Name: Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional Cre-lox Mausmodelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Präparation des Mäusedarms für die Analyse intestinaler Stammzellen und Paneth-Zellen. Diese Methode ermöglicht Untersuchungen zur Darmregeneration und Stammzell-Repopulation.

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Die Autoren danken Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood und Sylvie Robine. Diese Arbeit wurde durch einen Programmzuschuss von Cancer Research UK finanziert.

<ol><li>Cheng, H., Origin Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((differentiation+and+renewal+of+the+four+main+epithelial+cell+types+in+the+mouse+small+intestine.+V.+Unitarian+Theory+of+the+origin+of+the+four+epithelial+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types.</a> Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.molecularmovies.com/movies/view/96">http://www.molecularmovies.com/movies/view/96</a> (2015).</li>
<li>Snippert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cell+replacement+follows+a+pattern+of+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift.</a> Science. 330 (6005), 822-825 (2010).</li>
<li>Buczacki, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+label-retaining+cells+are+secretory+precursors+expressing+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5.</a> Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+early+fate+determination+in+Lgr5%2B+crypt+stem+cells+using+a+novel+Ki67-RFP+allele%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele.</a> EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+oncology%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).</li>
<li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li>
<li>Brault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+beta-catenin+gene+by+Wnt1-Cre-mediated+deletion+results+in+dramatic+brain+malformation+and+failure+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development.</a> Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Ireland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre-mediated+control+of+gene+expression+in+the+murine+gastrointestinal+tract%3A+effect+of+loss+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin.</a> Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).</li>
<li>Kemp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+background+recombination%3A+somatic+induction+of+Cre+by+combined+transcriptional+regulation+and+hormone+binding+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity.</a> Nucleic Acids Res. 32 (11), e92(2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+elements+of+the+villin+gene+control+expression+in+restricted+domains+of+the+vertical+%28crypt%29+and+horizontal+%28duodenum%2C+cecum%29+axes+of+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine.</a> J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).</li>
<li>Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+crucial+role+of+paneth+cells+in+mediating+the+intestinal+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury.</a> Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li>
<li>Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Mash-2+in+extraembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of Mash-2 in extraembryonic development.</a> Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).</li>
<li>Gregorieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Wnt+signaling+components+in+the+adult+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine.</a> Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).</li>
<li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+small+intestinal+epithelial+from+p53-null+mice%3A+evidence+for+a+delayed%2C+p53-independent+G2%2FM-associated+cell+death+after+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation.</a> Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).</li>
<li>Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+during+spontaneous+and+radiation-induced+apoptosis+in+the+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine.</a> J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).</li>
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<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li>
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<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).</li>
<li>Adolph, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+as+a+site+of+origin+for+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation.</a> Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).</li>
<li>Marsh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Pten+is+dispensable+for+intestinal+homeostasis+but+suppresses+adenoma+development+and+progression+after+Apc+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation.</a> Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).</li>
<li>Jardé, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+models+for+the+therapeutic+targeting+of+Wnt+signaling+using+a+Tet-O%CE%94N89%CE%B2-catenin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system.</a> Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+alpha1%28I%29-collagen+promoter+is+the+best+known+promoter+to+drive+efficient+Cre+recombinase+expression+in+osteoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast.</a> Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).</li>
<li>Hinoi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+colonic+adenoma-carcinoma+progression+based+on+somatic+Apc+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation.</a> Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Wong, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lrig1+controls+intestinal+stem-cell+homeostasis+by+negative+regulation+of+ErbB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling.</a> Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Derivation+of+a+Living+Organoid+Biobank+of+Colorectal+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Verwendung bedingter cre-lox-transgenen Mäusen, die Funktion der Gene und Zellen zu zerlegen ist ein häufig verwendeter Ansatz. Diese Modelle sind mit großem Erfolg im Darm verwendet worden, um zu identifizieren und zu charakterisieren, die Stammzellen 2,4-6 und zu verstehen, ihre Rolle bei der Krankheit 25. Diese Modelle voll auszuschöpfen erfordert eine umfassende Charakterisierung des Systems zu ermöglichen, dass Daten richtig interpretiert werden. Ein vollständiges Verständnis dieser Systeme ist schwierig zu erreichen, aufgrund von Genen nur selten spezifisch für eine Einzelzelle Typ oder Ort, einer geringen biologischen Erkenntnisse und Ineffizienz der verwendet wird, um Cre Expression zu induzieren Systeme. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, wie wir diese Probleme durch experimentelle Gestaltung und Anwendung des vorhandenen Wissens zu überwinden. Obwohl wir diese Methoden verwendet werden, um eine spezifische Fragestellung der hier vorgestellten Techniken sind generisch und kann für jede Forschung Untersuchung der Muri ausgenutzt werden, zu beantwortenne Darm. Vorbereitung der Darmgewebe Der entscheidende Schritt für die Gewährleistung robustere Ergebnisse ist die Ernte und Verarbeitung des Gewebes, die zeitnah und Fixierung Protokolle genau eingehalten verarbeitet werden muss. Da fast alle wichtigen Fragen können stromabwärts zu Artefakten mit dem Gewebe Austrocknen und / oder unvollständige Fixierung zugeordnet zurückzuführen. Timing ist entscheidend, um eine Verschlechterung der Gewebearchitektur und / oder Nukleinsäuren und Proteinen zu verhindern. Unvollständige oder übereifrigen Fixierung kann zum Verlust der histochemischen Auflösung führen. Unvollständige Fixierung aufgrund unzureichender Zeit oder Abschnitte zu dick, um zu ermöglichen Fixiermittel Penetration kann zu einem Verlust der Auflösung innerhalb der Darmkrypten, die als &quot;Wassermarke&quot; auf IHC-Analyse beobachtet werden kann, führen. Weiterhin ist es wichtig, dass Fixierung nicht zu lange zu verlängern, wie kern β-Catenin aus dem Zellkern, sofern nicht sofort pro diffundierenbeitet und Wachs eingebettet folgenden Formalinfixierung. Rolle der Paneth-Zellen in der ISC-Nischen- Die hier vorgestellten Daten effektiv zu zeigen, wie wichtig die Paneth-Zellen in Krypta Regeneration im adulten Darm folgenden ISC Verlust. Allerdings blieb die Möglichkeit, dass Ah-cre erspart eine Bevölkerung von ISCs dass vil-Cre-ER T2 Ziele. Tian et al. 26 elegant gezeigt, dass die Lgr5 hallo ISCs werden von einer Bevölkerung von Lgr5 lo Reserve ISCs ersetzt. Es scheint nun wahrscheinlich, dass diese ISCs in der Ah-cre-System aufgrund der Reservepopulation, die als sekretorischen Zellvorläufer 6,7 identifiziert verschont. Die Bedeutung des reifen Paneth Zelle bei der Unterstützung dieser sekretorischen Zellvorläufer bei Bedarf zu einem ISC Zustand zurück bleibt unbeantwortet. Wie Paneth-Zellen bilden die ISC Nischen 8 und spielen eine Rolle bei der Regulierung der ISC-Antworten, die Kalorienaufnahme 27 und Entzündung 28 bleibt es wahrscheinlich, dass ihre Pflegefunktionen, um ihre eigenen Vorprodukte zu verlängern. Neue Konzepte und Technologien zur effektiven Modell Menschen Darmkrebs Die Entdeckung des ISC führte zur Identifizierung von Genen, die nun verwendet werden, um neue Mausmodelle für die Untersuchung der Rolle der Gene und Zellen in Darm-Biologie und Erkrankung durch Clarke et al 9 Bewertung zu erzeugen. Die einzigen Einschränkungen dieser Technik ist die Identifizierung von Genen, die Cre-Protein zu exprimieren. Derzeit ISCs werden routinemäßig untersucht mit Hilfe von bedingten transgenen Mäusen auf der Grundlage der Lgr5 Genexpressionsmuster. Mäuse, die Cre vom Lgr5 Promotors exprimieren, wurden verwendet, um APC, das Gen am häufigsten bei Darmkrebs mutiert (CRC zu löschen), Was die ISC als Ursprungszelle 25. Selektiven Löschen anderer CRC-Gene in diesen Zellen wird einen Einblick in den Krankheitsverlauf und die Ausbreitung z. PTEN 29. Weitere Einblicke in ISC-Funktion wird von speziell Abtragen Lgr5 exprimierenden Zellen in Mäusen mit einem menschlichen Diphtherie-Toxin-Rezeptor abgerufen (DTR) Gen klopfte in die Lgr5 Locus 26. Andere Strategien nutzen die Tet-A-System, das laufende reversible Expression der mutierten Proteine ​​30 ermöglicht. Mit Hilfe dieser Werkzeuge, um Gen (en) in verschiedenen Zellen 31 und Standorte 32,33 ändern wird verwendet, um zu verstehen, wie Krebs auslösen, Fortschritt und metastasieren 34. Alternativ Mutagenese mit dem Transposon Sleeping Beauty System ist die Identifizierung neuer Fahrer von CRC. Die Weiterentwicklung von Mäusen, Techniken und genetische Veränderung Strategien weiterhin mehr Patienten relevanten Modelle zu entwickeln. New methoden wurden zur Charakterisierung der Darmepithelien und ISCs entwickelt. Charakterisierung des Verhältnisses der epithelialen Zelltypen können mit Strömung erreicht werden Zytometrie auf die differentielle Expression von Lectin und CD24 35 basierend. Möglicherweise der größte Fortschritt in der ISC Verständnis der Biologie und ihre Rolle bei der Krankheit mit der ex vivo organoiden Kultursystem 36 durchgeführt werden. Dieses System erlaubt es normalen und malignen ISCs zu Kultur in 3D, wo sie zu replizieren und zu differenzieren in einem physiologisch relevanten Art und Weise. Es ist zu hoffen, dass diese direkte Prüfung von Arzneimitteln am Patientenproben in vitro zu ermöglichen und damit den Weg für die personalisierte Medizin 37.

Die luminale Oberfläche der Säugerdarm Merkmale Repetiereinheiten der Krypten und fingerartigen Vorsprüngen, bezeichnet Zotten, die in das Lumen ragen. Diese Oberfläche ist eine kontinuierliche Bahn von Epithelien, die komplette Selbsterneuerung etwa alle 3 unterzogen - 4 Tage 1. Diese dynamische Gewebe wird durch eine Population rasch proliferierender Stammzellen unterstützt (ISCs; auch als Krypta Basis Cylinderzelle bekannt), die zunächst durch ihre Expression des Gens Lgr5 2,3 identifiziert wurden. Diese Zellen existieren in einer spezialisierten Nischen am Boden der Krypten der Lieberkühn. Zunächst wird die Feststellung, daß ISCs wurden rasch proliferierender war diskordanten mit der herrschenden Vorstellung, daß eine Stammzelle war Ruhe Natur. Vor der Identifizierung des Lgr5 + ISC wurde postuliert, dass eine Population von Ruheetikettenhaltende Zellen auf der + 4-Position, relativ zu der Basis der Krypta waren die ISCs 1. Neuere Forschungen hwie jetzt durch den Nachweis, dass in erster Linie gibt es einen Pool von äquipotent Radfahren ISCs in jeder Krypta, deren Schicksal durch seine Nachbarn 4,5 reguliert versöhnt diese Beobachtungen. Für den Fall, sie verloren sind diese durch ruhende Zellen, die normalerweise an den sekretorischen Linie verpflichtet, sondern kann auf ISCs zurück, wenn das ISC Bevölkerung beschädigt 6 ersetzt werden. ISC Nachbarn können entweder ISCs oder deren Tochterzellen. Die ISCs produzieren naiv Tochterzellen, die sich vermehren und differenzieren sich in den spezialisierten Zelltypen, die die epithelialen Blatt, Linien Darmlumen 1 umfassen. Der Kelch, enteroendokrinen, Enterozyten, Büschel und M Zellen wandern nach oben, um die luminale Oberfläche, wo sie bieten verschiedene Absorptions- und Regulierungsfunktionen bleiben jedoch die Paneth Zellen am Boden der Krypta, wo sie existieren, mit der ISCs vermischt. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass ein Anteil des naiven daughtER-Zellen für einen sekretorischen Linie dazu bestimmt sind Ruheetiketthalte Lgr5 lo Zellen, die Rückkehr zu einer ISC auf Verletzungen 6,7. Aufgrund ihrer Bedeutung in Krypta Regeneration eine Priorität auf das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen der ISCs und seinen Nachbarn, insbesondere der Panethzellen platziert. Die Paneth-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der Nische, die die ISCs 8 unterstützt. Neben bakterizide Produkte die Paneth Zellen Signalmoleküle, die Wege, die ISC Erneuerung oder Differenzierung regieren zu aktivieren. Frühere Studien zeigten, dass die Lgr5 + ISCs könnte nur dann verbindlich, wenn sie für wesentliche Nische Signale durch ihre Tochter Panethzellen 8 vorgesehen konkurrieren könnte. Diese Studien untersuchten die Rolle von Paneth-Zellen an normalen Lgr5 + ISCs und nicht in einer Situation, wo sie beschädigt sind und Nachschub von einer Lgr5 lo Bevölkerung. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Um zu verstehen, Darm Biologie und Modellerkrankung untersuchen wir die funktionelle Rolle der Zellen und / oder Gene mit transgenen Mausmodellen 9,10. Häufig sind diese Modelle verwenden cre-lox-Technologie, um Gen (e) 9,10 bedingt zu ändern. Cre (Ursachen Rekombination) Rekombinase ist eine ortsspezifische Rekombinase des Integrase-Familie, isoliert aus dem Bakteriophagen P1. Cre katalysiert ortsspezifische Rekombination zwischen definierten 34 bp &#39; Lox P &#39;(Locus χ der Crossover-P1) Websites. Mäuse gentechnisch so verändert LoxP Websites, die interessierenden Bereiche, die bei der Expression der Cre-Rekombinase ausgeschnitten flankieren, enthalten. Verknüpfung der Expression der Cre-Gens in eine Zelle oder entwicklungsspezifischen Promotors ermöglicht die Änderung in einer räumlichen Mode 9,10 hergestellt werden, ist dies besonders nützlich bei der Überwindung embryonale letale Mutationen. Weitere Verknüpfung des Cre-Expression zu einem Rezeptor-Weg,daß künstlich aktiviert werden, erlaubt zeitlichen Veränderungen. Mit dieser Technologie haben wir inaktiviert die CatnB Gen 11 in den Darmepithelien. β-Catenin, das CatnB Genprodukt ist ein wichtiger Regulator des Wnt-Signalwegs, der ISC-Homöostase regelt. Zwei frühere Studien mit dieser Strategie erzeugt widersprüchlichen Ergebnissen 12,13. Die Studie von FEVR et al. 12 gezeigt Verlust von Stammzellen und Darm Homöostase. Während die Ireland et al. 14 Studie berichtet, dass im Anschluss an eine Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen die Krypta-villus Achse wurde aus Wildtyp-Zellen, die CatnB neu besiedelt. Der Hauptunterschied in diesen Studien war der Promotor verwendet werden, um Cre in Darmepithelien auszudrücken. Die FEVR et al., Verwendet Studie die Villin-Gen-Promotor an den Östrogenrezeptor verbunden, die durch die Verabreichung von t aktiviert werden kannamoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. Im Gegensatz Ireland et al., Verwendet das Promotorelement des Ratten-Cytochrom P450A1 (CYP1A1) Gens Cre-Expression in Reaktion auf die xenobiotischen β-Naphthoflavon (Ah-cre) anzutreiben. Die Eigenschaften dieser verschiedenen Systemen erzeugten zwei Hypothesen für diese verschiedenen Beobachtungen erklären. Das erste, das CatnB effizienter im ISC mit der vil-Cre-ER T2 System im Vergleich zu den Ah-cre gelöscht wird, wodurch die Anzahl der ISCs, um Unter Repopulation Niveaus verringert wird. Alternativ war es aufgrund CatnB Deletion Differenz in der differenzierten Zellpopulation. Die vil-Cre-ER T2-System richtet sich an alle Epithelzellen der Krypta und Zotten während die Ah-cre-System zielt nur die nicht-Panethzellen des ISC-Nische und Krypta. Diese Systeme bereitgestellt ideale Werkzeuge für die Prüfung des Behavior der ISCs und ihrer Wechselwirkung mit den Paneth-Zellen. Hier stellen wir verschiedene ausführliche Protokolle auf, wie wir früher, diese Systeme zu bestimmen, dass Panethzellen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der intestinalen Reaktion auf eine Verletzung 17 zu spielen.

<table><tbody><tr><td>Acetatpuffer</td><td>*</td><td>*</td><td>Zur Herstellung von 100 ml: 4,8 ml 0,2 M Essigsäure, 45,2 ml 0,2 M Natriumacetat & 50 ml destilliertes Wasser</td></tr><tr><td></td><td>Essigsäure Fisher Scientific</td><td>C/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydridlösung</td><td>*</td><td>*</td><td>2 M Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolaminhydrochlorid</td></tr><tr><td>Alcianblau</td><td>Sigma</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue pH 2,5</td><td>*</td><td>*Zur</td> <td>Herstellung von 500 ml: 15 ml Essigsäure, 5 g Alcian Blue & 485 ml destilliertes Wasser</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin alkalische Phosphatase konjugierter Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab119345</td><td></td></tr><tr><td>B(beta)-Naphthoflavon</td><td>Sigma</td><td>N3633</td><td>BNF, injizieren, ohne die Lösung zu stark abkühlen zu lassen, da die Verbindung aus der Lösung fällt. Die Lösung kann wiederverwendet werden &ndash; Lagerung bei -20 °; C zwischen den Anwendungen, nicht mehr als zweimal erhitzen.</td></tr><tr><td>Bloxall</td><td>Vector Labs</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>BM lila</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td>Rinderserumalbumin</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/4920/17</td><td></td></tr><tr><td>Citrat Puffer/Antigen Demaskierungslösung</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Maisöl</td><td>Sigma</td><td>C8627</td><td></td></tr><tr><td>Entwässerungslösung</td><td>*</td><td>*</td><td>Für 500 ml: 50 ml Glycerin, 50 ml Tris 0,1 M pH8,8, 100 ml EtOH, 300 ml Kochsalzlösung (0,9 % NaCl in Wasser), DTT 1,7 g. Die Entwässerungslösung kann im voraus hergestellt und gelagert werden, aber DTT-Schaum muss erst kurz vor der Inkubation (340 mg/100 ml) zugegeben werden.</td></tr><tr><td>DEPC aufbereitetes Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>101509944</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td>0,5M</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>3000917</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Formalin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>SLBL11382V</td><td>Neutral gepuffertes Formalin</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F5786</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehye</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Raymond A Lamm</td><td>12698616</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td></tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td><td>*</td><td>*</td><td>&nbsp; 5& mal; SSC, 50% Formamid, 5% SDS, 1 mg/ml Heparin, 1 mg/ml Kälberleber</td></tr><tr><td>tRNA Hydrochinon</td><td>Sigma</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroxidase</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Maus IgG Kit</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Kaninchen IgG Kit</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>Darmgewebepulver</td><td>*</td><td>*</td><td>Die Dünndärme von 5 adulten Mäusen wurden kombiniert und in einem minimalen Volumen an eiskaltem PBS homogenisiert. 4 Volumen eiskaltes Aceton wurden in den homogenisierten Darm gegeben, der gründlich gemischt und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert wurde. Dieses wurde zentrifugiert und das Pellet mit eiskaltem Aceton gewaschen. Dieses wurde weiter zentrifugiert und das entstandene Pellet auf Filterpapier verteilt und trocknen gelassen. Nach dem gründlichen Trocknen wurde das Material mit Stößel und Mörser zu einem feinen Pulver zerkleinert.</td></tr><tr><td>K-Ferricyanid</td><td>Sigma</td><td>P-3667</td><td></td></tr><tr><td>K-Ferrocyanid</td><td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L0380000</td><td></td></tr><tr><td>Methacarn</td><td>*</td><td>60</td><td>% Methanol:30% Chloroform:10% Essigsäure</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Normales Kaninchenserum</td><td>Vector</td><td>Labs S-1012</td><td>NGS</td></tr><tr><td>Normales Kaninchenserum</td><td>Dako</td><td>X0902</td><td>NRS</td></tr><tr><td>NTMT</td><td>*</td><td>*</td><td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween20, 2 mM Levamisol</td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Vector</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>*</td><td>*</td><td>0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7,5, 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x Auflösung.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt, um 1x</td></tr><tr><td>PLL-Objektträger</td> herzustellen <td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td>Poly-L-Lysin-Objektträger</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase k-Lösung</td><td>*</td><td>*</td><td>Verdünnte Proteinase K bei 200 &; Mikro; g/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.</td></tr><tr><td>Ralwax</td><td>BDH</td><td>36154 7N</td><td></td></tr><tr><td>Reducer Solution</td><td>*</td><td>*</td><td>Zur Herstellung von 100 ml: 1 g Hydrochinon, 5 g Natriumsulfit & 100 ml destilliertes Wasser</td></tr><tr><td>RnaseA</td><td>Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>*</td><td>*</td><td>0,9% NaCl in destilliertem Wasser</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>I3771</td><td></td></tr><tr><td>Schafserum</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Silbernitrat</td><td>Sigma</td><td>S/1240/46</td><td></td></tr><tr><td>Silberlösung</td><td>*</td><td>*</td><td>Zur Herstellung von 100 ml: 10 ml Acetatpuffer, 87 ml destilliertes Wasser, 3 ml 1% Silbernitrat</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S6753</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Natriumsulfit</td><td>Sigma</td><td>239321</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>Sigma</td><td>93017</td><td>20x Kochsalzlösung Natriumcitrat</td></tr><tr><td>Chirurgisches Klebeband</td><td>Fisher Scientific</td><td>12960495</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>TAM, injizieren, ohne die Lösung zu stark abkühlen zu lassen, da die Verbindung aus der Lösung fällt. Die Lösung kann wiederverwendet werden &ndash; Lagerung bei -20 °; C zwischen den Anwendungen, nicht mehr als zweimal erhitzen.</td></tr><tr><td>TBS/</td><td>T-Zell-Signalgebung</td><td>#9997</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolaminhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>TP9416</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Hardset Einbettmedium mit DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4001</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal Fixiermittel</td><td>*</td><td>*</td><td>2% Formaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd in 1x PBS</td></tr><tr><td>X-Gal Fleck</td><td>*</td><td>*</td><td>X-Gal Fleck; 200 &#956; l X-Gal (A) in 50 ml Lösung B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-Ferricyanid, 0,734 g K-Ferrocyanid in 500 ml PBS).&nbsp; Lösung B kann im voraus aufgefüllt und bei 4 μg gelagert werden; C</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0200/21</td><td></td></tr></tbody></table>

protokolle für die analyse der rolle der paneth-zellen bei der regeneration des murine darm mit conditional<em&gt; cre-lox</em&gt; mausmodelle

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Die epitheliale Oberfläche der Säugerdarm ein dynamisches Gewebe, das alle 3 erneuert - 7 Tagen. Das Verständnis dieser Erneuerungsprozess identifizierten eine Population rasch proliferierender Darm-Stammzellen (ISCs), gekennzeichnet durch ihre Expression des Gens Lgr5. Diese werden von einem ruhenden Stammzellpopulation, von der BMI-1-Expression gekennzeichnet ist, in der Lage, im Falle einer Verletzung ersetzen unterstützt. Die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis ihrer Rolle in Erkrankungen und Krebs. Die ISCs existieren innerhalb Krypten auf der Darmoberfläche, diese Nischen unterstützen die ISC in Auffüllen der Epithelien. Die Wechselwirkung zwischen den aktiven und ruhenden ISCs wahrscheinlich mit anderen differenzierten Zellen innerhalb der Nische, wie es zuvor gezeigt worden ist, dass die &#39;&#39; stemness &#39;&#39; der Lgr5 ISC ist eng mit der Gegenwart ihrer benachbarten Panethzellen gebunden. Bedingte cre-lox-MausModelle, die wir untersucht den Effekt des Löschens der Mehrzahl der aktiven ISCs in Gegenwart oder Abwesenheit von Paneth-Zellen. Hier beschreiben wir die Techniken und Analysen durchgeführt, um den Darm zu charakterisieren und zu zeigen, dass die Paneth-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der ISC Nische bei der Unterstützung Erholung nach erheblichen Beleidigung.

Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mausmodelle

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Präparationsverfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie der Mausdarm für anschließende Charakterisierungstechniken isoliert und präpariert wird. Diese Methode kann verwendet werden, um die Fähigkeit der intestinalen Stammzellen zu untersuchen, den Darm nach einem experimentellen Eingriff wieder zu besiedeln. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie nach jeder Methode, jedem Verfahren oder nach einer Genmanipulation unter Verwendung der Cray Locks-Technologie angewendet werden kann. Beginnen Sie damit, eine euthanasierte erwachsene Maus in Rückenlage zu positionieren und das Fell mit 70 %igem Ethanol anzufeuchten.Danach mit einer Schere die Bauchhöhle entlang der Mittellinie longitudinal öffnen und den Magen mit einer Pinzette fixieren. Anschließend die Verbindung zum Ösophagus durchtrennen und vorsichtig am Magen ziehen, um den Dünndarm bis zum Appendix zu entfernen. Danach vorsichtig am Appendix ziehen, um den Dickdarm bis zum Anus zu entfernen.Nachdem die Därme isoliert wurden, entfernen Sie den Magen im Anhang und spülen Sie die Därme unmittelbar danach mit einer Spritze, die mit einer stumpfen Pipettenspitze ausgestattet ist, mit PBS aus. Anschließend schneiden Sie den Darm in drei gleich große Abschnitte: proximalen, mittleren und distalen. Danach schneiden Sie jeden Abschnitt in Stücke von einem Zentimeter Länge und legen drei bis fünf Gewebefragmente in Form einer Pyramide auf die Mitte eines zwei mal zwei Zentimeter großen Stück chirurgischen Klebebands. Sobald alle Gewebestücke angebracht sind, verschließen Sie das Band längs um die Fragmente herum, sodass ein Stapel wie ein Holzstapel entsteht.Danach das Band in einen flachbodigen Behälter geben, der mindestens das 10-fache Volumen eines neutralen, gepufferten Formalin-Fixativs im Verhältnis zum Gewebematerial enthält, und die Proben vor der Einbettung und Schnittführung bei vier Grad Celsius lagern. Nach der Fixierung das Gewebe in einen flachbodigen Behälter überführen, der mindestens das 10-fache Volumen an 70 %igem Ethanol im Verhältnis zum Gewebematerial enthält, um das Gewebe unmittelbar nach dem Spülen in Metcon zu fixieren. Den Darm in drei gleich große Abschnitte schneiden, wie zuvor gezeigt.Legen Sie anschließend jeden Abschnitt nebeneinander auf ein 15 mal 15 Zentimeter großes Stück Filterpapier und verwenden Sie eine Federbogenschere, um die Abschnitte auf FOSS zu öffnen, sobald alle Abschnitte geteilt wurden. Überführen Sie das Filterpapier am Ende der Fixierung in eine Glaswanne mit frisch zubereitetem Metcon für drei bis 24 Stunden bei Raumtemperatur. Heben Sie mit einer Pinzette nacheinander das Ende jedes Darmstücks an und wickeln Sie das Gewebe um die Pinzette, um individuelle Schweizerrollen zu formen. Sichern Sie jede Rolle, indem Sie die Pinzette leicht öffnen und eine Nadel mit 25 Gauge durch das Gewebe stechen.Legen Sie die gerollten Gewebe anschließend in einen flachen Behälter, der mindestens das 10-fache Volumen einer neutral gepufferten Fixierlösung im Vergleich zum Gewebe enthält, und fixieren Sie sie dort mindestens eine Stunde lang, bevor sie für die Ganzpräparat-Montage zur sichtbaren Darstellung der Gewebeaufspaltung weiterverarbeitet werden. Gießen Sie geschmolzenes Rohwachs, das mit Mineralöl vermischt wurde, in 15 cm große Petrischalen. Spülen Sie die Därme unmittelbar nach der Spülung mit eiskaltem PBS mit 25 Milliliter eiskaltem Ex-Cal-Fixansatz durch.Nach der Fixierung schneiden Sie den Darm in drei bis fünf gleich lange Abschnitte und legen jeden Abschnitt auf eine der gekühlten Wachsplatten. Befestigen Sie jedes Ende mit Nadeln, sodass die Abschnitte leicht gespannt sind und die mesenterialen Linien an den Oberkanten der Platten liegen. Entfernen Sie überschüssiges Mesenterium.Verwenden Sie dann Federbogen-Scheren, um die Därme längs aufzuschneiden, und heften Sie sie beim Öffnen fest. Sobald alle Abschnitte fixiert sind, überschwemmen Sie die Platten mit ausreichend Xal-Fixansatz, um alle Gewebe zu bedecken, und lassen Sie sie mindestens eine Stunde bei vier Grad Celsius einwirken. Entfernen Sie den Fixansatz mithilfe einer 25-Milliliter-Pipette oder einer Spritze und waschen Sie die Gewebe einmal mit 30 Milliliter PBS.Decken Sie die Schnitte anschließend mit 30 Milliliter DTTD-Verbindungslösung ab und inkubieren Sie 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Am Ende der Inkubation entfernen Sie die Entfettungslösung mit einer 25-Milliliter-Pipette oder Spritze und überspülen die Gewebe mit weiteren 30 Milliliter PBS. Anschließend entfernen Sie mit einer hinteren Pipette den Schleim zusammen mit dem PBS nach der Wäsche.Ersetzen Sie das PBS durch 30 Milliliter Xal, um eine Übernachtfärbung bei Raumtemperatur im Dunkeln unter leichter Schüttelbewegung auf einer Schüttelplattform durchzuführen. Am nächsten Morgen: Wenn sich in den Schnitten eine blaugrüne Färbung entwickelt hat, ersetzen Sie das Xal durch 30 Milliliter PBS. Nach dreiminütiger leichter Schüttelbewegung stellen Sie Schweizerrollen wie gerade gezeigt her und geben das Gewebe in einen weithalsigen, flachbodigen Behälter, der mindestens das 10-fache Volumen eines geeigneten Fixativs im Vergleich zum Gewebevolumen enthält, und lagern es bei vier Grad Celsius mindestens 24 Stunden lang vor der Einbettung und dem Schneiden. Unter Verwendung des bedingten ROSA 26 R Laxy-Reporters kann drei Tage nach der Induktion im Dünndarm eine 100%ige Rekombination beobachtet werden, wobei die DNA aus den rekombinierten Krypten extrahiert wurde. Die qPCR für die rekombinierten Allele zeigte einen statistisch nicht signifikanten Anstieg der Rekombination im VI-crease-System, was möglicherweise auf die nicht beobachtete Rekombination in Paneth-Zellen zurückzuführen ist. Unter Verwendung des ah-crease-Systems mit dem laxy-Reporter zeigten beide Systeme außerdem einen vollständigen Verlust rekombinierter Zellen drei Tage nach der Induktion.Die Daten zur Mitose und zur zellulären Höhe in den Krypten zeigten, dass das ah H Cree-System vermutlich aufgrund einer Rekolonisierung durch nicht verbundene intestinale Stammzellen regenerieren konnte. Im deutlichen Gegensatz dazu war das villain Cree-System nicht in der Lage, sich zu regenerieren, obwohl epitheliale Kryptenzellen erhalten blieben. Außerdem waren die Kryptenzellen in den vi Cree Cantin B flocked Mäusen nicht proliferativ und wiesen keinen Ausdruck des Markers für intestinale Stammzellen auf.EM vier. Im Gegensatz zu den Krypten in ah cre Mäusen unterzogen PTH-Zellen nach Caden-b-Deletion ähnlich wie diese nur innerhalb des VI-Cree-Systems einer Apoptose. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa 10 Minuten abgeschlossen werden.Es ist wichtig, Verzögerungen zu minimieren, um eine Gewebezerstörung zu verhindern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Darm einer Maus für nachfolgende Analysen entnimmt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren zur Erzeugung einer proximalen Dickdarmschleife oder eines pcLoop-Segments der Maus, gefolgt von einer intraluminalen Injektion von fluoreszierenden Markern in das Segment, um die intestinale Epithelpermeabilität zu untersuchen.

Generierung eines proximalen Dickdarmschleifenmodells der Maus: ein chirurgisches Verfahren zur Erzeugung einer proximalen Dickdarmschleife und zur Messung der intestinalen Permeabilität durch Nachweis von Fluoreszenzmarkern im Serum nach intraluminaler Injektion

Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Epithelzellen entlang der Darmschleimhaut sind wesentlich unterschiedlichen Zelllinien zu definieren. Die richtige Darstellung von Darmgewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Identifizierung von Proteinexpressionsmuster mit maximaler Auflösung. Diese Studie hat zum Ziel, die optimalen Verfahren und Bedingungen für die Verarbeitung der Maus Darmgewebe zu beschreiben.

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Die transparente C. Elegans Darm kann als eine"in-Vivo Gewebe Kammer" für das Studium Apicobasal Membran und Lumen Biogenese einzellige und subzellulärer Ebene bei mehrzelligen Tubulogenesis dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Standardbeschriftung kombinieren, Verlust der Funktion genetische/RNAi und mikroskopische Ansätze, diese Prozesse auf molekularer Ebene zu zergliedern.

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.

Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man murine primäre epitheliale Dickdarmmonoschichten direkt aus Darmkrypten erzeugt. Wir bieten experimentelle Ansätze zur Erzeugung konfluenter Monoschichten auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für die Kratzwundeheilung und biochemische Studien sowie spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Der Magen-Darm-Trakt ist eines der empfindlichsten Organe für Verletzungen bei strahlentherapeutischen Krebsbehandlungen. Es ist gleichzeitig ein Organsystem mit einer der höchsten Regenerationskapazitäten nach solchen Beleidigungen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Untersuchung der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels.

Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode vor, um Bilder des Darms nach laserinduzierter Verwundung zu erhalten. Indem der Darm der Maus einem Multiphotonenlaser ausgesetzt wird, wird der Verlust einer oder mehrerer Krypten lokal induziert. Durch die wiederholte Abbildung des geschädigten Bereichs über Monate hinweg wird die Echtzeitdynamik der Darmerholung erfasst.

Laserablation und Intravitalmikroskopie zur Untersuchung des Darmumbaus

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Isolierung von murinen Kolonkrypten für die Entwicklung von 3-dimensionalen Kolonoiden beschreibt. Die etablierten Kolonoide können dann terminalisiert werden, um die zelluläre Zusammensetzung des Wirtsepithels widerzuspiegeln, bevor sie eine entzündliche Herausforderung erhalten oder angewiesen werden, eine epitheliale Monoschicht zu bilden.

Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

Lernen Sie die Isolierung und Präparation des Mäusedarms für die Analyse intestinaler Stammzellen und Paneth-Zellen. Diese Methode ermöglicht Untersuchungen zur Darmregeneration und Stammzell-Repopulation.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional

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