Name: Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung gendefizienter Mäuse mit TALENs durch Mikroinjektion in befruchtete Oozyten und Transfer zu Pflegemüttern. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Modifikationen für Funktionsanalysen.

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Wir möchten Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, und Ewa Skoczylas für hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Studie wurde vom SNF Sinergia Zuschuss CRSI33-125073 PP finanziert.

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</ol>

Die Autoren erklären, keine Interessenskonflikte.

Designer Nuklease-driven Genom Bearbeitung Ansätze haben das Spektrum der Arten zugänglich gezielte Modifikationen der jeweiligen Genome 10,12 deutlich erweitert. Bei Mäusen, Gen-Targeting in ES-Zellen hat eine Standard-Technik seit über zwei Jahrzehnten; jedoch ist es schwierig, an ES-Zellen von anderen Spezies als der Maus anpassen bewährt, obwohl es gab einige jüngsten Erfolg in ES-Zellen der Ratte. Auch mit der Verfügbarkeit von &quot;off-the-shelf&quot;-Gen-Targeting Maus-ES-Zellklone von Konsortien wie EUCOMM, KOMP oder NorCOMM 3 Genom Bearbeitung von ZFN TALEN und bietet eine höhere Präzision und Flexibilität in Bezug auf das Spektrum der Veränderungen, die sein können, sofern in das Mausgenom eingeführt. Gründer Tiere, die Nuclease-vermittelten Mutationen scheinen sehr Keimbahn zuständigen 4-6,20,21, was nicht immer der Fall bei Chimären aus Blastozysteninjektion von ES-Zellen Ursprung sein. Somit wird in bestimmten Fällen die Mikroinjektion designer Nukleasen kann deutlich schneller Generation von neuen Mauslinien mit gezielten Genom-Modifikationen führen. Die erfolgreiche Generierung von Knockout-Mäusen durch Injektion von ZFN und TALEN hängt zu einem großen Teil auf die Aktivität des injizierten Nuklease-Paar. TALENS wurde gezeigt, dass eine hohe Erfolgsrate bei der Ausrichtung einer Vielzahl von Genen in verschiedenen Organismen; Jedoch weisen neuere Studien, dass TALEN Bindung empfindlich Cytosin-Methylierung 30,31. Somit neu erzeugten Nuklease Paare, beispielsweise TALENS kloniert in pCAG T7-Vektoren, können vorübergehend in eine Maus-Zelllinie, wie NIH-3T3-oder Neuro transfizierenden -2a, die die Chromatinstruktur Zustand des Mausembryo zu einem gewissen Grad zu imitieren. Hier können Nuklease-Aktivität unter Verwendung des T7-Endonuklease-Assay oder einen Restriktionsverdau von PCR-Produkt, wie in Abschnitt 5 vor der mRNA-Synthese und die Mikroinjektion beschrieben geschätzt werden. Wir empfehlen Sequenzierung der genomischen Region von Interesse in der Hinsicht,ive Zelllinie und die Maus-Stamm für die Mikroinjektion Experimente verwendet. In Maus-Zygoten werden verschiedene TALEN oder ZFN Paare optimal auf verschiedenen mRNA-Konzentrationen zu arbeiten und damit die optimale Arbeitskonzentration der Mikroinjektion Nuklease mRNA kann müssen experimentell ermittelt werden. Abhängig von der Nuklease Paar wird eine zu niedrige Konzentration in keiner Spaltung führen, während eine zu hohe Letalität in Embryo führen. Abhängig von der Nuklease Paar haben wir Erfolg mit Gesamt-mRNA-Konzentrationen so niedrig wie 2 ng / ul und so hoch wie 200 ug / ul. Diese Effekte sind nur schwer von Versuchen in der Zellkultur und die Nuklease eine optimale Konzentration für sowohl Embryoüberlebensrate und Veränderung des Zielorts muß empirisch bestimmt werden, vorherzusagen. Hochaktive ZFN oder TALEN können ihre Zielsequenz über die Ein-Zell-Stadium des Embryos mikroinjizierten spalten und damit zu komplexen Mustern der Mutagenese eind Mosaik in Gründer. Wir und andere 4 haben drei oder mehr verschiedene mutierte Allele in einer einzigen Gründer (5C) beobachtet. Wenn also zur Schaffung einer neuen Mauslinie aus diesen Gründern, Nachwuchs sollte sorgfältig durch Sequenzierung auf die Anwesenheit des günstigen Mutation, da die Verdauung Tests belegen, dass nur eine undefinierte Mutation vorhanden ist abgeschirmt werden. Einer der Kritik häufig geäußerte gegen die ZFN und TALEN Systemen ist die Möglichkeit, dass diese Nukleasen sind auch zur Spaltung irgendwo anders im Genom vorhanden, die ähnlich zu den Zielstellen-Sequenzen sind. Solche Off-Target-Effekte wurden mit frühen Generation Reagenzien mit dem homodimeres Fokl Domäne beobachtet und Heterodimer Konstrukte wurden entwickelt, um Off-Target-Effekte 25 zu lindern. Potential off-Zielstellen in einem gewissen Ausmaß in silico vorhergesagten 32,33 und durch PCR und Sequenzierung gescreent werden. Ein offensichtlicher Vorteil of mit ZFNs Talens und zur Erzeugung von Mäusen und nicht-Zelllinien ist die Möglichkeit der Entfernung vom Ziel Mutationen nicht verknüpfte, um die gewünschten Änderungen durch Genom Durchführung mehrerer Rückkreuzungen zu einem Wildtyp-Stamm der Wahl. Für die Analyse einer großen Anzahl von Gründermäuse nächsten Generation tiefen Sequenzierung von PCR-Produkten aus der Nuklease geplanten Ortskurve erzeugt und in silico vorhergesagten Off-Target-Loci könnte eine alternative qualitative und quantitative Anzeige für die Verdauung des PCR-Assays Produkte. Die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken der assistierten Reproduktion sind für Standard-Mausstämme für die Mikroinjektion Experimente wie C57Bl/6J oder B6D2F1 verwendet optimiert. Mäuse unterschiedlicher Herkunft, wie outbred Stämme, kann im Prinzip für die Genom Bearbeitung Ansätze verwendet werden und vielleicht einen besser geeigneten genetischen Hintergrund für bestimmte Forschungsfragen bieten. Die Leistung der assistierten Reproduktionstechniken wie Superovulation kann Prädikat seinfür eine Reihe von Stämmen 34-36 cted könnte aber eine weitere Optimierung für Nicht-Standard-Stämme erfordern, um eine ausreichende Anzahl von Embryonen für die Nuklease Mikroinjektion erhalten. Neben ZFN und TALEN haben neue Designer-Nukleasen wie die RNA-guided CRISPR/Cas9 System 9,37,38 jetzt für Genom-Editing-Anwendungen eingeführt. Alle Verfahren für die Mikroinjektion und Analyse der hier beschriebenen Gründertiere sind auch auf CRISPR/Cas9 und zukünftige Arten der Genom-Bearbeitung.

Mäuse sind mit Abstand die beliebteste Plattform zur Erzeugung transgener Tiermodelle. Die vielseitige Werkzeugkasten für die Gentechnik von Mausembryo 1-3 wurde kürzlich von Genom Bearbeitung Ansätzen für Designer Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFN) verlängert 4-6, Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (TALEN) 7,8, und die Cluster regelmäßig beabstandet kurze Palindrom-Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierten (Cas) 9 System 9. ZFN und TALEN Funktion als Paare von zwei maßgeschneiderten Protein-basierten DNA-bindende Domänen (Arrays von Zinkfinger-Proteine ​​und wiederholen Variablen di-Rückstände (RVDS), respectively), die jeweils mit der FokI Endonuklease 10-12 gekoppelt sind. Umgekehrt wird die Spezifität der Cas9-vermittelten DNA-Spaltung durch zu trans CRISPR RNAs (crRNA und tracrRNA, die auch in einem einzigen chimären RNA-Molekül bezeichnet Führungs RNA kombiniert werden können) zur Verfügung gestellt, die 11 in einem Komplex mit dem GesetzCRISPR Protein. TALENS mit einer definierten Sequenz des RVDS schnell einzelner Experimentatoren mit einer Vielzahl von Strategien zur Montage 13-17 wählen konstruiert werden. CRISPR/Cas9 verspricht noch weniger arbeitsintensiv Generation von Designer-Nukleasen, aber die Spezifität von Führungs RNA-DNA-Bindung ist immer noch nicht vollständig gelöst 18,19. Erstellung von benutzerdefinierten ZFNs bisher an spezialisierte akademische Labors und kommerzielle Anbieter wie Sangamo Biosciences und Sigma CompoZr Dienst beschränkt. In der Regel soll Genom Bearbeitung mit Designer-Nukleasen auf die Einführung Doppelstrangbrüche (DSB) an definierten genomischen Loci, die anschließend zu gewinnen nicht-homologe Ende (NHEJ) oder homologe Rekombination (HR) DNA-Reparatur-Maschinen 10,12. NHEJ-vermittelte Reparatur eines DSB oft zur Einführung von Insertionen und Deletionen in der Nähe der Stelle der Reparatur. So NHEJ Reparatur czum Ausschlagen der Funktion eines Zielgens durch die Einführung einer Rahmenverschiebungsmutation in der Gene-Protein-kodierende Sequenz ein 4,7,9 ausgenutzt werden. Alternativ kann definiert Hinzufügen oder Austauschen von genetischer Information durch die Bereitstellung einer DNA-Donor zusammen mit den Designer Nukleasen erreicht werden. Ein DNA-Donor umfasst Forschern entwickelt DNA-Sequenzen, die durch Bereiche der Homologie mit dem Ziel-Locus flankiert, so als Vorlage für DSB-Reparatur dien von HR. Beide Plasmide 5,6,20 und einzelsträngige Oligonukleotide 8,9,21 wurden erfolgreich als Donoren verwendet. Weder NHEJ-oder HR-vermittelte Genom Bearbeitung erfordern die Einführung eines selektierbaren Markers in das Genom der Maus-Embryo, der diese Strategien besonders gut für die Erstellung von kleinen Veränderungen in der Nukleotidsequenz, ohne die Gesamtarchitektur genetische Störung geeignet macht. In diesem Protokoll beschreiben wir alle wesentlichen Verfahren für die Genom-Bearbeitung in derMaus-Embryo mit Talens. Dazu gehören 1) Identifizierung eines TALEN Zielstelle 22, 2) Bau von Talens von golden gate Klonen 13, 3) in vitro Synthese von mRNA TALEN, 4), die Mikroinjektion von mRNA TALEN in befruchtete Eizellen der Maus, 5) chirurgische Verfahren zur Embryo-Transfer und 6) Analyse der TALEN-induzierten Mutagenese in Gründertiere. Wir konzentrieren uns auf TALEN mRNA-Mikroinjektion und Screening von Gründern für NHEJ-induzierte Insertionen / Deletionen. Zu diesem Zweck haben wir bifunktionellen TALEN Konstrukte, die sowohl die Expression in Säugerzellen, wenn sie als Plasmide und in vitro Synthese von mRNA TALEN für die Mikroinjektion in transfizierten Mäuse-Embryonen ermöglichen erzeugt. Diese Konstrukte umfassen einen Kegel GESCHICHTE Rückgrat 23 bis heterodimeren FokI-Domänen fusioniert 24,25 optimale Genom Bearbeitung in Säugerzellen. Dieses Protokoll kann auch für die Mikroinjektion von anderen Designer-Nukleasen oder zur kombinierten Injektionen von Designer-Nukleasen angenommen werdenund Geber Konstrukte (Design von DNA-Geber ist in der ausgezeichneten technischen Publikationen von Wefers et al. 26,27) beschrieben worden. Ethische Erklärung Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Bestimmungen der kantonalen Veterinäramt des Kantons Zürich durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S oder L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S oder L</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Plasmidsichere Nuklease</td><td>Epizentrum</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Spin Säulen</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde Load Dye</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA Millennium Marker</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE Puffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonuklease</td><td>NEB</td><td>M0302S oder L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Fleck</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>trächtige Stute&#039; s Serumgonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>humanes Choriongonadotropin (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 Embryokulturmedium</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 Embryokulturmedium</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl, embryogetestet</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Ausrüstung/Werkzeuge</strong</td></tr><tr><td>>Inverses Mikroskop mit Nomarski DIC-Optik (z.B. Nikon Eclipse TE200)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator-Einheiten (z.B. Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryo mit Kapillaren</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren für die Embryoneninjektion</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarabzieher (z. B. Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (z. B. Narishige MF-900)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton Hautschere</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Sonde</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>Reflex-Wund-Clip-System (9 mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Reflex-Wund-Clips (9 mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Feinzange 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria gebogene Pinzette</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Moria Feinzange</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>Dietrich Bulldog Klemme</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>Jackson Labs</td><td>Stammcode 000664</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 Mäuse</td><td>Charles River</td><td>Stamm Code 000664</td><td></td></tr></tbody></table>

maus-genom-engineering mit designer nukleasen

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgene Mäuse, die ortsspezifische Genom-Modifikationen (KO, Knock-in) sind von entscheidender Bedeutung für die Zerlegung komplexer biologischer Systeme als auch für die Modellierung menschlichen Krankheiten und Therapiestrategien testen. Jüngste Fortschritte in der Verwendung von Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs), Transkriptions-Aktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) und den Cluster regelmäßig beabstandet kurze Palindrom-Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierten (Cas) 9-System für Website- spezifische Genomtechnik die Möglichkeit offen, um eine schnelle gezielte Modifikation Genom in praktisch allen Labortieren durchführen, ohne die Notwendigkeit, an embryonalen Stammzellen (ES)-Technologie verlassen. Ein Genom Bearbeitung Experiment beginnt in der Regel mit der Identifizierung von Designer-Nuklease Zielorten innerhalb eines Gens von Interesse, gefolgt von Bau von kundenspezifischen DNA-bindenden Domänen Nuklease-Aktivität direkt an die Ermittler definierten genomischen Locus. Designer Nuklease Plasmide sind in vitro &lt;/ Em&gt; transkribiert, um mRNA für die Mikroinjektion von befruchteten Eizellen der Maus zu erzeugen. Hier bieten wir ein Protokoll für das zielgerichtete Modifikation Genom durch direkte Injektion TALEN mRNA in befruchtete Eizellen der Maus.

Wir konstruierten Ziel Plasmide mit dem Goldenen GateTALEN Anordnung nach Cermak et al. 13, der die Expression in Säugetierzellen TALENS als auch in vitro-mRNA-Synthese aus dem T7-Phagen-Promotor (Fig. 1C) zu ermöglichen veröffentlicht kompatibel. Diese Plasmide tragen heterodimeren Fokl Domains (ELD oder KKR Mutationen), die gezeigt haben, um Off-Target-Effekte in Bezug auf Fokl Homodimere zu reduzieren und die Spaltungsaktivität verbessern im Vergleich zu der ersten Generation Fokl Heterodimere 25,29. Golden Gate Anordnung Reaktionen Nr. 1 und Nr. 2 sind in der Regel sehr effizient, und jedes weiße Kolonie, wenn durch Kolonie-PCR analysiert, zeigt das erwartete Muster für die bestimmte Anzahl von RVDS kloniert (Fig. 1B und 1D). Gel-Analyse der in vitro synthetisierten mRNA (Abbildung 2) sollte eine einzelne unterscheidbar Band mit wenig oder ohne Abstrich für jede Probe analysiert offenbaren. Es sollte eine klare Größe Verschiebung zwischen Proben und L1/R1 L2/R2, L3/R3, die erfolgreiche Polyadenylierung zeigt sein. Gründer-Tiere können beispiels NHEJ-induzierten mutierten Allele Genotypisierung mit PCR, gefolgt von entweder T7 Endonuklease-Verdauung (Fig. 3) oder einen Restriktionsverdau unter Verwendung eines Enzyms untersucht werden, dass spaltet die Wildtyp-Sequenz in der Spacer-Region der Nuklease Paar (Abbildung 4). Die T7-Endonuklease Assay ist auf jede Art von Mutation unabhängig von der speziellen genomische Sequenz innerhalb der Spacer-Region der Nuklease Paar injiziert wird; jedoch erkennt nur Fehlanpassungen zwischen DNA-Strängen in Heteroduplex-PCR-Produkte. So wird in dem seltenen Fall, dass einer der Gründer trägt zwei identisch mutierten Allele, PCR-Produkte würden keine T7 Verdauungsmuster zeigen. Solche Unterscheidung ist jedoch immer möglich, wenn eine spezifische Restriktionsstelle innerhalb der Nuklease Spacerregion, die von NHEJ eliminiert werden entferntInduzierten Insertionen / Deletionen (Abbildung 5). Hier unverdaute Banden weisen auf das Vorhandensein von Mutationen und das Fehlen von Abbauprodukte stark darauf eine gegründet, die Mutationen in beiden Allelen des Zielgens (mit Sternchen in Fig. 4b dargestellt). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Fig. 1 ist. Golden Gate Klonen von TALEN RVDS in heterodimeren pCAG-T7-Destination-Vektoren. A) Versammlung der RVD Arrays in PFUS Vektoren. Hier ein Beispiel für ein Paar mit individuellen TALEN TALE-Arrays mit 15 und 17 RVDS RVDS jeweils dargestellt (für TALE Arrays länger als 21 RVDS werden drei PFUS-RVDS Baugruppen erforderlich ist, nicht gezeigt). Die Pfeile zeigen die Primer für PFUS spezifischen Kolonie-PCR-Reaktionen. B) PCR-Produktevon der richtigen PFUS Baugruppen verstärkt zeigen typischerweise eine Band, die der Gesamtlänge aller RVDS kloniert (zB rund 1,1 kb für 10 RVDS) und eine &quot;Leiter&quot; der kleineren, weniger prominenten Bands aufgrund der repetitiven Natur der RVD-Arrays. C) Endmontage von PFUS-RVD-Arrays und einem Plasmid, das die letzte Wiederholung (PLR) in heterodimeren TALEN Expressionsvektoren mit FokIELD und FokIKKR Varianten auf. Die TALEN Rückgrat (wie N-und C-kommentierten) ähnelt dem von Miller et al. 23 veröffentlicht Architektur Die CAG (frühen CMV-Enhancer-Element / Huhn-beta-Aktin)-Promotor für hohe Expressionsniveaus in transfizierten Säugerzellen, während der T7-Phagen-Promotor kann in vitro-mRNA-Synthese (Verwendung SacI für die Linearisierung des Vektors stromabwärts von der Nuklease STOP-Codon). D) Kolonie-PCR unter Verwendung von Primern durch Pfeile in C angegeben) ermöglicht die Identifizierung korrekt montiert TALENS. Voll length PCR-Produkte sind oft weniger prominent, während die &quot;Leitereffekt&quot; stellt eine robuste Indikator für die erfolgreiche Montage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> 2. . Qualitätskontrolle von Nuklease-mRNA in vitro-Synthese unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese ZFN mRNAs werden als Beispiel gezeigt (L, linke ZFN, R rechten ZFN). Proben L1/R1 mRNA vor Polyadenylierung zeigen, Proben L2/R2 Show polyadenyliert mRNA und L3/R3 zeigen gereinigte polyadenylierten mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img<html> alt = &quot;3&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; 3. Beispiel für einen T7-Endonuklease-Assay zur Identifizierung von Gründertieren Durchführung Nuklease-induzierten Mutationen des Ziel-Locus verwendet werden. A) Eine TALEN Paar wurde entwickelt, um innerhalb der kodierenden Region des Maus-Prionprotein-Gen (Prnp spalten kann TALEN Zielsequenz auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden). Ein PCR-Produkt wird mit einem Vorwärtsprimer (F) liegt 110 bp stromaufwärts und ein Rückwärts-Primer (R) 250 bp stromabwärts der Spaltstelle TALEN. B) Das PCR-Produkt wird anschließend Bildung ausgesetzt und T7-Endonuklease-Verdauung erzeugten Heteroduplex. C) TALEN-induzierte Mutagenese innerhalb der genomischen Region des Zieleinzel Gründer wird durch die Anwesenheit von einer Volllängen-PCR-Produkts mit Produkten des Verdaus von 250 und 110 bp ergab.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> 4. Beispiel für einen Restriktionsverdau zur Identifizierung der Tiere, die Gründer Nuklease-induzierte Mutationen des Zielorts. ZFN spezifisch für die Maus Rosa26 Locus 29 Ziel eine XbaI-Schnittstelle in Intron 1 verwendeten PCR-Produkte. A) Gründer wurden durch PCR Genotypisierung geschirmten ein Vorwärtsprimer (F) 500 bp stromaufwärts und ein Rückwärts-Primer (R) 250 bp stromabwärts der Spaltstelle. B) Verdau der PCR-Produkte mit XbaI Verdau zeigt Muster, die Mäuse, die mit bi-allelische Mutationen (markiert mit Sternchen), mono -Allel-Mutationen (verdaut und unverdaute Bands, z. B. Tier 2)und wt-Mäuse (vollständige Verdauung, zB Tier 21). C) Sequenzierung von Mäusen mit Potential bi-allelische Modifikationen zeigt bis zu 3 (Tier 24) verschiedene Insertionen / Deletionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Name der Primer </td><td> Sequenz 5 &#39;zu 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Sequenzen von Primern für die Kolonie PCR und Sequenzierung innerhalb der Golden Gate TALEN Montage verwendetProtokoll. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plasmid / Sammlung </td><td> Anbieter </td><td> Addgene ID </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN und TAL-Effektor Kit 2.0 </td><td> Voytas Labor </td><td> 1000000024 </td><td> Enthält alle Plasmide für die Golden Gate TALEN Montage notwendig </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD Zielvektoren </td><td> Pelczar Labor </td><td> 40131, 40132 </td><td> Add-on-Plasmide für TALEN Expression in Säugerzellen und in vitro-mRNA-Synthese </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Plasmide und Plasmid-Kollektionen für Golden Gate TALEN Montage erforderlich kann von Addgene (erhältlich <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OnlineRessource </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Design TALEN; TALEN Off-Target-Vorhersage </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Design TALEN, OPEN ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Design TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 Off-Target-Vorhersage </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Versammlung der TALEN Sequenzen für die Bestätigung der Sequenzierungsergebnisse </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Gestaltung von Baukasten ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Gestaltung von Baukasten ZFN </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Online-Ressourcen für die Gestaltung von ZFN, TALEN und CRISPR/Cas9. </sTrong&gt;

Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) kann verwendet werden, um das Genom der Maus Präimplantationsembryonen durch Auslösen sowohl die nicht-homologe Ende (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) Wege ändern. Diese Fortschritte ermöglichen die schnelle Generierung von Mäusen, die mit präzisen genetischen Veränderungen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe von Designer-Schwanznukleasen oder Krallen schnell gendefiziente Mäuse zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst DNA-Konstrukte entworfen und assembliert werden, die für spezifische Talonpaare kodieren, die als Vorlagen für die In-vitro-Transkription zur Erzeugung von Talon-mRNAs dienen. Die nächsten Schritte des Verfahrens bestehen darin, befruchtete Mauszyten zu isolieren und ihnen dann das T zu mikroinjizieren.Der letzte Schritt besteht darin, die injizierten Zyten chirurgisch in die pseudoschwangeren Pflegemütter zu übertragen.Die resultierenden F-Null-Nachkommen zeigen häufig ortsspezifische Deletionen genomischer Sequenzen, die häufig zum Verlust der Funktion des Zielgens führen. Obwohl die hier vorgestellte Methode Aufschluss über die Genfunktion bei Mäusen geben kann, kann der grundlegende Ansatz auch auf andere Modellorganismen wie Ratten und Fische übertragen werden. Rufen Sie zunächst die Website des TAL-Effektor-Nukleotid-Targeters auf der Website auf.Wählen Sie das TN-Targeter-Programm aus und fügen Sie die Sequenz des Zielgens ein. Für dieses Protokoll. Verwenden Sie die P-C-A-G-T sieben TALEN-Expressionskonstrukte und das Golden Gate Talen und T Effektor-Kit, die auf ad gene verfügbar sind.Wenn andere Konstrukte oder Baugruppensätze für Talen-Baugruppen verwendet werden, können die Einstellungen für die optimale Abstandshalterlänge und die Anzahl der Heck-RVs unterschiedlich sein, wählen Sie die Option Miller Etal 2011 unter der Einstellung "Voreingestellte Architektur verwenden". Wählen Sie dann NN auf der Registerkarte G-Ersatz aus. Das Programm generiert eine Textdatei mit potentiellen Zielseiten, die aus dieser Liste generiert werden.Wählen Sie das oder die gewünschten Talen-Paare aus und fahren Sie mit der Golden Gate-Montage fort. Dieses Protokoll funktioniert mit den am häufigsten verwendeten Labormausstämmen, einschließlich C 57 BL sechs J und BDF mit einem Superovulat von 10 Spenderinnen im Alter von vier Wochen unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von fünf Einheiten trächtiger Stutenserumgonadotropin. 48 Stunden später geben die Weibchen fünf Einheiten humanes Choriongonadotropin ebenfalls durch intraperitoneale Injektion unmittelbar nach der Injektion des humanen Choriongonadotropin-Paares, die Weibchen eins zu eins mit Männchen im gebärfähigen Alter am selben Tag, bereiten die pseudoschwangeren Pflegemütter vor. Andere.Am nächsten Morgen opfern Sie die Weibchen und gewinnen die befruchteten Eizellen, indem Sie die Eizellen aussezieren. Dann werden die Eizellklammern in eine Organkulturschale gegeben, die einen Milliliter M zwei Medium enthält. Entfernen Sie alle Kumuluszellen, indem Sie 10 Mikroliter 0,1%ige bovine Hyaluronidase-Lösung in eine Schale geben, die Cytengelege in M zwei Medium enthält.Dann verwenden Sie die Mundpipette, um die Embryonen durch zwei oder drei Wechsel des M zwei Mediums zu waschen, um die Hyaluronidase zu entfernen. Setzen Sie die Hyaluronidase-Behandlung für Embryonen fort, die sich noch nicht von Kumuluszellen dissoziiert haben. Die isolierten Embryonen können in M 16, Medium bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gelagert werden, bis sie mikroinjiziert werden.Bereiten Sie 100 Mikroliter Injektionslösung vor, die 10 Nanogramm pro Mikroliter jedes Schwanzes enthält. Nuklease, mRNA, paaren und 30 Minuten bei 30.000 g zentrifugieren, um zu pelletieren. Alle Partikel, die die Injektionsnadeln verstopfen könnten.Dann die Mischung auf Eis legen. Planen Sie, die Eizellen im pronukleären Stadium am frühen Nachmittag zu injizieren. Tauchen Sie etwa 100 Embryonen in M zwei Medium unter eine Schicht Mineralöl und arbeiten Sie an einem inversen Mikroskop ohne sumpfige DIC-Optik.Unter 20-facher Vergrößerung werden Zyten mit unterschiedlichen Vorkernen selektiert. Die Sortierung der Eizellen kann mit einer leeren Injektionskapillarladung erfolgen, die Injektionskapillare kurz vor der Verwendung mit ein bis zwei Mikrolitern der Injektionslösung. Befestigen Sie es dann am Mikroinjektionskopf.Aspirieren Sie dann einen ausgewählten Zyten mit einer Haltekapillare und injizieren Sie die Nuklease-mRNA flach in das Zytoplasma. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Vorkernen. Das Injektionsvolumen sollte gering gehalten werden.Beim ersten Anzeichen einer zytoplasmatischen Dehnung ziehen Sie die Nadel zurück. Normalerweise sollten etwa 80 bis 90% der Embryonen ohne unmittelbare Überleben überleben. Um die Menge der injizierten mRNA zu erhöhen, wird die Lösung nach der Mikroinjektion der verfügbaren Zyten konzentrierter.Mit einer Mundpipette in M 16-Medien überführen. Inkubieren Sie die Embryonen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Dann bringe die, die überleben, in pseudoschwangere Pflegemütter.Am Tag vor der Mikroinjektion führt dies bei drei bis sechs Monate alten weiblichen Zöliakiemäusen zu einer Scheinschwangerschaft, indem sie mit VAs sektorisierten Männchen verpaart werden. Am nächsten Morgen wählen Sie Weibchen mit einem durchsichtigen Stopfen aus, um sie als Embryoempfängerinnen zu verwenden. Unbenutzte Weibchen kehren nach drei Wochen aus ihrem Pseudo-Trächtigkeitszustand zurück und können danach wiederverwendet werden.Positionieren Sie eine betäubte Pflegemutter auf einer warmen Unterlage auf ihrem Bauch. Desinfizieren Sie dann den Bereich des Schnitts, indem Sie ihn mit 70% Ethanol besprühen. Kämmen Sie das nasse Haar von der geplanten Schnittstelle weg.Schneiden Sie nun die Bauchhöhle mit einer Schere auf und externalisieren Sie das Gebärmutterhorn. Um dies zu tun. Ziehen Sie an dem am Eierstock befestigten Fettpolster und fixieren Sie die Fortpflanzungsorgane mit einer Bulldoggenklemme.Achten Sie auch darauf, die Organe mit erwärmter 0,9%iger Natriumchloridlösung feucht zu halten. Sortieren Sie zu diesem Zeitpunkt 12 bis 20 lebensfähige Embryonen und laden Sie sie in eine dünne Glaskapillare. Mit der Mundpipette wird zunächst eine kleine Luftblase abgesaugt und dann mit einer feinen Pinzette abgesaugt.Fassen Sie den UCT vorsichtig vor dem Verstärker an und bohren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel ein kleines Loch in die UCT-Wand. Führen Sie die geladene Kapillare in das Loch ein und blasen Sie die Embryonen vorsichtig in den Verstärker, bis Sie sehen, dass die Luftblase aus der Kapillare verdrängt wurde. Entfernen Sie dann die Kapillare.Setzen Sie die Fortpflanzungsorgane sofort wieder in die Körperhöhle ein und verschließen Sie die Bauchhöhle mit einer einzigen Naht. Als nächstes verschließen Sie die Haut mit ein oder zwei neun Millimeter langen Wundclips. Bringen Sie das Tier in seinen Heimatkäfig zurück und beaufsichtigen Sie es, bis die Narkose nachlässt.Halten Sie dann die Weibchen in stabilen sozialen Gruppen von zwei bis drei Mäusen, um den Stress in den ersten drei postoperativen Tagen zu minimieren, und stellen Sie sicher, dass Sie für jede Heuschrecke im Mausgenom, die mit Designer-Nukleasen angegriffen wird, ein Analgetikum wie DEF Falcon im Trinkwasser bereitstellen. Ein PCR-basierter Assay dient der Identifizierung von Gründertieren, die ein gewünschtes mutiertes Allel tragen. Im ersten Beispiel entstanden Gründer aus der Mikroinjektion eines Schwanznukleasepaares.Targeting-Angriffe auf die Beschichtungsregion des Prionenprotein-Gens der Maus wurden durch T 7-Endonuklease-Verdau eines PCR-Produkts analysiert. Der T seven Endonuklease-Verdau-Assay beruht auf der Bildung von Hetero-Duplexen zwischen DNA-Strängen von PCR-Produkten, die aus mutierten und Wildtyp-Allelen erzeugt wurden. Die Talon-induzierte Mutagenese innerhalb der genomischen Zielregion von Einzelgründern wurde durch das Auftreten von 250 und 110 basenpaarigen Langverdauungsprodukten zusätzlich zum PCR-Produkt in voller Länge aufgedeckt.Alternativ können PCR-Produkte einem Restriktionsverdau unterzogen werden, wenn sich eine geeignete diagnostische Restriktionsstelle innerhalb der Spacerregion des Designer-Nukleasepaares befindet. Im zweiten Beispiel zielt ZFN auf eine XPO-Ein-Restriktionsstelle ab, die sich innerhalb des Intros befindet, eine der Rosa 26-Locus der Maus. Hier deuten unverdaute Banden auf das Vorhandensein von Mutationen hin.Die Sternchen markieren, das Fehlen von verdauten Produkten, was stark darauf hindeutet, dass ein Gründer Mutationen in beiden Allelen des Zielgens trägt. Die Klonierung und Sequenzierung dieser unverdauten PCR-Produkte zeigt, dass Gründermäuse zwei oder mehr unterschiedliche Modifikationen des Zielallels aufweisen können. Das Fehlen von Wildtyp-Sequenzen deutet auf eine vollständige Ablation des Zielgens hin.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für das Design der Schwanznuklease, den Aufbau des Schwanzes und die Nukleasekonstrukte haben und wissen, wie Sie diese zur Erzeugung mutierter Mäuse durch direkte Osid-Mikroinjektion verwenden können. Diese Methode kann angepasst werden, um mit anderen Klassen von Designer-Nukleasen wie Zink, Fingernukleis oder CAS neun crispr zu arbeiten. Es kann auch die Genommodifikation durch homologe Rekombination durch gleichzeitige Co-Injektion der Nuklease und des entsprechenden Gen-Targeting-Templates erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Genom-Editierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) kann schnell und effizient durchgeführt werden. Hier wird ein robustes experimentelles Verfahren zur genetischen Veränderung von hPSCs vorgestellt, wie es am Beispiel der Editierung des AAVS1-Safe-Harbor-Locus zur Expression von EGFP und zur Einführung von Antibiotikaresistenzen veranschaulicht wird.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

CRISPR-Cas ist eine leistungsstarke Technologie, die komplexe Genome von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. Hier zeigen wir ein Protokoll, das menschliche Genom mit verschiedenen Cas jedoch effizient zu bearbeiten. Wir markieren wichtige Überlegungen und Design-Parameter zur Optimierung der Bearbeitung Effizienz.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Mikroinjektion von CRISPR-Cas9 und Spender-DNA durch Zygoten, um effizient Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Mäuse zu produzieren.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Die Effizienz der I-GONAD-Methode (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) ist vergleichbar mit der herkömmlichen Mikroinjektion, bei der Zygotenentnahme von Spenderinnen und die Übertragung auf pseudoschwangere Frauen erforderlich ist. Dieses Protokoll demonstriert seine Wirksamkeit durch die Einführung von CRISPR/Cas9-induzierten Mutationen in den ROSA26-Locus auf Chromosom 6.

Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

Experimentelle Ansätze zur Tissue Engineering

Erfahren Sie die Erzeugung gendefizienter Mäuse mit TALENs durch Mikroinjektion in befruchtete Oozyten und Transfer zu Pflegemüttern. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Modifikationen für Funktionsanalysen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

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