Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine ​​enthalten, zu Führer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mögliche Domänengrenzen innerhalb großer Coiled-Coil-Proteine schnell zu identifizieren und zu testen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, ein intrinsisches Fragment zu finden, das kristallisiert. Diese Methode kann Forschern helfen, den Kristallisationsprozess für große Coiled-Coil-Proteine zu rationalisieren, die notorisch schwer zu kristallisieren sein können. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sowohl experimentelle als auch computergestützte Methoden integriert, um wahrscheinliche Kandidaten für die Kristallisation schnell zu identifizieren und zu screenen und so ihre Erfolgschancen zu verbessern.

Diese Technik wird von Jenna Zalewski, einer Doktorandin in meinem Labor, und Keith O'Conor, einem Studenten in meinem Labor, demonstriert. Kombinieren Sie zunächst die Ausgabe von etablierten webbasierten Tools, um Vorhersagen über mögliche Coiled-Coil-Domänengrenzen zu generieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem Sie Expressionsplasmide generiert und ihre Expressionsniveaus getestet haben, wie im Text beschrieben, beginnen Sie mit der Aufreinigung jedes Stammes, der erfolgreich Ruby-markiertes Protein exprimiert hat.

Um die Zellen zu lysieren, resuspendiert man zunächst jedes aufgetaute Zellpellet in 1,5 Millilitern Lysepuffer, der mit Proteaseinhibitoren ergänzt wurde. 30 Mikroliter Lysozym in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter zugeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann beschallen, wobei die Anweisungen für das verwendete Instrument befolgt werden. Zentrifugieren Sie die Probe in einer Tischzentrifuge für 30 Minuten bei 14.000 G G, um unlösliches Material oder unlysierte Zellen zu pelletieren.

Speichern Sie sowohl den Überstand als auch das Pellet für die spätere Analyse über SDS-PAGE. Um eine Nickelaffinitätsreinigung durchzuführen, inkubieren Sie zunächst 100 Mikroliter der Nickel-NTA-Kügelchen, die fünf bis 10 Minuten lang in Lysepuffer mit dem löslichen Lysat vorgewaschen sind. Drehen Sie die Suspension mehrmals um, um die Perlen zu vermischen.

Zentrifugieren Sie die Probe 30 Sekunden lang bei 800 mal G in einer Tischzentrifuge, um die Kügelchen zu pelletieren. Waschen Sie das Pellet anschließend drei- bis fünfmal mit Lysepuffer, um unspezifische Verunreinigungen zu entfernen. Zum Schluss eluieren Sie das Ruby-Fusionsprotein aus den Kügelchen mit Lysepuffer, ergänzt mit einem molaren Imidazol.

Verwenden Sie ein auf 280 Nanometer eingestelltes Spektralphotometer, um die Konzentration des Ruby-Fusionsproteins zu messen, und beurteilen Sie dann die Homogenität der Probe, indem Sie ein bis fünf Mikrogramm Fusionsprotein auf ein natives PAGE-Gel laden. Lassen Sie das 10%native PAGE-Gel 140 Minuten lang bei 175 Volt bei vier Grad Celsius laufen. Bilden Sie die native PAGE mit einem Imager ab, der für die Visualisierung der Fluoreszenz ausgestattet ist, und beobachten Sie, wohin die Ruby-markierte Fusion in diesem Assay migriert.

Führen Sie eine begrenzte Proteolyse durch, um stabil gefaltete Domänen zu identifizieren, indem Sie zunächst 95 Mikroliter Ruby-Shroom SD2-Fusion mit fünf Mikrolitern 0,025 Subtilisin A inkubieren. Proben Sie die Reaktion zu Zeitpunkten von null, 0,5, zwei, fünf, 15, 60 und 120 Minuten, entfernen Sie 10 Mikroliter aus der Reaktion für jeden Zeitpunkt und visualisieren Sie den Fortschritt der Reaktion über SDS-PAGE mit einem 15%igen Acrylamidgel. Färben Sie das Gel mit Coomassie blue, um zu bewerten, ob eine Protease-resistente Spezies identifiziert werden kann. Integrieren Sie die Daten aus der Aufreinigungseffizienz, dem Verhalten in nativer PAGE und der begrenzten Proteolyse an den teilweise gereinigten mRuby2-Shroom-Fusionsproteinen in eine umfassende Bewertung des Gesamtverhaltens dieser Proteine in Lösung.

Führen Sie großflächige Expressionen mit zwei Literkulturen von mRuby2-Shroom SD2 durch, mit dem Ziel, fünf bis 20 Milligramm vollständig gereinigte Probe zu erhalten. Nach dem Zellwachstum werden die Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 G für 10 Minuten pelletiert. Das resultierende Zellpellet kann bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Als nächstes wird das Pellet in etwa acht Millilitern Lysepuffer pro Gramm gefrorenem Zellpellet resuspendiert. Lysieren Sie die resuspendierten Zellen mit einem Homogenisator. Nach der Zelllyse pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 30.000 G für 30 Minuten.

Als nächstes binden Sie die lösliche Fraktion mit 10 Millilitern vorgewaschenem Nickel-NTA-Harz. Gießen Sie die Bead-Suspension in eine geeignete Schwerkraftsäule und lassen Sie die ungebundenen Proteine abfließen, waschen Sie das Harz dann drei- bis fünfmal mit 40 Millilitern Lysepuffer, gefolgt von einer Wäsche mit Lysepuffer, der mit einem molaren Natriumchlorid ergänzt wird. Führen Sie eine abschließende Wäsche des Harzes mit 40 Millilitern Lysepuffer durch, der mit 80 Millimolar Imidazol ergänzt wird.

Eluieren Sie das Ruby-Pilz-Fusionsprotein mit 40 Millilitern Lysepuffer, der ein molares Imidazol enthält. Fraktionieren Sie das eluierte Protein manuell in vier bis 10 Milliliter-Fraktionen. Bestätigen Sie Fraktionen, die Ruby-Shroom-Fusionsprotein enthalten, mit einem 10%igen SDS-PAGE-Gel.

Fügen Sie jeweils 25 bis 50 Milligramm Fusionsprotein ein Milligramm TEV-Protease hinzu, um das Ruby-Tag zu entfernen. Als nächstes dialysieren Sie die entsprechenden Fraktionen in TEV-Spaltpuffer mit einem Dialyseschlauch mit einem Molekulargewicht von sechs bis acht Kilodalton. Dialysieren Sie das Protein über Nacht bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren.

Wiederholen Sie nach der Dialyse die Reinigungsschritte der Nickelaffinität. Die Pilz-SD2-Domäne sollte in die ungebundene Fraktion fließen, während der Ruby-Tag an das Harz gebunden bleibt. Konzentrieren Sie die Peakfraktionen mit einem Spinkonzentrator auf etwa 10 Milligramm pro Milliliter und führen Sie dann eine Größenausschlusschromatographie durch, bei der die Peakfraktionen mit einem 12%igen SDS-PAGE-Gel analysiert werden.

Nach dem Poolen der Peakfraktionen dialysieren Sie die Lösung in einen Kristallisationspuffer und konzentrieren das dialysierte Protein vor der Kristallisation auf 10 Milligramm pro Milliliter. Screenen Sie ein kleines Array von 12 Bedingungen, um eine optimale Proteinkonzentration für Kristallisationsversuche mit 24 gut sitzenden Tropfkristallisationsschalen zu identifizieren. Führen Sie Kristallisationsversuche mit der Dampfdiffusionsmethode durch.

Pipettieren Sie zunächst 500 Mikroliter jeder der 12 Bedingungen in separate Vertiefungen. Machen Sie auf jedem Sockel Tropfen, die einen Mikroliter Well-Lösung und einen Mikroliter Proteinprobe enthalten. Verschließen Sie das Tablett schnell mit durchsichtigem Klebeband und bringen Sie das Tablett dann in eine geeignete temperaturkontrollierte Umgebung, die vibrationsfrei ist.

Untersuchen Sie die Tropfen in den Schalen in den nächsten drei Tagen mit einem Mikroskop bei bis zu 100-facher Vergrößerung. Am Ende des Zeitraums von drei Tagen bewerten Sie jeden Tropfen als niederschlagsfrei, leicht, starkniederschlags- oder kristallfrei. Eine geeignete Proteinkonzentration sollte nicht mehr als sechs schwere Ausfällungen enthalten.

Unter Verwendung der ermittelten Proteinkonzentration wird eine breite Palette von kommerziell erhältlichen Kristallisationssieben gescreent. Der Einsatz eines Liquid-Handling- oder Kristallisationsroboters beschleunigt diesen Prozess erheblich und minimiert gleichzeitig Fehler in den Tropfen. Es wird viel weniger Protein benötigt, so dass der Benutzer mit einer einzigen Probe mehr Erkrankungen untersuchen kann.

Verbessern Sie die Anfangsbedingungen, die von breiten Bildschirmen identifiziert wurden, indem Sie wie bisher systematisch jede der Variablen innerhalb des Kristallisationstropfens mit 24-Well-Screen-Trays variieren. Die eingeschränkte Proteolyse wird verwendet, um Regionen des Proteins zu identifizieren, die flexibel oder anderweitig leichter für die Protease zugänglich sein könnten. Hier ist ein Degradationsmuster für eine SD2-Domäne dargestellt, die proteolytisch empfindlich ist, und eine andere, die recht stabil ist.

Eine begrenzte Proteolyse wurde im Rahmen der Ruby-Fusionsproteine durchgeführt. In diesem Fall wurde die Linkersequenz zwischen Ruby und der SD2-Domäne erwartungsgemäß schnell gespalten, aber die resultierenden Ruby- und SD2-Fragmente blieben weitgehend stabil. Die Analyse durch natives PAGE kann schnell gute Kandidaten für die Kristallisation aufdecken.

Vier Shroom-Rock-Komplexe mit unterschiedlichen Proteinbatterien wurden auf nativen PAGE-Gelen laufen lassen. Der Komplex, der die Gesteine 834 bis 913 enthielt, zeigte das beste Verhalten und kristallisierte leicht, während die anderen erst beim Abbau kristallisierten oder nicht vollständig kristallisierten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Satz potenzieller Domänengrenzen für Ihr großes Coiled-Coil-Protein entwickeln und wie Sie das Ruby-System verwenden können, um schnell und schnell die besten Kandidaten für die Kristallisation zu identifizieren.

Während die Kristallographie nach wie vor ein zeitaufwändiges Unterfangen ist, konzentriert sich die Verwendung dieser Technik auf die Suche nach Proteinen, die mit einfachen Assays kristallisieren, um schlechte Kandidaten zu entfernen, sodass Sie mehr Zeit mit den Kandidaten mit besseren Erfolgsaussichten verbringen können. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, so viele Informationen wie möglich einzubeziehen, wenn Sie Ihre möglichen Domänengrenzen auswählen. Die Informationen, die Sie bei der Anwendung dieses Verfahrens auswählen, variieren für jedes Protein.

Wenn möglich, sollten andere Methoden, wie zellbasierte oder biochemische Assays, durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die betreffenden Proteinfragmente immer noch die Funktion von biologischem Interesse aufweisen. Obwohl sich diese Methode auf Coiled-Coil-Proteine konzentriert, könnte das Gesamtgerüst leicht für fast jedes Protein angepasst werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bestimmten Instrumenten und biologischen Reagenzien gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen oder das Tragen einer Schutzbrille, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer befolgt werden sollten.