Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional

Das übergeordnete Ziel dieses Präparationsverfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie der Mausdarm für anschließende Charakterisierungstechniken isoliert und präpariert wird. Diese Methode kann verwendet werden, um die Fähigkeit der intestinalen Stammzellen zu untersuchen, den Darm nach einem experimentellen Eingriff wieder zu besiedeln. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie nach jeder Methode, jedem Verfahren oder nach einer Genmanipulation unter Verwendung der Cray Locks-Technologie angewendet werden kann. Beginnen Sie damit, eine euthanasierte erwachsene Maus in Rückenlage zu positionieren und das Fell mit 70 %igem Ethanol anzufeuchten.

Danach mit einer Schere die Bauchhöhle entlang der Mittellinie longitudinal öffnen und den Magen mit einer Pinzette fixieren. Anschließend die Verbindung zum Ösophagus durchtrennen und vorsichtig am Magen ziehen, um den Dünndarm bis zum Appendix zu entfernen. Danach vorsichtig am Appendix ziehen, um den Dickdarm bis zum Anus zu entfernen.

Nachdem die Därme isoliert wurden, entfernen Sie den Magen im Anhang und spülen Sie die Därme unmittelbar danach mit einer Spritze, die mit einer stumpfen Pipettenspitze ausgestattet ist, mit PBS aus. Anschließend schneiden Sie den Darm in drei gleich große Abschnitte: proximalen, mittleren und distalen. Danach schneiden Sie jeden Abschnitt in Stücke von einem Zentimeter Länge und legen drei bis fünf Gewebefragmente in Form einer Pyramide auf die Mitte eines zwei mal zwei Zentimeter großen Stück chirurgischen Klebebands. Sobald alle Gewebestücke angebracht sind, verschließen Sie das Band längs um die Fragmente herum, sodass ein Stapel wie ein Holzstapel entsteht.

Danach das Band in einen flachbodigen Behälter geben, der mindestens das 10-fache Volumen eines neutralen, gepufferten Formalin-Fixativs im Verhältnis zum Gewebematerial enthält, und die Proben vor der Einbettung und Schnittführung bei vier Grad Celsius lagern. Nach der Fixierung das Gewebe in einen flachbodigen Behälter überführen, der mindestens das 10-fache Volumen an 70 %igem Ethanol im Verhältnis zum Gewebematerial enthält, um das Gewebe unmittelbar nach dem Spülen in Metcon zu fixieren. Den Darm in drei gleich große Abschnitte schneiden, wie zuvor gezeigt.

Legen Sie anschließend jeden Abschnitt nebeneinander auf ein 15 mal 15 Zentimeter großes Stück Filterpapier und verwenden Sie eine Federbogenschere, um die Abschnitte auf FOSS zu öffnen, sobald alle Abschnitte geteilt wurden. Überführen Sie das Filterpapier am Ende der Fixierung in eine Glaswanne mit frisch zubereitetem Metcon für drei bis 24 Stunden bei Raumtemperatur. Heben Sie mit einer Pinzette nacheinander das Ende jedes Darmstücks an und wickeln Sie das Gewebe um die Pinzette, um individuelle Schweizerrollen zu formen. Sichern Sie jede Rolle, indem Sie die Pinzette leicht öffnen und eine Nadel mit 25 Gauge durch das Gewebe stechen.

Legen Sie die gerollten Gewebe anschließend in einen flachen Behälter, der mindestens das 10-fache Volumen einer neutral gepufferten Fixierlösung im Vergleich zum Gewebe enthält, und fixieren Sie sie dort mindestens eine Stunde lang, bevor sie für die Ganzpräparat-Montage zur sichtbaren Darstellung der Gewebeaufspaltung weiterverarbeitet werden. Gießen Sie geschmolzenes Rohwachs, das mit Mineralöl vermischt wurde, in 15 cm große Petrischalen. Spülen Sie die Därme unmittelbar nach der Spülung mit eiskaltem PBS mit 25 Milliliter eiskaltem Ex-Cal-Fixansatz durch.

Nach der Fixierung schneiden Sie den Darm in drei bis fünf gleich lange Abschnitte und legen jeden Abschnitt auf eine der gekühlten Wachsplatten. Befestigen Sie jedes Ende mit Nadeln, sodass die Abschnitte leicht gespannt sind und die mesenterialen Linien an den Oberkanten der Platten liegen. Entfernen Sie überschüssiges Mesenterium.

Verwenden Sie dann Federbogen-Scheren, um die Därme längs aufzuschneiden, und heften Sie sie beim Öffnen fest. Sobald alle Abschnitte fixiert sind, überschwemmen Sie die Platten mit ausreichend Xal-Fixansatz, um alle Gewebe zu bedecken, und lassen Sie sie mindestens eine Stunde bei vier Grad Celsius einwirken. Entfernen Sie den Fixansatz mithilfe einer 25-Milliliter-Pipette oder einer Spritze und waschen Sie die Gewebe einmal mit 30 Milliliter PBS.

Decken Sie die Schnitte anschließend mit 30 Milliliter DTTD-Verbindungslösung ab und inkubieren Sie 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Am Ende der Inkubation entfernen Sie die Entfettungslösung mit einer 25-Milliliter-Pipette oder Spritze und überspülen die Gewebe mit weiteren 30 Milliliter PBS. Anschließend entfernen Sie mit einer hinteren Pipette den Schleim zusammen mit dem PBS nach der Wäsche.

Ersetzen Sie das PBS durch 30 Milliliter Xal, um eine Übernachtfärbung bei Raumtemperatur im Dunkeln unter leichter Schüttelbewegung auf einer Schüttelplattform durchzuführen. Am nächsten Morgen: Wenn sich in den Schnitten eine blaugrüne Färbung entwickelt hat, ersetzen Sie das Xal durch 30 Milliliter PBS. Nach dreiminütiger leichter Schüttelbewegung stellen Sie Schweizerrollen wie gerade gezeigt her und geben das Gewebe in einen weithalsigen, flachbodigen Behälter, der mindestens das 10-fache Volumen eines geeigneten Fixativs im Vergleich zum Gewebevolumen enthält, und lagern es bei vier Grad Celsius mindestens 24 Stunden lang vor der Einbettung und dem Schneiden.

Unter Verwendung des bedingten ROSA 26 R Laxy-Reporters kann drei Tage nach der Induktion im Dünndarm eine 100%ige Rekombination beobachtet werden, wobei die DNA aus den rekombinierten Krypten extrahiert wurde. Die qPCR für die rekombinierten Allele zeigte einen statistisch nicht signifikanten Anstieg der Rekombination im VI-crease-System, was möglicherweise auf die nicht beobachtete Rekombination in Paneth-Zellen zurückzuführen ist. Unter Verwendung des ah-crease-Systems mit dem laxy-Reporter zeigten beide Systeme außerdem einen vollständigen Verlust rekombinierter Zellen drei Tage nach der Induktion.

Die Daten zur Mitose und zur zellulären Höhe in den Krypten zeigten, dass das ah H Cree-System vermutlich aufgrund einer Rekolonisierung durch nicht verbundene intestinale Stammzellen regenerieren konnte. Im deutlichen Gegensatz dazu war das villain Cree-System nicht in der Lage, sich zu regenerieren, obwohl epitheliale Kryptenzellen erhalten blieben. Außerdem waren die Kryptenzellen in den vi Cree Cantin B flocked Mäusen nicht proliferativ und wiesen keinen Ausdruck des Markers für intestinale Stammzellen auf.

EM vier. Im Gegensatz zu den Krypten in ah cre Mäusen unterzogen PTH-Zellen nach Caden-b-Deletion ähnlich wie diese nur innerhalb des VI-Cree-Systems einer Apoptose. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa 10 Minuten abgeschlossen werden.

Es ist wichtig, Verzögerungen zu minimieren, um eine Gewebezerstörung zu verhindern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Darm einer Maus für nachfolgende Analysen entnimmt.