Name: Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine enthalten, zu Führer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Lernen Sie eine kombinierte biochemische und rechnerische Methode zur effizienten Kristallisation großer Coiled-Coil-Proteine. Dieses Framework integriert experimentelle und computergestützte Techniken zur schnellen Identifizierung geeigneter Kristallisationskandidaten.

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Diese Arbeit wurde durch das Stipendium NIH R01 GM097204 (APV und JDH) unterstützt. Die Finanzierung des JHM erfolgte durch ein HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.

HINWEIS: Ein Diagramm des konzeptionellen Rahmens oder Workflow ist in Abbildung 1 als Referenz beschrieben. Das Protokoll kann in vier Stufen unterteilt werden: Rechen oder Sequenz basiert Prognosen, Proteinexpression und -reinigung, biochemische Charakterisierung und Kristallisation. Die gezeigten Beispiele analysieren Shroom SD2 Domänen und / oder Shroom-Rock-Komplexe, sondern kann mit jedem Protein verwendet werden. 1. Verwenden Sie etablierte Web-basierte Tools Computational Vorhersage der Coiled-Coil-Domänengrenzen generieren <ol><li> Sammeln Sie ein Evolutionarily Diverse Set Sequence Homologe. <ol><li> Zum www.uniprot.org und geben Sie in Shroom in der oberen Suchleiste. </li><li> Wählen Sie Sequenzen, indem Sie das Kästchen neben ihrer Zugangsnummer zum Download bereit. Sequenzen mit einem Sternchen zeigen Sequenzen von Uniprot prüft und sind in der Regel zuverlässig. Achten Sie darauf, dass alle Sequenzen vollständig und genau sind. </li><li> Speichern Sie die ausgewählten sequences durch den Download-Button klicken. </li><li> Richten Sie die Sammlung von Shroom Sequenzen unter Verwendung von Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Durchsuchen&quot; die Datei mit den Shroom Sequenzen auswählen und dann auf Senden drücken. </li><li> Nachdem die Ausrichtung abgeschlossen ist, klicken Sie auf &quot;Download Alignment File&quot; Taste. </li><li> Öffnen Sie die Ausrichtung mehrerer Sequenz erzeugt in 1.1.5 mit Jalview (Datei | Eingang Alignment | Aus Datei). Im Rahmen des neuen Ausrichtungsfenster, Farbe durch Identität (Farbe | Prozent Identity). </li></ol></li><li> Berechnen Vorhersagen der Sekundärstruktur, Vorhersage der flexible oder ungeordneten Sequenz und vorhergesagte Coiled-Coil-Regionen innerhalb des Proteins (e) von Interesse. <ol><li> Zum http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, Coiled-Coil-Prognosen zu berechnen. Kopieren Sie die Sequenz in der Sequenz Box und klicken Sie auf Absenden. HINWEIS: Bei dieser Analyse ein paar Stunden in Anspruch nehmen kann complete. Da Shroom Sequenzen ziemlich groß sind, müssen die Sequenzen können innerhalb des Größenbeschränkung des Webservers zu passen in Blöcken von weniger als 1000 Aminosäuren gespalten werden. Wenn Shrm2 Analyse, wird empfohlen, dass die C-terminale 1.000 Aminosäuren verwendet werden, wie in diesem Abschnitt die SHRM SD2-Domäne enthält, die Coiled-Coil-Regionen enthalten, ist bekannt. Wenn diese Analyse mit anderen Proteinen zu wiederholen, wird empfohlen, die in voller Länge Proteinsequenzen, wenn möglich zu verwenden. Wenn das nicht möglich ist, verwenden Sie das größte Fragment möglich oder die Sequenz sezieren basierend auf bekannten biochemischen oder funktionellen Daten. </li><li> Zum http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, Coiled-Coil-Prognosen zu berechnen. Kopieren Sie die Sequenz in der Sequenz Box und klicken Sie auf Absenden. </li></ol></li><li> Kombinieren Sie die Ergebnisse der Schritte 1.1 bis 1.2.2 in eine einzige umfassende Kommentierung der Shroom Sequenz. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, auch auf alle relevanten i umfassennformation, dass aus der Literatur oder anderen Quellen über die Proteinfunktion oder Reinigung in diesem Stadium zu entnehmen. </li><li> Unter Verwendung dieses umfassenden kommentierten Sequenz vorherzusagen Domänengrenzen (oder eine Reihe von möglichen Grenzen) für das Protein, versuchen Erhaltung zu maximieren und die vorhergesagte strukturelle Merkmale, während die Menge von ungeordneten oder flexible Sequenz minimieren. Wenn bekannt ist, sollte das resultierende Protein der funktionellen Eigenschaften von Interesse behalten. </li></ol> 2. Express und Entschlacken Proteine ​​mit den Domänengrenzen der in Abschnitt 1 HINWEIS: Das Ziel dieses Abschnitts ist es, eine Reihe von schnellen und leicht quantifizierbar Assays zu verwenden hypothetische Domänengrenzen in Abschnitt 1 erzeugt zu screenen. <ol><li> Standard - Molekularbiologie - Techniken innerhalb des His 10 -mRuby2-XH2 Plasmid ein Expressionsplasmid mit der gewünschten Codierungssequenz in Rahmen erzeugen (Figur 3 für die Vektorkarte ein Sehennd weitere Details). </li><li> Test - Expressionsniveaus für jedes Expressionsplasmids BL21 (DE3) E. coli oder einem anderen geeigneten Expressionsstamm in Autoinduktion media 1 bei Raumtemperatur für 18-24 Stunden verwendet wird . <ol><li> Trans Expressionsplasmide sowie eine leere Plasmidkontrolle in BL21 (DE3) nach den Anweisungen, die mit den Zellen geliefert wurde, oder unter Verwendung von robusten Transformationsprotokoll, wie das hier (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -Transformation/). </li><li> Von der frisch transformierten Platte, eine einzige Kolonie holen und eine 5 ml Starterkultur bei 37 ° C über Nacht in LB-Medium (LB) Medien mit 34 &amp; mgr; g / ml Kanamycin wachsen. </li><li> Am folgenden Tag, Pellet, das die Kultur und Waschen des Pellets mit frischen LB. </li><li> Fügen Sie die Starterkultur zu 50 ml Autoinduktion Medien mit 34 &amp; mgr; g / ml Kanamycin. Erlauben die Kultur bis zur Sättigung wachsen entweder bei Raumtemperatur oder 37 ° C. Typischerweise wachsen für ~ 18-24 Std. </li><li> Pellet-Zelles und frieren die resultierenden Zellpellets bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit vor der Reinigung. </li><li> Vergleichen Gesamtzellextrakten aus jeder Expressionsstamm und dem leeren Vektor Kontrolle durch SDS-PAGE die Belastung zu bestimmen, die am wirksamsten für das Fusionsprotein gewünscht erzeugt. Für seine 10 -mRuby2-Shroom SD2 Fusionsproteine, führen 10% SDS-PAGE - Gelen bei 180 V für ~ 50 min oder bis die Farbstofffront erreicht den Boden des Gels 22. </li><li> Stain Gel mit Coomassie - Blau in jedem Stamm 23 gesamt zelluläre Proteine sichtbar zu machen. </li></ol></li><li> Führen Sie eine anfängliche Affinitätschromatographieschritt auf jeden Stamm, die erfolgreich mRuby2-Fusionsprotein exprimiert. Typischerweise führen Reinigung 2.3.2-2.3.7 bei Raumtemperatur die Schritte, es sei denn, das Protein aus veränderten Bedingungen wie Reinigung bei 4 ° C profitieren. <ol><li> Thaw Zellpellets aus Schritt 2.2.5. </li><li> Resuspendieren jedes Zellpellet in 1,5 ml Lysispuffer (10% Glycerin, 500 mM NaCl, 40mM Imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-Mercaptoethanol). Ergänzen Sie die Lyse-Puffer mit Protease-Inhibitoren als angemessen. </li><li> Zugabe von 30 ul 10 mg / ml Lysozym und Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur. Beschallen Sie die Anweisungen für das Gerät verwendet wird. </li><li> Transfer in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugiert in einer Tischzentrifuge 30 Minuten bei 14.000 xg unlösliches Material oder nicht-lysierten Zellen zu pelletieren. Speichern Sie beide Stand und Pellet für die nachfolgende Analyse über SDS-PAGE. </li><li> Führen Nickelaffinitätsreinigung, die lösliche Fraktion, die mit 100 &amp; mgr; l Ni NTA-Kügelchen inkubiert. Inkubieren der Kügelchen mit löslichen Lysat für 5-10 min, mehrfaches Umdrehen Perlen zu mischen. </li><li> Zentrifuge bei 800 × g für 30 Sekunden in einer Tischzentrifuge um die Kügelchen zu pelletieren. Folgen Sie dieser durch das Pellet 3-5 Mal mit Lysepuffer Waschen nicht-spezifische Verunreinigungen zu reinigen. </li><li> Elute Rubin-Fusionsprotein aus den Perlen mit Lysepuffer ergänzt mit 1M Imidazol. </li><li> Verwenden SDS-PAGE, das Verhalten von His-mRuby2-Shroom Proteine ​​in der &quot;quick and dirty&quot; Reinigung oben zu vergleichen. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisieren Protein Probe zu identifizieren Diejenigen mit vorteilhaften Eigenschaften <ol><li> Verwenden Sie ein Spektrophotometer Satz bei 280 nm , die Konzentration des Ruby - Fusionsproteins zu messen und zu beurteilen , dann die Homogenität der Probe von 1-5 ug Fusionsprotein auf einer nativen PAGE - Gel 24 geladen werden . Führen Sie den 10% Native PAGE-Gel bei 4 ° C für 140 min bei 175 V. <ol><li> Bild der native PAGE einen Imager ausgestattet Fluoreszenz sichtbar zu machen, zu beobachten, wo die mRuby-markierte Fusion in diesem Test wandert. HINWEIS: Achten Sie darauf, Fusionsprotein zu beobachten, die in der auch dieses Protein stecken wird wahrscheinlich aggregiert. Wenn ein Fluoreszenz-Imager nicht verfügbar ist, kann man oft zu visualisieren und Bild konzentriert Proben von Ruby markierte Protein unter einem schwarzen Licht oder mit einem UV-Licht-Box. </li></ol></li><li> Führen Sie begrenzte Proteolyse stabil gefaltet Domänen zu identifizieren. Inkubiere 95 &amp; mgr; l von Ruby-SHRM SD2 Fusion bei ~ 1 mg / ml mit 5 ul 0,025% Subtilisin A. <ol><li> Probieren Sie die Reaktion zu den Zeitpunkten 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 und 120 min, Entfernung 10 &amp; mgr; l aus der Reaktion für jeden Zeitpunkt und die Visualisierung des Fortschritts der Reaktion über SDS-PAGE mit 15% Acrylamid-Gel . </li><li> Fleck mit Coomassie-Blau, wie in Schritt 2.2.7 und zu bewerten, ob eine Protease resistente Arten identifiziert werden kann. </li></ol></li><li> Integrieren Sie Daten aus der Reinigungsleistung, Verhalten in native PAGE und begrenzte Proteolyse auf den teilweise gereinigten mRuby2-Shroom-Fusionsproteine ​​in eine umfassende Beurteilung des Gesamtverhalten dieser Proteine ​​in Lösung. <ol><li> (Optional) Wenn eine geeignete Funktionstest zur Verfügung steht, an dieser Stelle für die Tätigkeit überprüfen. </li></ol></li></ol> 4. Herstellung hochwertiger Kristalle der Coiled-Coil-SD2Domain von Shroom HINWEIS: Alle Schritte im Abschnitt 4.1 werden bei Raumtemperatur durchgeführt, es sei denn, das Protein aus der Reinigung bei einer anderen Temperatur profitieren würden, in der Regel 4 ° C. <ol><li> Mit den 50 ml Wucherungen als grobe Schätzung der Expression und Reinigung Potenzial, führen in großem Maßstab Ausdrücke von mRuby2-Shroom SD2 mit dem Ziel, eine 5-20 mg vollständig gereinigte Probe. Typischerweise 2 l Kultur bietet ausreichend Ausgangsmaterial. Nach dem Wachstum Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 xg für 10 min. <ol><li> Resuspendieren des Pellets aus dem 2 L Wachstum in Lysepuffer wie zuvor, unter Verwendung von ~ 2 ml Lyse pro Gramm gefrorene Zellpellet Lysozym zur Lyse bei Verwendung. Alternativ resuspendieren bei ~ 8 ml / g Granulat, wenn ein Homogenisator oder Französisch drücken Sie. Pelletierung von Zelltrümmern durch Zentrifugieren bei 30.000 xg für 30 min. </li><li> Batch binden, um die lösliche Fraktion aus 4.1.1 10 ml Ni-NTA-Harz verwendet wird. Gießen in entsprechende Schwerkraftsäuleund erlauben ungebundenen Proteine ​​abfließen. </li><li> Wasch 3-5 mal mit 40 ml Lysepuffer gefolgt von einer Waschung mit Lysepuffer ergänzt auf 1 M NaCl-Harz. </li><li> Wasch Harz mit 40 ml Lysepuffer mit 80 mM Imidazol ergänzt. </li><li> Eluieren die Rubin-Shroom Fusionsprotein mit 40 ml Lyse-Puffer auf 1 M Imidazol ergänzt. fraktionieren manuell das eluierte Protein in 4-10 ml Fraktionen. </li><li> Bestätigen Fraktionen, die Rubin-Shroom-Fusionsprotein unter Verwendung von 10% SDS-PAGE. </li><li> Dialysieren geeigneten Fraktionen (typischerweise die Fraktionen 2-4) in 8% Glycerin, 250 mM NaCl, 15 mM Imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, unter Verwendung von 6-8 kDa MWCO-Dialyseschlauch. 1 mg TEV-Protease für jede 25-50 mg Fusionsprotein. über Nacht bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren Dialysiere. </li><li> Wiederholen Nickelaffinitätsreinigung Schritte 4.1.2. 4.1.6. Die Shroom SD2 Domäne sollte nun in der ungebundenen Fraktion bleiben , während der Seine 10 -mRuby2 wird gebunden bleibendas Harz und wird in den Elutionsfraktionen gefunden werden. Bestätigen Sie diese mit 12% SDS-PAGE-Färbung mit Coomassie-Blau. </li><li> Dialysieren enthaltenden Fraktionen Shroom SD2 Domäne in 8% Glycerin, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM beta-Mercaptoethanol-Puffer über Nacht. </li><li> Führen Sie Anionenaustauschchromatographie 25 eine FPLC mit und Elution mit einem NaCl - Gradienten von 0,1 bis 1,0 M NaCl. Analysieren Fraktionen unter Verwendung von 12% SDS-PAGE. </li><li> Verwendung eines Spin - Konzentrator (MWCO von 10 kDa oder mehr in Abhängigkeit von dem Protein untersucht), Konzentrat Peakfraktionen auf ~ 0 mg / ml, und dann Chromatographie Größenausschluss durchzuführen 26, Analysieren Peakfraktionen mittels 12% SDS-PAGE. </li><li> Pool Peakfraktionen und dialysiert in 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% Glycerin, 1 mM β-ME und konzentriert, um 10 mg / ml vor der Kristallisation. Optional: Bei diesem Schritt entfernen 5-ul-Proben bei Konzentrationen von 1, 2, 5 und 10 mg / ml im Verlauf der Probe zu konzentrieren.Ausführen eines nativen PAGE Lade 2-5 &amp; mgr; l jeder Probe in diesem Schritt auf das Verhalten der Probe zu betrachten. </li></ol></li><li> Bildschirm ein kleines Feld von 12 Bedingungen für eine optimale Proteinkonzentration für Kristallisationsversuche zu identifizieren. Die Zusammensetzung dieser Bedingungen ist in Abbildung 7 beschrieben. <ol><li> Mit 24-Well-Drop-Kristallisation Schalen sitzen, führen Kristallisationsversuche die Dampfdiffusionsverfahren unter Verwendung Pipettieren 500 ul jedes der 12 Bedingungen in getrennten Vertiefungen von Tropfen gefolgt, die zunächst 1 ul gut Lösung enthalten und 1 ul Proteinprobe auf den Deckgläsern . Bitte beachten Sie 27 für weitere Informationen zu dieser Technik. </li><li> Schnell versiegeln Sie das Fach mit durchsichtigem Klebeband und das Fach auf eine geeignete Temperatur kontrollierten Umgebung bewegen, die vibrationsfrei ist. Die verwendete Temperatur kann variieren, aber 4 &amp; deg; C, 16 ° C und 20 ° C sind durchaus üblich. </li><li> Untersuchen Sie die Tropfen in den Böden in den nächsten 3 days ein Mikroskop mit bis zu 100-facher Vergrößerung verwendet wird. Am Ende der 3-Tage-Frist, Score jeden Tropfen wie die kein Niederschlag (klar), leichte Niederschläge, starke Niederschläge (braun), oder Kristalle. Eine geeignete Proteinkonzentration sollte nicht mehr als 6 schwere Ausfällungen enthalten. </li><li> Unter Verwendung der Proteinkonzentration in 4.2 identifiziert, Bildschirm, um eine breite Palette von im Handel erhältlichen Kristallisations Bildschirme. Die Verwendung eines Liquid-Handling-Roboters oder Kristallisation beschleunigt stark diesen Prozess, während auch Fehler in den Tropfen zu minimieren. Es erfordert viel weniger Protein als auch, so dass der Benutzer mehrere Bedingungen mit einer einzigen Probe zu screenen. </li><li> Verbesserung der Anfangsbedingungen von breiten Bildschirmen identifiziert, indem sie systematisch jede der Variablen innerhalb des Kristallisationstropfen unterschiedlicher Verwendung von 24-Well-Screening-Tabletts wie zuvor. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Protokoll soll dem Benutzer helfen, Domänengrenzen innerhalb großer Coiled-Coil-Proteine zu identifizieren, um deren Kristallisation zu erleichtern. Das Protokoll beruht auf einer ganzheitlichen Einbeziehung einer Vielzahl von Daten aus computergestützten Vorhersagen und anderen Quellen, um eine Reihe potenzieller Domänengrenzen zu generieren. Darauf folgt eine Reihe von biochemischen Experimenten, die schnell und kostengünstig sind und dazu dienen, diese anfänglichen Hypothesen weiter zu verfeinern...

Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie hat zu allen Bereichen der modernen Biologie fundamentale Beiträge geleistet; eine atomare Ansicht der Makromoleküle bieten, die das Leben unterstützen und wie sie miteinander in einer Vielzahl von Kontexten interagieren; ermöglicht es uns, die Mechanismen zu verstehen, die Medikamente entwickeln zu behandeln Krankheit rational Krankheit und Bereitstellung von Möglichkeiten führen zu. Kristallographie ist seit langem die dominierende experimentelle Technik für makromolekulare Struktur zu bestimmen und derzeit einen Anteil von 89,3% der Strukturdatenbank (www.rcsb.org). Diese Technik hat viele Vorteile, einschließlich des Potenzials für eine sehr hohe Auflösung, die Fähigkeit, Makromoleküle zu visualisieren mit einer breiten Palette von Größen, relativ einfache Datenerfassung, und die Möglichkeit, sich vorzustellen, wie das Makromolekül mit Lösungsmittel sowie Liganden in Wechselwirkung tritt. Trotz zahlreicher technologischer Verbesserungen in der rekombinanten Proteinexpression 1,2, purifizierung 3 und Molekularbiologie diese Systeme 4, das größte Hindernis in der kristallographischen Verfahren zur Erzeugung verwendet wird, bleibt die Fähigkeit Beugungs Kristalle zu züchten. Dies war vor allem für Proteine, die große Coiled-Coil-Domänen enthalten. Es wurde geschätzt , dass bis zu 5% aller Aminosäuren innerhalb Coiled-Coils 5,6, so dass dies eine sehr häufige Strukturmerkmal 7 gefunden werden, doch sind diese Proteine sind oft schwierig zu reinigen und zu kristallisieren als globuläre Proteine 8-10 . Dies wird weiter durch die Tatsache verstärkt, dass Coiled-Coil-Domänen oft im Rahmen eines größeren Proteins gefunden werden, deshalb richtig, die Grenzen dieser Domänen Vorhersage ist kritisch, um die Aufnahme von unstrukturierten oder flexible Sequenz zu vermeiden, die für die Kristallisation oft nachteilig ist. Hier präsentieren wir einen konzeptionellen Rahmen kombiniert webbasierte Berechnungsanalysen mit Experimental Daten aus der Bank, führen den Benutzer durch den Anfangsstadien der kristallographischen Prozess zu helfen, einschließlich: wie Proteinfragment auszuwählen (e) für Strukturuntersuchungen, und wie die Vorbereitung und Proteinproben vor der Kristallisation Versuche charakterisieren. Wir konzentrieren unsere Analyse auf zwei Proteine ​​große Coiled-Coil-Domänen enthält, Shroom (SHRM) und Rho-Kinase (Rock). Diese Proteine wurden ausgewählt , da sie beide Coiled-Coil - Domänen enthalten und sind dafür bekannt , eine biologisch relevanten Komplex 11-16 zu bilden. Shroom und Rho-Kinase (Rock) vorhergesagt werden ~ 200 und 680 Reste von Coiled-Coil enthalten jeweils viele Teile davon wurden strukturell 17-20 gekennzeichnet. Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Workflow schnell Fragmente von Coiled-Coil-haltiges Protein zu identifizieren, die für die Kristallisation geeignet sein wird, aber die beschriebenen Techniken können leicht für die meisten Protein oder Protein-Komplexe oder modifiziert angepasst werden Hochdurchsatz approa einzuarbeitenChes als verfügbar. Schließlich sind diese Verfahren im allgemeinen nicht teuer und können durch Nutzer an nahezu allen Erfahrungsstufen durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) Rosetta</td><td>Emd Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Codon Plus</td><td>Agilent Technologies</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Harz</td><td>Life Technologies</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>SubtilisinA</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Cryschem Plate</td><td>Hampton research</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &nbsp; 96:</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>Overnight Express Autoinduktionssystem 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Bouillon Pulver</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

nass- und trockenlabortechniken die kombination der kristallisation von large coiled-coil-proteine ​​enthalten, zu führer

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Die Gewinnung von Kristallen für die Strukturbestimmung kann für jedes Protein ein schwieriges und zeitaufwändiges Unterfangen sein. Coiled-Coil-Proteine und -Domänen sind in der gesamten Natur zu finden, werden jedoch aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften und ihrer Neigung zur Aggregation traditionell als besonders schwer zu kristallisieren angesehen. Hier verwenden wir eine Vielzahl von schnellen und einfachen Techniken, um eine Reihe möglicher Domänengrenzen für ein bestimmtes Coiled-Coil-Protein zu identifizieren und dann das Verhalten dieser Proteine in Lösung schnell zu charakterisieren. Durch die Hinzufügung eines stark fluoreszierenden Tags (mRuby2) ist die Proteincharakterisierung einfach und unkompliziert. Das Zielprotein kann bei normaler Beleuchtung leicht sichtbar gemacht und mit Hilfe eines geeigneten Imagers quantifiziert werden. Ziel ist es, schnell Kandidaten zu identifizieren, die aus der Kristallisationspipeline entfernt werden können, weil sie wahrscheinlich keinen Erfolg haben, wodurch mehr Zeit für die besten Kandidaten bleibt und weniger Mittel für Proteine ausgegeben werden, die keine Kristalle produzieren. Dieser Prozess kann iteriert werden, um Informationen aus ersten Screening-Bemühungen einzubeziehen, kann für Hochdurchsatz-Expressions- und Reinigungsverfahren angepasst werden und wird durch robotisches Screening für die Kristallisation ergänzt.

Ein Diagramm , das den Workflow in diesem System verwendet darstellt , ist in Abbildung 1 gezeigt und umfasst drei Hauptphasen. Computational Analyse der Sequenz verwendet wird, um Hypothesen über die Domänengrenzen der Coiled-Coil-Protein von Interesse zu entwickeln. Ein Beispiel eines kommentierten Analyse der Shrm2 SD2 Domäne ist in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Diagramm wurde das Ziel möglich Domänengrenzen für eine konservierte Domäne am C-Term...

Wir beschreiben einen Rahmen, der einfache biochemische und rechnerische Analysen umfasst, um die Charakterisierung und Kristallisation von großen Coiled-Coil-Domänen zu leiten. Dieser Rahmen kann für globuläre Proteine angepasst oder um eine Vielzahl von Hochdurchsatztechniken erweitert werden.

Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine ​​enthalten, zu Führer

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mögliche Domänengrenzen innerhalb großer Coiled-Coil-Proteine schnell zu identifizieren und zu testen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, ein intrinsisches Fragment zu finden, das kristallisiert. Diese Methode kann Forschern helfen, den Kristallisationsprozess für große Coiled-Coil-Proteine zu rationalisieren, die notorisch schwer zu kristallisieren sein können. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sowohl experimentelle als auch computergestützte Methoden integriert, um wahrscheinliche Kandidaten für die Kristallisation schnell zu identifizieren und zu screenen und so ihre Erfolgschancen zu verbessern.Diese Technik wird von Jenna Zalewski, einer Doktorandin in meinem Labor, und Keith O'Conor, einem Studenten in meinem Labor, demonstriert. Kombinieren Sie zunächst die Ausgabe von etablierten webbasierten Tools, um Vorhersagen über mögliche Coiled-Coil-Domänengrenzen zu generieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem Sie Expressionsplasmide generiert und ihre Expressionsniveaus getestet haben, wie im Text beschrieben, beginnen Sie mit der Aufreinigung jedes Stammes, der erfolgreich Ruby-markiertes Protein exprimiert hat.Um die Zellen zu lysieren, resuspendiert man zunächst jedes aufgetaute Zellpellet in 1,5 Millilitern Lysepuffer, der mit Proteaseinhibitoren ergänzt wurde. 30 Mikroliter Lysozym in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter zugeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann beschallen, wobei die Anweisungen für das verwendete Instrument befolgt werden. Zentrifugieren Sie die Probe in einer Tischzentrifuge für 30 Minuten bei 14.000 G G, um unlösliches Material oder unlysierte Zellen zu pelletieren.Speichern Sie sowohl den Überstand als auch das Pellet für die spätere Analyse über SDS-PAGE. Um eine Nickelaffinitätsreinigung durchzuführen, inkubieren Sie zunächst 100 Mikroliter der Nickel-NTA-Kügelchen, die fünf bis 10 Minuten lang in Lysepuffer mit dem löslichen Lysat vorgewaschen sind. Drehen Sie die Suspension mehrmals um, um die Perlen zu vermischen.Zentrifugieren Sie die Probe 30 Sekunden lang bei 800 mal G in einer Tischzentrifuge, um die Kügelchen zu pelletieren. Waschen Sie das Pellet anschließend drei- bis fünfmal mit Lysepuffer, um unspezifische Verunreinigungen zu entfernen. Zum Schluss eluieren Sie das Ruby-Fusionsprotein aus den Kügelchen mit Lysepuffer, ergänzt mit einem molaren Imidazol.Verwenden Sie ein auf 280 Nanometer eingestelltes Spektralphotometer, um die Konzentration des Ruby-Fusionsproteins zu messen, und beurteilen Sie dann die Homogenität der Probe, indem Sie ein bis fünf Mikrogramm Fusionsprotein auf ein natives PAGE-Gel laden. Lassen Sie das 10%native PAGE-Gel 140 Minuten lang bei 175 Volt bei vier Grad Celsius laufen. Bilden Sie die native PAGE mit einem Imager ab, der für die Visualisierung der Fluoreszenz ausgestattet ist, und beobachten Sie, wohin die Ruby-markierte Fusion in diesem Assay migriert.Führen Sie eine begrenzte Proteolyse durch, um stabil gefaltete Domänen zu identifizieren, indem Sie zunächst 95 Mikroliter Ruby-Shroom SD2-Fusion mit fünf Mikrolitern 0,025 Subtilisin A inkubieren. Proben Sie die Reaktion zu Zeitpunkten von null, 0,5, zwei, fünf, 15, 60 und 120 Minuten, entfernen Sie 10 Mikroliter aus der Reaktion für jeden Zeitpunkt und visualisieren Sie den Fortschritt der Reaktion über SDS-PAGE mit einem 15%igen Acrylamidgel. Färben Sie das Gel mit Coomassie blue, um zu bewerten, ob eine Protease-resistente Spezies identifiziert werden kann. Integrieren Sie die Daten aus der Aufreinigungseffizienz, dem Verhalten in nativer PAGE und der begrenzten Proteolyse an den teilweise gereinigten mRuby2-Shroom-Fusionsproteinen in eine umfassende Bewertung des Gesamtverhaltens dieser Proteine in Lösung.Führen Sie großflächige Expressionen mit zwei Literkulturen von mRuby2-Shroom SD2 durch, mit dem Ziel, fünf bis 20 Milligramm vollständig gereinigte Probe zu erhalten. Nach dem Zellwachstum werden die Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 G für 10 Minuten pelletiert. Das resultierende Zellpellet kann bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Als nächstes wird das Pellet in etwa acht Millilitern Lysepuffer pro Gramm gefrorenem Zellpellet resuspendiert. Lysieren Sie die resuspendierten Zellen mit einem Homogenisator. Nach der Zelllyse pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 30.000 G für 30 Minuten.Als nächstes binden Sie die lösliche Fraktion mit 10 Millilitern vorgewaschenem Nickel-NTA-Harz. Gießen Sie die Bead-Suspension in eine geeignete Schwerkraftsäule und lassen Sie die ungebundenen Proteine abfließen, waschen Sie das Harz dann drei- bis fünfmal mit 40 Millilitern Lysepuffer, gefolgt von einer Wäsche mit Lysepuffer, der mit einem molaren Natriumchlorid ergänzt wird. Führen Sie eine abschließende Wäsche des Harzes mit 40 Millilitern Lysepuffer durch, der mit 80 Millimolar Imidazol ergänzt wird.Eluieren Sie das Ruby-Pilz-Fusionsprotein mit 40 Millilitern Lysepuffer, der ein molares Imidazol enthält. Fraktionieren Sie das eluierte Protein manuell in vier bis 10 Milliliter-Fraktionen. Bestätigen Sie Fraktionen, die Ruby-Shroom-Fusionsprotein enthalten, mit einem 10%igen SDS-PAGE-Gel.Fügen Sie jeweils 25 bis 50 Milligramm Fusionsprotein ein Milligramm TEV-Protease hinzu, um das Ruby-Tag zu entfernen. Als nächstes dialysieren Sie die entsprechenden Fraktionen in TEV-Spaltpuffer mit einem Dialyseschlauch mit einem Molekulargewicht von sechs bis acht Kilodalton. Dialysieren Sie das Protein über Nacht bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren.Wiederholen Sie nach der Dialyse die Reinigungsschritte der Nickelaffinität. Die Pilz-SD2-Domäne sollte in die ungebundene Fraktion fließen, während der Ruby-Tag an das Harz gebunden bleibt. Konzentrieren Sie die Peakfraktionen mit einem Spinkonzentrator auf etwa 10 Milligramm pro Milliliter und führen Sie dann eine Größenausschlusschromatographie durch, bei der die Peakfraktionen mit einem 12%igen SDS-PAGE-Gel analysiert werden.Nach dem Poolen der Peakfraktionen dialysieren Sie die Lösung in einen Kristallisationspuffer und konzentrieren das dialysierte Protein vor der Kristallisation auf 10 Milligramm pro Milliliter. Screenen Sie ein kleines Array von 12 Bedingungen, um eine optimale Proteinkonzentration für Kristallisationsversuche mit 24 gut sitzenden Tropfkristallisationsschalen zu identifizieren. Führen Sie Kristallisationsversuche mit der Dampfdiffusionsmethode durch.Pipettieren Sie zunächst 500 Mikroliter jeder der 12 Bedingungen in separate Vertiefungen. Machen Sie auf jedem Sockel Tropfen, die einen Mikroliter Well-Lösung und einen Mikroliter Proteinprobe enthalten. Verschließen Sie das Tablett schnell mit durchsichtigem Klebeband und bringen Sie das Tablett dann in eine geeignete temperaturkontrollierte Umgebung, die vibrationsfrei ist.Untersuchen Sie die Tropfen in den Schalen in den nächsten drei Tagen mit einem Mikroskop bei bis zu 100-facher Vergrößerung. Am Ende des Zeitraums von drei Tagen bewerten Sie jeden Tropfen als niederschlagsfrei, leicht, starkniederschlags- oder kristallfrei. Eine geeignete Proteinkonzentration sollte nicht mehr als sechs schwere Ausfällungen enthalten.Unter Verwendung der ermittelten Proteinkonzentration wird eine breite Palette von kommerziell erhältlichen Kristallisationssieben gescreent. Der Einsatz eines Liquid-Handling- oder Kristallisationsroboters beschleunigt diesen Prozess erheblich und minimiert gleichzeitig Fehler in den Tropfen. Es wird viel weniger Protein benötigt, so dass der Benutzer mit einer einzigen Probe mehr Erkrankungen untersuchen kann.Verbessern Sie die Anfangsbedingungen, die von breiten Bildschirmen identifiziert wurden, indem Sie wie bisher systematisch jede der Variablen innerhalb des Kristallisationstropfens mit 24-Well-Screen-Trays variieren. Die eingeschränkte Proteolyse wird verwendet, um Regionen des Proteins zu identifizieren, die flexibel oder anderweitig leichter für die Protease zugänglich sein könnten. Hier ist ein Degradationsmuster für eine SD2-Domäne dargestellt, die proteolytisch empfindlich ist, und eine andere, die recht stabil ist.Eine begrenzte Proteolyse wurde im Rahmen der Ruby-Fusionsproteine durchgeführt. In diesem Fall wurde die Linkersequenz zwischen Ruby und der SD2-Domäne erwartungsgemäß schnell gespalten, aber die resultierenden Ruby- und SD2-Fragmente blieben weitgehend stabil. Die Analyse durch natives PAGE kann schnell gute Kandidaten für die Kristallisation aufdecken.Vier Shroom-Rock-Komplexe mit unterschiedlichen Proteinbatterien wurden auf nativen PAGE-Gelen laufen lassen. Der Komplex, der die Gesteine 834 bis 913 enthielt, zeigte das beste Verhalten und kristallisierte leicht, während die anderen erst beim Abbau kristallisierten oder nicht vollständig kristallisierten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Satz potenzieller Domänengrenzen für Ihr großes Coiled-Coil-Protein entwickeln und wie Sie das Ruby-System verwenden können, um schnell und schnell die besten Kandidaten für die Kristallisation zu identifizieren.Während die Kristallographie nach wie vor ein zeitaufwändiges Unterfangen ist, konzentriert sich die Verwendung dieser Technik auf die Suche nach Proteinen, die mit einfachen Assays kristallisieren, um schlechte Kandidaten zu entfernen, sodass Sie mehr Zeit mit den Kandidaten mit besseren Erfolgsaussichten verbringen können. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, so viele Informationen wie möglich einzubeziehen, wenn Sie Ihre möglichen Domänengrenzen auswählen. Die Informationen, die Sie bei der Anwendung dieses Verfahrens auswählen, variieren für jedes Protein.Wenn möglich, sollten andere Methoden, wie zellbasierte oder biochemische Assays, durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die betreffenden Proteinfragmente immer noch die Funktion von biologischem Interesse aufweisen. Obwohl sich diese Methode auf Coiled-Coil-Proteine konzentriert, könnte das Gesamtgerüst leicht für fast jedes Protein angepasst werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bestimmten Instrumenten und biologischen Reagenzien gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen oder das Tragen einer Schutzbrille, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer befolgt werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die 3-D-Struktur eines Moleküls liefert ein einzigartiges Verständnis dafür, wie das Molekül Funktionen. Die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung in nahezu atomarer Auflösung ist Röntgenstrukturanalyse. Hier zeigen wir die aktuellen Methoden zur Gewinnung von dreidimensionalen Kristallen von jedem Makromolekül, die sich für die Strukturbestimmung mittels Röntgen-Kristallographie.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine ​​(MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung,...

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Structure-based drug design spielt eine wichtige Rolle in der Medikamentenentwicklung. Verfolgen mehrere Ziele parallel erhöht die Chance auf Erfolg für Blei Entdeckung. Der folgende Artikel zeigt, wie die Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease eine Multi-Target-Ansatz für die Gen-to-Bestimmung der Struktur des Influenza-A-Untereinheit PB2 nutzt.

Multi-Target-Parallel Processing Ansatz zur Gene-to-Struktur Bestimmung der Influenza Polymerase PB2-Untereinheit

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Automatisierte Systeme und Protokolle für die routinemäßige Vorbereitung einer großen Anzahl von Bildschirmen und Nanoliter Kristallisation Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente sind beschrieben und diskutiert.

Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die kontrollierte Produktion von Protein Mikrokristalle. Das Verfahren nutzt ein automatisierte Gerät ermöglicht kontrollierte Manipulation verschiedener Parameter der Kristallisation. Die Protein-Kristallisation ist durch kontrollierte und Automatische Zugabe von Kristallisation Lösungen während der Überwachung und Untersuchung der Radius-Verteilung von Partikeln in der Kristallisation Tropfen durchgeführt.

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.

Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Dieses Protokoll beschreibt einen Aufbau für die Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8. ABCG5/G8 wird für die Hängetropfenkristallisation in Bizellen rekonstituiert. Das Protokoll erfordert keine speziellen Materialien oder Substrate, so dass es in jedem Labor zur Bestimmung der Proteinstruktur durch Röntgenkristallographie zugänglich und einfach angepasst werden kann.

ABCG5/G8-Kristallisation in einer lipidischen Bizellenumgebung für die Röntgenkristallographie

Lernen Sie eine kombinierte biochemische und rechnerische Methode zur effizienten Kristallisation großer Coiled-Coil-Proteine. Dieses Framework integriert experimentelle und computergestützte Techniken zur schnellen Identifizierung geeigneter Kristallisationskandidaten.

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