrieben. Drei Roboter in der Lage Umgang mit dem viskosen und klebrigen Protein-beladenen Mesophase integraler Bestandteil der Methode eingeführt werden.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Struktur-Funktions-Studien von Membranproteinen profitieren erheblich von der Verfügbarkeit hochauflösender 3D-Strukturen, wie sie durch ... bereitgestellt werden.

Hallo und willkommen bei der Arbeitsgruppe für membranäre Struktur- und Funktionsbiologie. Mein Name ist Martin Caffery. Dies ist ein weiterer Artikel aus einer Reihe von JOVE-Artikeln zum Kristallisieren von Membranproteinen zur Strukturbestimmung mittels der in-meso- oder lipidischen kubischen Phasen-Methode.Im ersten Artikel, JoVE 1 7 1 2, haben wir gezeigt, wie die proteinreiche kubische Phase hergestellt wird und wie die viskose und klebrige Mischphase manuell in Glas-Sandwich-Platten für Kristallisationsversuche abgegeben wird. Dieser Videoartikel beschreibt Methoden zur Verwendung eines In-meso-Kristallisationsroboters. Ein Roboter bietet die Vorteile von Geschwindigkeit, Genauigkeit, Präzision, Miniaturisierung und der Fähigkeit, über längere Zeiträume unter ungünstigen Bedingungen wie Dunkelheit oder niedrigen Temperaturen zu arbeiten.Roboter können, wenn sie richtig eingesetzt werden, die Produktivität der Forschung zu Struktur und Funktion von Membranproteinen erheblich steigern. In diesem Videoartikel demonstrieren wir den Einsatz von drei kommerziell verfügbaren Robotern. Der erste Roboter wurde in der Arbeitsgruppe für membranäre Struktur- und Funktionsbiologie entwickelt und ist im Detail in Referenz eins beschrieben.Die beiden anderen sind erst kürzlich verfügbar geworden und werden hier der Vollständigkeit halber aufgeführt. Die Vorbereitung der Kristallisationsplatte, um einen Kristallisationsversuch robotisch durchzuführen, beginnt mit der Vorbereitung der Basisplatte der in Glas-Sandwich-Bauweise hergestellten Kristallisationsplatte, die im Detail beschrieben ist. Auf die Basisplatte muss zunächst eine Silanisierung aufgebracht werden, und der perforierte doppelseitige Klebespacer, der die Vertiefungen bildet, muss auf die Platte aufgeklebt werden. Die hierfür benötigten Materialien sind hier dargestellt.Sie umfassen eine Glas-Kristallisationsgrundplatte, einen perforierten Doppelseiten-Klebespacer mit Kristallisationslösung, ein Roll- oder Walzgerät, Papiertücher und einen Becher mit UE-Wasser. Die Platte wird auf ein Papiertuch auf einer Laborbank platziert. Einige Tropfen der Kristallisationslösung werden aufgetragen und dann mit einem Papiertuch gleichmäßig über die Oberfläche der Platte verteilt.Die Platte wird von überschüssiger Silanisierungslösung befreit, indem sie vollständig in einen Becher mit Wasser eingetaucht wird. Die Platte wird aus dem Becher genommen, auf ein trockenes Papiertuch gelegt, mit der silanisierten Seite nach oben, und ihre freiliegende Oberfläche wird durch vorsichtiges Abtupfen mit Papiertüchern getrocknet.Danach wird die Schutzabdeckung des perforierten doppelseitigen Abstandshalters entfernt, und der Abstandshalter wird auf der silanisierten Oberfläche der Glasplatte angebracht. Es ist wichtig, dass der Abstandshalter korrekt auf der Grundplatte positioniert wird, sodass die obere linke Ecke sowie die beiden angrenzenden Seiten des Abstandshalters und der Platte exakt übereinstimmen. Ein Roller oder Präzisionszylinder wird verwendet, um den Abstandshalter auf der Grundplatte zu glätten und eine dichte Verbindung zwischen beiden zu erzeugen.Beiläufig bemerken wir, dass siloisierte Platten zusammen mit perforierten Abstandshaltern gemäß dem im Referenzabschnitt Beschriebenen kommerziell erhältlich sind. Nachdem wir die Kristallisationsgrundplatte vorbereitet haben, schreiten wir als Nächstes zur Einrichtung und Nutzung des In-meso-Roboters fort. Wie im Folgenden erläutert, demonstrieren wir die Verwendung von drei In-meso-Robotern.In allen gezeigten Fällen werden die Roboter in einem temperaturgeregelten Raum betrieben, der auf 20 Grad Celsius eingestellt ist, und zwar im Meso-Roboter eins, dem ersten Meso-Roboter, der in diesem Video vorgestellt wird. Der Artikel wurde im Labor des leitenden Wissenschaftlers entwickelt und ist nun kommerziell erhältlich. Vollständige Einzelheiten finden sich im Referenzabschnitt.Die Materialien und Geräte, die für die robotergestützte Einrichtung eines Kristallisationsversuchs benötigt werden, sind hier dargestellt. Dazu gehören ein Laborbuch, mit Protein beladene Mease, frisch hergestellt wie in JoVE-Artikel 1 7 1 2 beschrieben und in einer Hamilton-Spritze aufbewahrt, silanisierte Basisplatten mit Abstandshaltern und passendem Deckglas, eine Wasserflasche und Tücher sowie der in Miso-Roboter.Die erste Ansicht zeigt den Roboter mit freiem Deck. Die nächste Ansicht zeigt den Roboter vollständig bestückt mit der Befeuchtungsstation, der Kristallisationsgrundplatte und dem Deep-Well-Block, der die Fällungslösungen enthält. Wir beginnen die Einrichtung, indem wir die Grundplatte auf das Deck des Roboters stellen.Es verfügt über eine eigene Plattform, die eindeutig mit Positionen für die Brunnen gekennzeichnet ist, um die Ausrichtung der Basisplatte zu ermöglichen. Die Platte sollte zur Identifizierung eindeutig beschriftet sein. Der 96-Loch-Block, der die Präzipitanzlösungen enthält, ist auf einer eigenen Plattform auf dem Deck des Roboters neben der Kristallisationsplatte befestigt.Der Block wird geöffnet, indem die Kunststoffdeckelkappe vorsichtig abgezogen wird. Der Feuchtigkeitsstrom aus dem Luftbefeuchter wird so gelenkt, dass er über die Basisplatte auf der Oberfläche des Roboters strömt, während der Roboter eingerichtet wird. Der Roboter wird gemäß den Herstelleranweisungen initialisiert.Dies wird hier nicht im Detail demonstriert, da sich die genauen Protokolle im Laufe der Zeit ändern können. Im Wesentlichen erfolgt während der Initialisierung die Bereitstellung von Referenzpositionen in drei orthogonalen Richtungen, x, Y und Z, für den Mease-Dosierarm des Roboters. Anschließend wird die mit Protein beladene Meza-Phase in einer Hamilton-Spritze inklusive Dosierkanüle an Arm eins des Roboters befestigt. Detaillierte Angaben zur Herstellung der Meza-Phase und der Spritze finden sich in JoVE-Artikel 1 7 1 2 sowie in Referenz eins. Die Nadelspitze der Dosierspritze muss nun mit dem Boden und der Mitte des obersten Wells in der linken Ecke der Kristallisationsplatte ausgerichtet werden. Dies entspricht dem Well-Identifier A1, wobei die Ausrichtung mit dem Boden von Well A1 als erste Maßnahme erfolgt.Dies geschieht, indem man nach dem Aussenden mit dem Arm die Höhe oder die Z-Koordinate beobachtend anpasst, wie nahe die Nadelsspitze an den Boden des Wells kommt. Dass die Spitze gerade den Boden des Wells berührt, kann beurteilt werden, indem man die Platte manuell von Seite zu Seite auf der Plattform verschiebt, während man die Höhe des Aussende-Arms ganz leicht anpasst; die Z-Koordinate des Aussende-Arms, bei der die Spitze die Platte berührt, wird in den Computer eingegeben. Die Aussendung wird so programmiert, dass die Nadelsspitze um mehrere Mikrometer von dieser Referenz-Z-Position entfernt ist, was der Oberfläche der Basisplatte entspricht. Anschließend wird der Roboter aktiviert, um eine Reihe von vom Benutzer ausgelösten Schritten durchzuführen, um die Nadelsspitze in der Mitte des Wells A1 zu positionieren.Die Referenz-XY-Koordinate des Abgabearms, an der die Spitze zentriert ist, wird im Computer, der den Roboter steuert, gespeichert. Sie dient dazu, die Mitte der verbleibenden Wells auf der Platte zu definieren. Nachdem diese Referenzkoordinaten im Computer festgelegt wurden, erhält der Mease-Abgabearm die Anweisung, in seine Ausgangsposition zurückzukehren und dabei die Spritze zu befüllen.Die Dosierspritze muss nun geprimt werden. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass frische Mease die Dosierkanüle füllt und die erste Vertiefung der Platte ihre vollständige Menge an Mease erhält. Im Programm, das die Roboteraktivierung steuert, befindet sich ein Befehl zum Primen.Es bewirkt, dass sich der Kolben in der Spritze schrittweise unter Benutzerkontrolle vorwärts bewegt. Währenddessen wird die Nadelspitze daraufhin überprüft, ob Mease austritt; die extrudierte Mease-Phase wird mit einem Tuch entfernt. Damit ist der Vorbereitungsvorgang des Roboters abgeschlossen.Der Roboter ist nun betriebsbereit und kann im automatischen Modus mit der Durchführung der Analyse beginnen. Das Robot-XAP-Programm initiiert eine Reihe von Spülschritten, bei denen die Tropfspitzen für das Fällungsmittel am Arm zwei des Roboters gereinigt werden. Anschließend werden diese vorbereitet, um Fällungslösungen aus dem Deep-Well-Block aufzusaugen. Durch Aktivierung der Dosierfunktion am Roboter wird die sequenzielle Befüllung der Vertiefungen in Gang gesetzt: zunächst jeweils acht Vertiefungen mit proteinhaltiger Mease, gefolgt von Fällungslösungen zwischen den einzelnen Applikationen. Danach kehrt der Mease-Dosierarm in eine Parkposition zurück, bei der die Nadelspitze in einem angefeuchteten Schwamm platziert wird, um zu verhindern, dass die Mease an der Spitze austrocknet.Am häufigsten werden bei Kristallisationsversuchen, die in der Arbeitsgruppe für Struktur- und Funktionsbiologie durchgeführt werden, 50 Nanoliter Mease und 800 Nanoliter Präzipitationslösung verwendet. Das Programm, das den Roboter in dieser Demonstration steuert, wurde so eingerichtet, dass sich beide Arme gleichzeitig bewegen.Auf diese Weise ist es möglich, das Beladen einer 96-Loch-Platte mit Mease und Präzipitant innerhalb von fünf Minuten abzuschließen. Unmittelbar nachdem die Platte gefüllt ist und die Roboterarme in ihre Parkpositionen zurückgekehrt sind, wird die Platte vom Deck des Roboters entfernt und auf eine ebene, feste Oberfläche gestellt.Ein Deckglas wird vorsichtig auf die Basisplatte gelegt, sodass es mit der oberen klebrigen Oberfläche des Abstandshalters in Kontakt kommt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass alle 96 Vertiefungen vollständig abgedeckt sind, dass das Deckglas exakt parallel zur Basisplatte ausgerichtet ist und dass kein Teil des Deckglases über die Grundfläche der Basisplatte hinausragt. Ein Roller oder Präger wird verwendet, um eine feste und gleichmäßige Verbindung zwischen dem Deckglas und dem Abstandshalter herzustellen.Die Platte sollte an dieser Stelle überprüft werden, um sicherzustellen, dass der Versuchsaufbau wie vorgesehen verlaufen ist. Gesucht wird ein Aussehen, das an ein Spiegelei in der Pfanne erinnert. In jedem Brunnen entspricht das Eigelb der Meza-Phase.Das Eiweiß ist die Fällungslösung, und der Rand der Pfanne stellt den Randgebiet der Kristallisation dar. Im Idealfall sind die drei konzentrisch angeordnet. Die Platte ist nun bereit, in einem temperaturgeregelten Lagerbereich für das Kristallwachstum aufgestellt zu werden.Falls keine weiteren Platten mehr eingerichtet werden sollen, sollte der Präzipitationsblock vom Deck des Roboters entfernt, ordnungsgemäß verschlossen und wieder in die Lagerung zurückgestellt werden. Die Spritze, die die Mease enthält, wird vom Dosierarm des Roboters entfernt, in ihre verschiedenen Teile zerlegt, einschließlich Dosierkanüle und Ferial. Sorgfältig mit Methanol gewaschen und zur Vorbereitung auf die nächste Verwendung im Meso-Roboter zwei Moskito LCP getrocknet.Der nächste Videoclip zeigt den Moskito-LCP-Roboter, der für die Einrichtung von in-meso-Kristallisationsversuchen verwendet werden kann. Er verfügt über ein ähnliches Meph-Phasen-Dosiersystem wie das zuvor in diesem Artikel beschriebene. Bei Roboter eins wird das Fällungsmittel jedoch mit Einwegspitzen dosiert.Das Instrument selbst ist hier dargestellt. Es umfasst eine Plattform, auf der die Kristallisationsplatte und der Präzipitantenblock positioniert sind, sowie eine Kammer mit Fenstern zur Kontrolle der Luftfeuchtigkeit. In dieser Ansicht wurden die Fenster der Feuchtekammer geöffnet, außerdem ist eine Spule mit Dosierspitzen, ein dosierender Arm und ein lasersbasierter Sensor zur Bestimmung der Position der Trennflüssigkeits-Nadel sichtbar.Eine erhöhte Plattform, auf der die Kristallisationsplatte sitzt, und eine versenkte Plattform zur Aufnahme des Präzipitant-Screen-Blocks. In dieser Abfolge hat der Roboter eine Initialisierungssequenz von Aktionen durchlaufen, sobald das Gerät eingeschaltet wird. Mit Hilfe einer Programmier-Software wird das Gerät für die Arbeit mit bestimmten Kristallisationsplatten und Präzipitant-Blöcken eingerichtet und zur Dosierung definierter Volumina von Mease und Präzipitant in einer vorgegebenen Reihenfolge genutzt.Solche Einzelheiten werden vom Hersteller bereitgestellt und hier nicht dargestellt. Die Verwendung des Roboters zur Vorbereitung einer Kristallisationsplatte beginnt wie folgt: Eine Hamilton-Spritze, komplett mit Nadel und gefüllt mit proteinhaltigem Mes, wird wie oben unter „in meso robot one“ und in JoVE 1 7 1 2 beschrieben vorbereitet. Die Spritze wird unter dem Dosierarm des Roboters in einer Halterung befestigt.Die X- und Y-Koordinaten der Nadel an der Dosierspritze werden mithilfe des am Deck montierten Lasersensors bestimmt. Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Mease genau in der Mitte jedes Wells der Kristallisationsplatte abgegeben wird. Mit einem Knopfdruck auf dem Bedienfeld wird die Spritze entlüftet, um Mease aus der Nadelspitze auszustoßen.Das extrudierte Mease wird anschließend mit einem Tuch entfernt, um die Verwendung des Roboters zum Befüllen der Vertiefungen vorzubereiten, bevor die Kristallisationsplatte auf der Robotereinheit montiert wird. Die Oberfläche der Plattform wird mit einigen Tropfen Wasser angefeuchtet, um die Platte an ihrem Platz zu halten. Über Kapillarwirkung wird die Schutzabdeckung von der Platte entfernt, und die Platte wird fest auf ihrer Plattform platziert, um eine gute Haftung sicherzustellen.Es gibt drei Referenzmarken auf der Plattform, über denen die drei Eck-Vertiefungen zentriert sind, um eine korrekte Positionierung der Platte bezüglich der Spitze der Dosierkanüle sicherzustellen; das Gerät ist nun bereit, einen Einrichtungszyklus zu beginnen. Dieser beginnt mit einem zweiten Ansaugschritt, bei dem Mease auf eine kleine Glasplatte abgegeben wird, unmittelbar bevor das Gerät zur Beladung der Platte mit frischem Mease übergeht. In dieser Abfolge sehen wir, wie der Roboter zunächst mit Mease belädt, und zwar eine vertikale Spalte mit acht Vertiefungen auf der Platte, und anschließend Einmalkapillaren verwendet, um Präzipitationslösung auf den Mease-Tropfen aufzutragen.Dieser Vorgang wird 11-mal entlang der Länge der Platte wiederholt, bis alle Vertiefungen gefüllt sind. Der gesamte Vorgang dauert etwa fünf Minuten. In diesem speziellen Video wurden in jede Vertiefung 50 Nanoliter Mease und 800 Nanoliter Fällungsmittel-Lösung pipettiert.Die gefüllte Platte wird vom Plattformroboter, der auf einem Tisch steht, entfernt. Das Deckglas wird aufgelegt und die Platte wie oben unter Miso-Roboter eins beschrieben mit einem Büstenhalter versiegelt. Die ordnungsgemäß beschriftete Platte kann nun in einer temperaturgeregelten Umgebung für das Kristallwachstum in Meso-Roboter drei, dem Griffin LCP, platziert werden.Dieser letzte Videoclip zeigt den Griffin-LCP-Roboter bei der Einrichtung von in-meso-Kristallisationsversuchen. Der Griffin verfügt über ein ähnliches System zur Dosierung der Meph-Phase wie das oben für Roboter eins beschriebene. In diesem Fall werden jedoch alle 96 Fällungsmittellösungen gleichzeitig dosiert.Das Instrument selbst ist hier dargestellt. Es umfasst eine Plattform, auf der die Kristallisationsplatte und der Präzipitantenblock stehen, einen Dosierarm und einen Phoenix-96-Tip-Kopf. Zur Abgabe von Präzipitatenlösungen wird der Roboter in Aktion in dieser abschließenden Videosequenz gezeigt.Der 96-Tip-Kopf wird zunächst mit Präzipitatorlösung beladen. Eine benutzerdefinierte Verzögerung ermöglicht das Ansaugen viskoser Präzipitanzien. Die MEA-Phase wird nacheinander in die 96 Vertiefungen ausgegeben, wobei der Vorgang etwa eine Minute dauert.Schließlich gibt der 96-Kopf alle 96 Präzipitationslösungen gleichzeitig auf die MEA-Phasenbolusse in den Kristallisationsmulden ab. Der gesamte Plattenbeladeprozess wird innerhalb von zwei Minuten abgeschlossen. Die befüllte Platte wird vom Deck des Roboters entfernt, mit einer Deckglasabdeckung verschlossen und zur Kristallbildung unter kontrollierten Temperaturbedingungen gelagert.Die nächsten Schritte im Gesamtprozess der Strukturaufklärung mittels makromolekularer Kristallographie sind das Ernten und kryogene Abkühlen der Kristalle sowie die Aufnahme und Verarbeitung von Röntgenbeugungsdaten an ihnen. Diese Themen werden in separaten JoVE-Artikeln dieser Reihe behandelt.

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine ​​(MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung,...

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Hierin wird Verfahren im Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group zu ernten und Kryo-cool Membranprotein Kristalle in Lipid kubische und Schwamm Phasen für den Einsatz in der Struktur-Bestimmung mit makromolekularen Röntgenkristallographie gewachsen implementiert beschrieben.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Automatisierte Systeme und Protokolle für die routinemäßige Vorbereitung einer großen Anzahl von Bildschirmen und Nanoliter Kristallisation Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente sind beschrieben und diskutiert.

Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.

Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Dieses Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Kristallisationsscreening, das von der Vorbereitung der 1.536 Mikroassayplatten bis zum Ende eines 6-wöchigen experimentellen Zeitfensters reicht. Es werden Details über den Probenaufbau, die erhaltene Bildgebung und die Art und Weise enthalten, wie Benutzer Analysen mithilfe einer auf künstlicher Intelligenz basierenden grafischen Benutzeroberfläche durchführen können, um makromolekulare Kristallisationsbedingungen schnell und effizient zu...

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine ​​im Bereich von 15 - 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Wir beschreiben ein Verfahren zur affinitätsmarkiert Reinigung von rekombinanten Proteinen unter Verwendung Probenbehandlungstafel Robotik. Dieses Verfahren ist allgemein anwendbar auf die kleinteilige Reinigung von löslichen Proteinen mit His-Tag in einem Hochdurchsatz-Format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidischen Mesophasen mit Robotersystemen. Diese Methode verbessert Geschwindigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit in der Strukturbiologie.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

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