Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Hallo und herzlich willkommen in der Arbeitsgruppe Membranstruktur- und Funktionsbiologie. Mein Name ist Martin Caffery. Dies ist ein weiterer in einer Reihe von JO-Artikeln über die Kristallisation von Membranproteinen für die strukturierte Bestimmung mit der In-Meso- oder Lipic-Kubikphasenmethode.

Im ersten Artikel, JoVE 1 7 1 2, haben wir gezeigt, wie die proteinbeladene kubische Phase vorbereitet wird und wie die viskose und klebrige Misa-Phase manuell in Glassandwichplatten für Kristallisationsversuche dosiert wird. In diesem Videoartikel werden Methoden für den Einsatz eines In-Meso-Kristallisationsroboters beschrieben. Ein Roboter bietet die Vorteile von Geschwindigkeit, Genauigkeit, präziser Miniaturisierung und der Fähigkeit, über längere Zeiträume unter unbequemen Bedingungen wie Dunkelheit oder niedrigen Temperaturen zu arbeiten.

Roboter können, wenn sie richtig eingesetzt werden, die Produktivität der Erforschung der Membranproteinstruktur und -funktion erheblich verbessern. In diesem Videoartikel demonstrieren wir den Einsatz von drei kommerziell erhältlichen Robotern. Der erste Roboter wurde in der Arbeitsgruppe Membranstruktur- und Funktionsbiologie entwickelt und wird in der ersten Referenz ausführlich beschrieben.

Die beiden anderen sind erst seit kurzem verfügbar und werden hier der Vollständigkeit halber aufgenommen. Vorbereitung der Kristallisationsplatte, Einrichten für einen Kristallisationsversuch robotisch, beginnt mit der Vorbereitung der Grundplatte der Glassandwich-Kristallisationsplatte, die in Bezug auf die Grundplatte detailliert beschrieben wird, muss zunächst siloisiert werden, und der perforierte Doppelstababstandhalter, der die Vertiefungen erzeugt, muss auf die Platte aufgebracht werden. Die dafür benötigten Materialien sind hier dargestellt.

Dazu gehören eine Kristallisationsgrundplatte aus Glas, eine perforierte Doppelstab-Abstandshalterlösung, ein Walzen- oder Brayer-Papiergewebe und ein Becherglas mit UE-Wasser. Der Teller wird auf ein Papiertuch auf eine Arbeitsplatte gelegt. Ein paar Tropfen stille Lösung werden aufgetragen und dann mit einem Papiertuch gleichmäßig auf der Plattenoberfläche verteilt.

Die Platte wird von überschüssiger Zisierungslösung gewaschen, indem sie vollständig in ein Becherglas mit Wasser getaucht wird. Die Platte wird aus dem Becherglas genommen und auf ein trockenes Papiertuch gelegt. Die siloisierte Seite nach oben und ihre freiliegende Oberfläche werden durch leichtes Abwischen mit Papiertüchern getrocknet.

Als nächstes wird die Schutzabdeckung auf dem perforierten Doppelstab-Abstandhalter entfernt und der Abstandshalter auf die siloisierte Oberfläche der Glasplatte aufgebracht. Es ist wichtig, dass der Abstandhalter richtig auf der Grundplatte positioniert ist, wobei die obere linke Ecke und die beiden angrenzenden Seiten des Abstandhalters und der Platte zusammenfallen. Eine Walze oder ein Brayer wird verwendet, um den Abstandhalter auf der Grundplatte abzuflachen und eine dichte Abdichtung zwischen ihnen zu schaffen.

In Klammern weisen wir darauf hin, dass siloisierte Bleche mit perforierten Abstandhaltern im Handel erhältlich sind, wie im Referenzabschnitt beschrieben. Nachdem wir die Kristallisationsgrundplatte vorbereitet haben, geht es weiter mit dem Aufbau und der Verwendung des in meso-Roboters. Wie im Folgenden erwähnt, demonstrieren wir den Einsatz von drei in Meso-Robotern.

In allen gezeigten Fällen werden die Roboter in einem klimatisierten Raum mit 20 Grad Celsius im meso-Roboter one aufgestellt und eingesetzt, dem ersten in meso-Roboter, der in diesem Video demonstriert wird. Der Artikel wurde im Labor des PI entwickelt und ist nun kommerziell erhältlich. Ausführliche Informationen finden Sie im Abschnitt Referenzen.

Hier werden die Materialien und die Ausrüstung gezeigt, die für den robotergestützten Aufbau eines Kristallisationsversuchs erforderlich sind. Dazu gehören ein Labornotizbuch, ein mit Proteinen beladenes Material, das frisch zubereitet wird, wie in Artikel 1 7 1 2 beschrieben, und in einer Hamilton-Spritze untergebracht ist. Siloisierte Grundplatten mit Abstandshaltern und passendem Deckglas, Wasserflasche und Taschentücher sowie der In-Miso-Roboter.

Der erste Blick ist auf den Roboter mit freiem Deck. Der nächste Blick ist auf den Roboter mit Befeuchter-Parkstation, Kristallisationsgrundplatte und Deep-Well-Block mit Fällungslösungen. Wir beginnen den Aufbau, indem wir die Grundplatte auf das Deck des Roboters legen.

Er verfügt über eine eigene Plattform, die deutlich mit Bohrlochpositionen gekennzeichnet ist, um die Grundplatte auszurichten. Das Schild sollte zu Identifikationszwecken deutlich gekennzeichnet sein. Der 96-Well-Block mit den Fällungslösungen ist in einer eigenen Plattform auf dem Deck des Roboters neben der Kristallisationsplatte gesichert.

Der Block wird geöffnet, indem die Deckenkappe aus Kunststoff vorsichtig abgezogen wird. Der Feuchtigkeitsstrom des Luftbefeuchters wird so geleitet, dass er über und über die Grundplatte auf dem Deck des Roboters fließt. Einrichten des Roboters. Die Initialisierung des Roboters erfolgt gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Wir werden dies hier nicht im Detail demonstrieren, da sich die genauen Protokolle im Laufe der Zeit ändern werden. Im Wesentlichen geschieht während der Initialisierung, dass der Meza-Dosierarm des Roboters mit Referenzpositionen in drei orthogonalen Richtungen, x, Y und Z, versehen wird. Als nächstes wird die proteinbeladene Meza-Phase in einer Hamilton-Spritze komplett mit Dosiernadel an einem Arm eines der Roboter befestigt. Vollständige Einzelheiten zur Vorbereitung der Meza-Phase und der Spritze sind in Jo von Artikel 1 7 1 2 und in Referenz eins beschrieben. Die Nadelspitze der Dosierspritze muss nun mit dem Boden und der Mitte der obersten Vertiefung in der linken Ecke der Kristallisationsplatte ausgerichtet sein. Dies entspricht der Bohrlochkennung A eins, die mit dem Boden von Bohrloch A eins als erste Tagesordnung

Dies geschieht, indem ich die Höhe oder Z-Koordinate nach dem Dosierarm einstelle und dabei beobachte, wie nah die Nadelspitze an den Boden der Vertiefung kommt. Dass die Spitze nur den Boden der Vertiefung berührt, kann beurteilt werden, indem man die Platte von Hand von einer Seite zur anderen auf der Plattform bewegt, während man die Höhe des Dosierarms leicht verstellt. Die Z-Koordinate des Dosierarms, an der die Spitze die Platte berührt, wird in den Computer eingegeben. Die Dosierung erfolgt so, dass sie mit der Nadelspitze einige Mikrometer von dieser Z-Referenzposition entfernt erfolgt. die der Oberfläche der Grundplatte entspricht. Als nächstes wird der Roboter aktiviert, um eine Reihe von Schritten zu durchlaufen, die vom Benutzer aufgefordert werden, um die Spitze der Nadel in der Mitte von Vertiefung A eins zu positionieren.

Die Referenz-XY-Koordinate des Dosierarms, in dem die Spitze zentriert ist, wird im Computer gespeichert, der den Roboter steuert. Es wird verwendet, um die Mitte der verbleibenden Vertiefungen auf der Platte zu definieren. Nachdem diese Referenzkoordinaten im Computer eingestellt wurden, wird der Dosierarm angewiesen, in seine Ausgangsposition zurückzukehren und die Spritze zu grundieren.

Die Dosierspritze muss nun grundiert werden. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass frisches Mease die Dosiernadel füllt und dass die erste Vertiefung auf der Platte ihre volle Mease erhält. Es gibt einen Priming-Befehl im Programm, der die Aktivierung des Roboters ausführt.

Er bewirkt, dass sich der Kolben in der Spritze unter Kontrolle des Benutzers schrittweise vorschiebt. Während dies geschieht, wird die Spitze der Nadel untersucht, um das Aussehen einer extrudierten Meza-Phase zu erkennen, die mit einem Gewebe entfernt wird. Damit ist der Priming-Prozess abgeschlossen, der den Roboter laufen lässt.

Der Roboter ist nun bereit, im automatischen Modus zu laufen und den Lauf zu starten. Das Roboter-XAP-Programm leitet eine Runde von Spülschritten ein, in denen die Fällmitteldosierspitzen am zweiten Arm des Roboters gewaschen und darauf vorbereitet werden, Fällungslösungen aus dem Tiefbrunnenblock anzusaugen. Die Aktivierung der Dispensierfunktion am Roboter setzt in Gang, die sequentielle Beladung der Vertiefungen mit proteinbeladenen Mease der ersten acht Vertiefungen auf einmal, gefolgt von Fällungsmittellösungen Zwischen den Lieferungen. Der Mease-Dosierarm kehrt in eine Parkposition zurück, in der das Ende der Nadel in einen angefeuchteten Schwamm gelegt wird, um ein Austrocknen des Mease an der Spitze zu verhindern.

Am häufigsten die Werte, die in Kristallisationsversuchen verwendet werden, die in der Membran durchgeführt werden. Die Gruppe der Struktur- und Funktionsbiologie besteht aus 50 Nanolitern Mease und 800 Nanolitern Fällungslösung. Das Programm, das den Roboter in dieser Demonstration ausführt, wurde so eingerichtet, dass sich die beiden Arme gleichzeitig bewegen.

Auf diese Weise ist es möglich, die Beladung einer 96-Well-Platte mit Mease und Fällungsmittel in fünf Minuten abzuschließen. Sofort wird die Platte gefüllt und die Roboterarme sind in ihre Parkpositionen zurückgekehrt. Die Platte wird vom Deck des Roboters entfernt und auf eine ebene feste Oberfläche gelegt.

Ein Deckglas wird sanft auf die Grundplatte gelegt, so dass es mit der oberen klebrigen Oberfläche des Abstandhalters in Kontakt kommt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass alle 96 Vertiefungen vollständig abgedeckt sind, dass das Deckglas rechtwinklig mit der Grundplatte ausgerichtet ist und dass keines der Deckgläser über die Grundfläche der Grundplatte hinausragt. Eine Walze oder ein Brayer wird verwendet, um eine dichte und gleichmäßige Abdichtung zwischen dem Deckglas und dem Abstandhalter zu schaffen.

Die Platte sollte zu diesem Zeitpunkt überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Einrichtung so verläuft, wie sie sollte. Was man sucht, ist ein Spiegelei in einer Pfannenoptik. In jeder Vertiefung entspricht das Joch des Eies der Meza-Phase.

Das Eiweiß des Eies ist die Fällungslösung, und der Rand der Pfanne ist der Umfang der Kristallisation. Nun, im Idealfall sind die drei konzentrisch. Die Platte kann nun für die Kristallzüchtung in einem temperaturkontrollierten Lagerbereich platziert werden.

Wenn keine Platten mehr aufgestellt werden sollen, sollte der Fällmittelblock vom Deck des Roboters entfernt, ordnungsgemäß versiegelt und wieder eingelagert werden. Die Spritze mit dem Dosierarm des Roboters wird aus dem Dosierarm des Roboters entnommen und in ihren verschiedenen Teilen, einschließlich der Dosiernadel und des Ferials, zerlegt. Sorgfältig mit Methanol gewaschen und getrocknet in Vorbereitung auf den nächsten Einsatz In Meso-Roboter zwei Mücken LCP.

Der nächste Videoclip zeigt den Mücken-LCP-Roboter, der bei der Einrichtung von Meso-Kristallisationsversuchen eingesetzt werden kann. Es verfügt über ein ähnliches Meph-Phasen-Dosiersystem wie das zuvor in diesem Artikel beschriebene. Bei Robot one hingegen wird das Fällmittel mittels Einwegspitzen dosiert.

Das Instrument selbst ist hier zu sehen. Es umfasst ein Deck, auf dem die Kristallisationsplatte und der Fällungsblock eine Fensterkammer zur Kontrolle der Feuchtigkeit setzen. In dieser Ansicht wurden die Fenster an der Feuchtigkeitskammer geöffnet: eine Spule mit Dosierspitzen, ein Dosierarm und ein laserbasierter Sensor zur Bestimmung der Position der Meph-Phasen-Dosiernadel

Eine erhöhte Plattform, auf der die Kristallisationsplatte sitzt, eine versenkte Plattform zur Aufnahme des Fällmittelsiebblocks. In dieser Sequenz hat der Roboter gesehen, wie er eine initialisierende Abfolge von Aktionen durchläuft, wenn das Instrument eingeschaltet wird. Programmiersoftware wird verwendet, um das Gerät für die Arbeit mit bestimmten Kristallisationsplatten und Fällmittelblöcken einzurichten und eingestellte Mengen an Material und Fällmittel in einer bestimmten Reihenfolge zu dosieren.

Solche Details werden vom Hersteller zur Verfügung gestellt und hier nicht angezeigt. Die Verwendung des Roboters zum Einrichten einer Kristallisationsplatte beginnt wie folgt: Eine Hamilton-Spritze komplett mit Nadel und gefüllt mit proteinbeladenem Mehl wird vorbereitet, wie oben unter im Mesoroboter eins und in Jo von 1 7 1 2 beschrieben. Die Spritze wird unter dem Abgabearm des Roboters in Position geklemmt.

Die X- und Y-Koordinaten der Nadel auf der Dosierspritze werden mit Hilfe des an Deck montierten Lasersensors ermittelt. Dies ist ein wichtiger Schritt, der erforderlich ist, um sicherzustellen, dass das Material genau in der Mitte jeder Vertiefung auf der Kristallisationsplatte abgegeben wird. Mit einem Knopfdruck auf dem Bedienfeld wird die Spritze so vorbereitet, dass sie den Saft aus der Nadelspitze ausstößt.

Extrudiertes Material wird dann mit einem Tuch entfernt, um den Roboter zum Laden von Wells zu verwenden, bevor die Kristallisationsplatte auf dem Deck des Roboters montiert wird. Die Oberfläche der Plattform wird mit einigen Tropfen Wasser angefeuchtet, um die Platte an Ort und Stelle zu halten. Durch die Kapillare wird die Schutzabdeckung von der Platte entfernt und die Platte fest auf ihre Plattform gelegt, um eine gute Haftung zu gewährleisten.

Auf der Plattform befinden sich drei Passermarken, über denen die drei Eckvertiefungen zentriert werden, um die korrekte Positionierung der Platte in Bezug auf die Dosiernadelspitze zu gewährleisten, das Instrument ist nun bereit, in einen Rüstzyklus einzutreten. Dies beginnt mit einem zweiten Grundierungsschritt, bei dem Mease unmittelbar auf eine kleine Glasplatte aufgetragen wird, bevor die Platte mit frischem Mease bestückt wird. In dieser Sequenz sehen wir, wie der Roboter zuerst mit Mease bestückt, einer vertikalen Säule mit acht Vertiefungen auf der Platte, und dann mit den Einwegspitzen Fällungslösung auf den Mease-Bolus abgibt.

Dieser Vorgang wird 11 Mal über die gesamte Länge der Platte wiederholt, bis alle Vertiefungen gefüllt sind. Der gesamte Vorgang dauert etwa fünf Minuten. In diesem speziellen Video wurden 50 Nanoliter Mease und 800 Nanoliter Fällungslösung in jede Vertiefung gegeben.

Die gefüllte Platte wird von der Plattform des Roboters entfernt, der auf einer Bank platziert ist. Das Deckglas wird aufgebracht und die Platte mit einem BH versiegelt, wie oben unter in Miso Robot One beschrieben. Die richtig beschriftete Platte kann nun in einer temperaturkontrollierten Umgebung für das Kristallwachstum im Meso-Roboter drei, dem Griffin LCP, platziert werden.

Dieser letzte Videoclip zeigt den Griffin LCP-Roboter im Einsatz, wie er in Mesokristallisationsversuchen aufgebaut wird. Der Griffin verfügt über ein ähnliches Meph-Phasen-Dosiersystem wie das oben beschriebene für den ersten Roboter. In diesem Fall werden jedoch alle 96 Fällungslösungen gleichzeitig dosiert.

Das Instrument selbst ist hier zu sehen. Es besteht aus einem Deck, auf dem die Kristallisationsplatte und der Fällmittelblock sitzen, einem Mease-Dosierarm und einem Düsenkopf Phoenix 96. Für die Dosierung von Fällmittellösungen wird in dieser abschließenden Videosequenz der Roboter in Aktion gezeigt.

Der Kopf mit 96er Spitze wird zunächst mit Fällungslösung beladen. Eine benutzerdefinierte Verzögerung ist vorgesehen, um das Ansaugen von viskosen Fällungsmitteln zu erleichtern. Die MEA-Phase wird nacheinander in die 96 Vertiefungen dosiert, wobei ein Vorgang dauert, der etwa eine Minute dauert.

Schließlich dosiert der Kopf mit 96er Spitze alle 96 Fällmittellösungen gleichzeitig auf die MEA-Phasenboli in den Kristallisationsvertiefungen. Der gesamte Ladevorgang der Platten ist in zwei Minuten abgeschlossen. Die gefüllte Platte wird aus dem Deck des Roboters entnommen und die Platte wird mit einem Deckglas versiegelt und unter kontrollierten Temperaturbedingungen für das Kristallwachstum gelagert.

Die nächsten Schritte im Gesamtprozess der strukturierten Bestimmung durch makromolekulare Kristallographie sind die Ernte und Kryokühlung der Kristalle sowie die Aufzeichnung und Verarbeitung der Röntgenbeugung von ihnen. Diese Themen werden in separaten Jobartikeln in dieser Serie behandelt.I.