Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe von Designer-Schwanznukleasen oder Krallen schnell gendefiziente Mäuse zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst DNA-Konstrukte entworfen und assembliert werden, die für spezifische Talonpaare kodieren, die als Vorlagen für die In-vitro-Transkription zur Erzeugung von Talon-mRNAs dienen. Die nächsten Schritte des Verfahrens bestehen darin, befruchtete Mauszyten zu isolieren und ihnen dann das T zu mikroinjizieren.Der letzte Schritt besteht darin, die injizierten Zyten chirurgisch in die pseudoschwangeren Pflegemütter zu übertragen.

Die resultierenden F-Null-Nachkommen zeigen häufig ortsspezifische Deletionen genomischer Sequenzen, die häufig zum Verlust der Funktion des Zielgens führen. Obwohl die hier vorgestellte Methode Aufschluss über die Genfunktion bei Mäusen geben kann, kann der grundlegende Ansatz auch auf andere Modellorganismen wie Ratten und Fische übertragen werden. Rufen Sie zunächst die Website des TAL-Effektor-Nukleotid-Targeters auf der Website auf.

Wählen Sie das TN-Targeter-Programm aus und fügen Sie die Sequenz des Zielgens ein. Für dieses Protokoll. Verwenden Sie die P-C-A-G-T sieben TALEN-Expressionskonstrukte und das Golden Gate Talen und T Effektor-Kit, die auf ad gene verfügbar sind.

Wenn andere Konstrukte oder Baugruppensätze für Talen-Baugruppen verwendet werden, können die Einstellungen für die optimale Abstandshalterlänge und die Anzahl der Heck-RVs unterschiedlich sein, wählen Sie die Option Miller Etal 2011 unter der Einstellung "Voreingestellte Architektur verwenden". Wählen Sie dann NN auf der Registerkarte G-Ersatz aus. Das Programm generiert eine Textdatei mit potentiellen Zielseiten, die aus dieser Liste generiert werden.

Wählen Sie das oder die gewünschten Talen-Paare aus und fahren Sie mit der Golden Gate-Montage fort. Dieses Protokoll funktioniert mit den am häufigsten verwendeten Labormausstämmen, einschließlich C 57 BL sechs J und BDF mit einem Superovulat von 10 Spenderinnen im Alter von vier Wochen unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von fünf Einheiten trächtiger Stutenserumgonadotropin. 48 Stunden später geben die Weibchen fünf Einheiten humanes Choriongonadotropin ebenfalls durch intraperitoneale Injektion unmittelbar nach der Injektion des humanen Choriongonadotropin-Paares, die Weibchen eins zu eins mit Männchen im gebärfähigen Alter am selben Tag, bereiten die pseudoschwangeren Pflegemütter vor. Andere.

Am nächsten Morgen opfern Sie die Weibchen und gewinnen die befruchteten Eizellen, indem Sie die Eizellen aussezieren. Dann werden die Eizellklammern in eine Organkulturschale gegeben, die einen Milliliter M zwei Medium enthält. Entfernen Sie alle Kumuluszellen, indem Sie 10 Mikroliter 0,1%ige bovine Hyaluronidase-Lösung in eine Schale geben, die Cytengelege in M zwei Medium enthält.

Dann verwenden Sie die Mundpipette, um die Embryonen durch zwei oder drei Wechsel des M zwei Mediums zu waschen, um die Hyaluronidase zu entfernen. Setzen Sie die Hyaluronidase-Behandlung für Embryonen fort, die sich noch nicht von Kumuluszellen dissoziiert haben. Die isolierten Embryonen können in M 16, Medium bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gelagert werden, bis sie mikroinjiziert werden.

Bereiten Sie 100 Mikroliter Injektionslösung vor, die 10 Nanogramm pro Mikroliter jedes Schwanzes enthält. Nuklease, mRNA, paaren und 30 Minuten bei 30.000 g zentrifugieren, um zu pelletieren. Alle Partikel, die die Injektionsnadeln verstopfen könnten.

Dann die Mischung auf Eis legen. Planen Sie, die Eizellen im pronukleären Stadium am frühen Nachmittag zu injizieren. Tauchen Sie etwa 100 Embryonen in M zwei Medium unter eine Schicht Mineralöl und arbeiten Sie an einem inversen Mikroskop ohne sumpfige DIC-Optik.

Unter 20-facher Vergrößerung werden Zyten mit unterschiedlichen Vorkernen selektiert. Die Sortierung der Eizellen kann mit einer leeren Injektionskapillarladung erfolgen, die Injektionskapillare kurz vor der Verwendung mit ein bis zwei Mikrolitern der Injektionslösung. Befestigen Sie es dann am Mikroinjektionskopf.

Aspirieren Sie dann einen ausgewählten Zyten mit einer Haltekapillare und injizieren Sie die Nuklease-mRNA flach in das Zytoplasma. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Vorkernen. Das Injektionsvolumen sollte gering gehalten werden.

Beim ersten Anzeichen einer zytoplasmatischen Dehnung ziehen Sie die Nadel zurück. Normalerweise sollten etwa 80 bis 90% der Embryonen ohne unmittelbare Überleben überleben. Um die Menge der injizierten mRNA zu erhöhen, wird die Lösung nach der Mikroinjektion der verfügbaren Zyten konzentrierter.

Mit einer Mundpipette in M 16-Medien überführen. Inkubieren Sie die Embryonen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Dann bringe die, die überleben, in pseudoschwangere Pflegemütter

Am Tag vor der Mikroinjektion führt dies bei drei bis sechs Monate alten weiblichen Zöliakiemäusen zu einer Scheinschwangerschaft, indem sie mit VAs sektorisierten Männchen verpaart werden. Am nächsten Morgen wählen Sie Weibchen mit einem durchsichtigen Stopfen aus, um sie als Embryoempfängerinnen zu verwenden. Unbenutzte Weibchen kehren nach drei Wochen aus ihrem Pseudo-Trächtigkeitszustand zurück und können danach wiederverwendet werden.

Positionieren Sie eine betäubte Pflegemutter auf einer warmen Unterlage auf ihrem Bauch. Desinfizieren Sie dann den Bereich des Schnitts, indem Sie ihn mit 70% Ethanol besprühen. Kämmen Sie das nasse Haar von der geplanten Schnittstelle weg.

Schneiden Sie nun die Bauchhöhle mit einer Schere auf und externalisieren Sie das Gebärmutterhorn. Um dies zu tun. Ziehen Sie an dem am Eierstock befestigten Fettpolster und fixieren Sie die Fortpflanzungsorgane mit einer Bulldoggenklemme.

Achten Sie auch darauf, die Organe mit erwärmter 0,9%iger Natriumchloridlösung feucht zu halten. Sortieren Sie zu diesem Zeitpunkt 12 bis 20 lebensfähige Embryonen und laden Sie sie in eine dünne Glaskapillare. Mit der Mundpipette wird zunächst eine kleine Luftblase abgesaugt und dann mit einer feinen Pinzette abgesaugt.

Fassen Sie den UCT vorsichtig vor dem Verstärker an und bohren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel ein kleines Loch in die UCT-Wand. Führen Sie die geladene Kapillare in das Loch ein und blasen Sie die Embryonen vorsichtig in den Verstärker, bis Sie sehen, dass die Luftblase aus der Kapillare verdrängt wurde. Entfernen Sie dann die Kapillare.

Setzen Sie die Fortpflanzungsorgane sofort wieder in die Körperhöhle ein und verschließen Sie die Bauchhöhle mit einer einzigen Naht. Als nächstes verschließen Sie die Haut mit ein oder zwei neun Millimeter langen Wundclips. Bringen Sie das Tier in seinen Heimatkäfig zurück und beaufsichtigen Sie es, bis die Narkose nachlässt.

Halten Sie dann die Weibchen in stabilen sozialen Gruppen von zwei bis drei Mäusen, um den Stress in den ersten drei postoperativen Tagen zu minimieren, und stellen Sie sicher, dass Sie für jede Heuschrecke im Mausgenom, die mit Designer-Nukleasen angegriffen wird, ein Analgetikum wie DEF Falcon im Trinkwasser bereitstellen. Ein PCR-basierter Assay dient der Identifizierung von Gründertieren, die ein gewünschtes mutiertes Allel tragen. Im ersten Beispiel entstanden Gründer aus der Mikroinjektion eines Schwanznukleasepaares.

Targeting-Angriffe auf die Beschichtungsregion des Prionenprotein-Gens der Maus wurden durch T 7-Endonuklease-Verdau eines PCR-Produkts analysiert. Der T seven Endonuklease-Verdau-Assay beruht auf der Bildung von Hetero-Duplexen zwischen DNA-Strängen von PCR-Produkten, die aus mutierten und Wildtyp-Allelen erzeugt wurden. Die Talon-induzierte Mutagenese innerhalb der genomischen Zielregion von Einzelgründern wurde durch das Auftreten von 250 und 110 basenpaarigen Langverdauungsprodukten zusätzlich zum PCR-Produkt in voller Länge aufgedeckt.

Alternativ können PCR-Produkte einem Restriktionsverdau unterzogen werden, wenn sich eine geeignete diagnostische Restriktionsstelle innerhalb der Spacerregion des Designer-Nukleasepaares befindet. Im zweiten Beispiel zielt ZFN auf eine XPO-Ein-Restriktionsstelle ab, die sich innerhalb des Intros befindet, eine der Rosa 26-Locus der Maus. Hier deuten unverdaute Banden auf das Vorhandensein von Mutationen hin.

Die Sternchen markieren, das Fehlen von verdauten Produkten, was stark darauf hindeutet, dass ein Gründer Mutationen in beiden Allelen des Zielgens trägt. Die Klonierung und Sequenzierung dieser unverdauten PCR-Produkte zeigt, dass Gründermäuse zwei oder mehr unterschiedliche Modifikationen des Zielallels aufweisen können. Das Fehlen von Wildtyp-Sequenzen deutet auf eine vollständige Ablation des Zielgens hin.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für das Design der Schwanznuklease, den Aufbau des Schwanzes und die Nukleasekonstrukte haben und wissen, wie Sie diese zur Erzeugung mutierter Mäuse durch direkte Osid-Mikroinjektion verwenden können. Diese Methode kann angepasst werden, um mit anderen Klassen von Designer-Nukleasen wie Zink, Fingernukleis oder CAS neun crispr zu arbeiten. Es kann auch die Genommodifikation durch homologe Rekombination durch gleichzeitige Co-Injektion der Nuklease und des entsprechenden Gen-Targeting-Templates erleichtern.