Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional Cre-lox Mausmodelle

Das übergeordnete Ziel dieses Dissektionsverfahrens ist es, zu demonstrieren, wie der Mausdarm isoliert und für nachfolgende Charakterisierungstechniken vorbereitet werden kann. Mit dieser Methode könnte die Fähigkeit der Darmstammzellen untersucht werden, den Darm nach einem experimentellen Verfahren wieder zu besiedeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nach jeder Technik oder jedem Verfahren oder nach einer Genmanipulation verwendet werden kann. Verwenden der Cray-Locks-Technologie Beginnen Sie damit, eine euthanasierte erwachsene Maus in Rückenlage zu bringen und das Fell mit 70% Ethanol zu benetzen.

Öffnen Sie dann mit einer Schere die intraperitoneale Höhle in Längsrichtung entlang der Mittellinie und fixieren Sie den Magen mit einer Pinzette. Als nächstes durchtrennen Sie die Verbindung zur Speiseröhre und ziehen sanft am Magen, um den Dünndarm bis zum Blinddarm zu entfernen. Ziehen Sie dann vorsichtig am Blinddarm, um den Dickdarm bis zum After zu entfernen.

Sobald der Darm isoliert wurde, entfernen Sie den Magen im Blinddarm und verwenden Sie eine Spritze mit einer stumpfen Pipettenspitze, um den Darm unmittelbar nach dem Spülen mit PBS zu spülen, schneiden Sie den Darm in drei gleich große, proximale, mittlere und distale Abschnitte. Schneiden Sie dann jeden Abschnitt in einen Zentimeter großen Abschnitt und legen Sie drei bis fünf Fragmente des Gewebes in die Mitte eines zwei mal zwei Zentimeter großen Stücks chirurgisches Klebeband. In einer Pyramidenformation, wenn alle Gewebe befestigt sind, versiegeln Sie das Klebeband in Längsrichtung um die Stücke, so dass ein Holzstapel entsteht.

Legen Sie dann das Band in einen Behälter mit flachem Boden, der mindestens das Zehnfache des Volumens an neutralem, gepuffertem, formellem und fixierendem Gewebe enthält, und lagern Sie die Proben vor dem Einbetten und Schneiden bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie das Gewebe nach der Fixierung in ein Gefäß mit flachem Boden, das mindestens das 10-fache des Volumens von 70 % Ethanol wie das Volumen des Gewebes enthält, um das Gewebe unmittelbar nach dem Spülen in Metcon zu fixieren. Schneiden Sie den Darm in drei gleich große Abschnitte, wie gerade gezeigt.

Legen Sie dann jeden Abschnitt nebeneinander auf ein 15 x 15 Zentimeter großes Stück Filterpapier und öffnen Sie die Abschnitte auf FOSS mit einer Federbogenschere, wenn alle Abschnitte geteilt sind. Übertragen Sie das Filterpapier am Ende der Fixierung für drei bis 24 Stunden bei Raumtemperatur in eine Glasschale mit frisch zubereitetem Metcon, nehmen Sie mit einer Pinzette das Ende jedes Darmstücks einzeln auf und wickeln Sie das Gewebe um die Pinzette, um einzelne Schweizer Rollen zu bilden. Sichern Sie jede Rolle, indem Sie die Pinzette leicht öffnen und eine 25-Gauge-Nadel durch das Gewebe einführen.

Legen Sie dann die gerollten Gewebe mindestens eine Stunde lang in ein Gefäß mit flachem Boden, das mindestens das 10-fache des Volumens an neutraler gepufferter Formel und Fixiermittel wie das Gewebe enthält, bevor Sie es für die gesamte Mount-Laxy-Visualisierung des Gewebeplatzes verarbeiten. Gießen Sie geschmolzenes Rohwachs gemischt mit Mineralöl in 15 Zentimeter große Petrischale. Unmittelbar nach dem Spülen des Darms mit eiskaltem PBS spülen Sie das Gewebe mit 25 Millilitern eiskaltem Ex-Fixiermittel.

Schneiden Sie den Darm nach der Fixierung in drei bis fünf gleiche Abschnitte und legen Sie jeden Abschnitt auf eine der abgekühlten Wachsplatten. Stecke jedes Ende so fest, dass die Abschnitte mit den mesenterialen Linien an den oberen Rändern der Platten leicht gestreckt sind. Überschüssiges Mesenterium abschneiden.

Schneiden Sie dann mit einer Federbogenschere die Eingeweide in Längsrichtung ab, da sie geöffnet werden, wenn alle Abschnitte festgesteckt sind. Fluten Sie die Platten mit so viel Xal-Fixiermittel, dass das gesamte Gewebe nach mindestens einer Stunde bei vier Grad Celsius bedeckt ist. Verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette oder eine Spritze, um das Fixiermittel zu entfernen, und waschen Sie das Taschentuch einmal mit 30 Millilitern PBS.

Dann werden die Abschnitte mit 30 Millilitern DTTD-Vereinheitlichungslösung für eine 30- bis 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur unter Schaukeln abgedeckt. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Vergötterungslösung mit einer 25-Milliliter-Pipette oder -Spritze und fluten Sie das Gewebe mit weiteren 30 Millilitern PBS. Verwenden Sie dann eine hintere Pipette, um den Schleim mit dem PBS nach dem Waschen zu entfernen.

Ersetzen Sie das PBS durch 30 Milliliter Xal für einen Fleck über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln mit leichtem Rühren auf einer schaukelnden Plattform am nächsten Morgen. Wenn die Abschnitte einen blaugrünen Fleck entwickelt haben, ersetzen Sie den Xal durch 30 Milliliter PBS. Nach drei Minuten sanften Rührens machen Sie Schweizer Röllchen wie gerade gezeigt und legen Sie das Gewebe mindestens 24 Stunden lang vor dem Einbetten und Schneiden in ein Weithalsgefäß mit flachem Boden, das mindestens das 10-fache des Volumens des geeigneten Fixiermittels enthält wie das Gewebevolumen bei vier Grad Celsius.

Mit dem bedingten Reporter ROSA 26 R Laxy kann drei Tage nach der Induktion eine 100%ige Rekombination im Dünndarm mit Hilfe von DNA beobachtet werden, die aus den rekombinierten Krippen extrahiert wurde. Die QPCR für die rekombinierten Allele zeigte einen nicht signifikanten Anstieg der Rekombination innerhalb des VI-Faltensystems, möglicherweise aufgrund der nicht beobachteten Rekombination in Paneth-Zellen. Unter Verwendung des Ah-Faltensystems mit dem Laxy-Reporter zeigten beide Systeme auch einen vollständigen Verlust rekombinierter Zellen drei Tage nach der Induktion.

Die Daten zur Mitose und zur zellulären Höhe der K-Krypta deuteten darauf hin, dass sich das Ah-H-Cree-System erholen könnte, vermutlich aufgrund der Wiederbesiedlung durch unkombinierte Darmstammzellen. Im krassen Gegensatz dazu konnte sich der Bösewicht Cree nicht erholen, obwohl er epitheliale Kryptenzellen behielt. Darüber hinaus waren die Kryptenzellen in vi Cree Cantin B beflockten Mäusen nicht proliferativ und es fehlte die Expression des intestinalen Stammzellmarkers.

EM vier. Im Gegensatz zu den Krypten in ah cre-Mäusen erfuhren PTH-Zellen nach Caden b-Deletion nur innerhalb des VI Cree-Systems eine Apoptose. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in etwa 10 Minuten abgeschlossen werden.

Es ist wichtig, die Verzögerungen zu minimieren, um einen Gewebeabbau zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Darm von einer Maus für die nachgelagerte Analyse entfernen.