Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Effizienz und Empfindlichkeit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie nach der Säulenderivatisierung (PCD-Methode) durch den Einsatz einer Reaktionsflusssäule zu verbessern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in Bereichen wie Pharmazie, Biomedizin und Umweltwissenschaften zu beantworten, in denen Verbindungen analysiert werden, die nur gering auf HPLC-Detektoren ansprechen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Reaktionsspulen benötigt werden.

Da das Mischen des Abwassers und des Derivatisierungsreagenzes in der Säule effizienter erfolgt als bei herkömmlichen Methoden. Diese Methode wurde verwendet, um Einblicke in Antioxidantien, Aminosäuren und Phenole zu erhalten. Es kann auch auf andere Klassenverbindungen wie Thiole, Metalle, Antibiotika und Toxine angewendet werden.

Obwohl nicht die gesamte Probe derivatisiert wird, ist die Konzentration des Analyten im Abwasserström aufgrund der geringeren Bandenverbreiterung höher als bei der herkömmlichen Nachsäulen-Derivatisierungsanalyse. Um dieses Verfahren zu starten, bereiten Sie das HPLC-Instrument mit 100 % Wasser auf Linie A und 100 % Methanol auf Linie B als mobile Phase vor und spülen Sie die Pumpen gemäß den Anforderungen des Herstellers. Richten Sie die instrumentellen HPLC-Komponenten und die zusätzliche Derivatisierungspumpe ein.

Stellen Sie anschließend den UV/VIS-Detektor so ein, dass er bei einer Wellenlänge von 520 Nanometern analysiert. Verbinden Sie den Einlass der Reaktionsstromsäule (RF) mit dem HPLC-Gerät. Verbinden Sie einen Ausgangsanschluss mit einem 15 Zentimeter langen Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,13 Millimetern an den UV/VIS-Detektor.

Schließen Sie als Nächstes die DPPH-Pumpenleitung an einen Peripherieanschluss am Ausgang der HF-Säule an. Blockieren Sie den nicht verwendeten Peripherieanschluss am Ausgang der HF-Säule mit einem Säulenstopper. Schließen Sie einen 15 Zentimeter langen Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,13 Millimetern an den zentralen Auslassanschluss der HF-Säule an.

Bringen Sie die Durchflussrate der HPLC-Pumpe auf einen Millimeter pro Minute bei 100 % Methanol. Dann äquilibrieren Sie die Säule 10 Minuten lang mit 100%Methanol. Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt eine Lösung von 0,1 Milligramm pro Milliliter DPPH und Methanol vor.

Der Kolben mit dem DPPH-Reagenz wird 10 Minuten lang beschallt. Spülen Sie die DPPH-Pumpe mit dem vorbereiteten DPPH-Reagenz gemäß den Anforderungen des Herstellers. Nehmen Sie anschließend zwei trockene und saubere Gefäße und beschriften Sie eines als zentral" und das andere als peripher"Wiegen Sie die beiden Gefäße genau.

Das Abwasser, das aus dem zentralen Anschluss austritt, wird eine Minute lang in das Gefäß mit der Aufschrift "Zentrale" eingefüllt. Berechnen Sie nach dem erneuten Wiegen des Behälters im zentralen Hafen das Gewicht des Durchflusses aus dem zentralen Hafen. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für das Abwasser, das das UV/VIS verlässt und an den Peripherieanschluss der HF-Säule angeschlossen ist.

Berechnen Sie das Gewicht für das periphere Hafenschiff. Berechnen Sie als Nächstes den Prozentsatz des Durchflusses, der von den zentralen und peripheren Anschlüssen kommt. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis das Durchflussverhältnis korrekt ist, und stellen Sie dann die Durchflussmenge der DPPH-Pumpe auf 0,5 Milliliter pro Minute ein.

Sobald der Lauf beendet ist, stoppen Sie den Durchfluss der Derivatisierungsreagenzpumpe. Entfernen Sie die DPPH-Reagenzpumpenleitung vom peripheren Anschluss und verschließen Sie den Anschluss. Die Säule wird mit der mobilen Phase, in der sie gelagert werden soll, äquilibriert, so dass die mobile Phase die Säule 10 Minuten lang mit einem Millimeter pro Minute passieren kann.

Stoppen Sie dann den Durchfluss der Blasenphasenpumpe am HPLC-Instrument. Ersetzen Sie abschließend das DPPH-Reagenz durch Methanol und spülen Sie die zusätzliche Pumpe. Hier sind zwei Chromatogramme einer Ristretto-Kaffeeprobe dargestellt, die mit einem DPPH-Radikal unter Verwendung konventioneller PKD- und RF-PCD-Instrumente derivatisiert wurde.

Die berechneten Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen für jede der Aminosäuren, die sowohl im RF-PCD-Modus als auch im konventionellen PCD-Modus analysiert wurden, sind hier aufgeführt. Hier ist ein Chromatogramm der vier Aminosäuren, die mit der konventionellen PCD-Methode, der RF-PCD-Methode analysiert wurden, und des nicht derivatisierten Stroms aus der RF-PCD-Methode dargestellt. Hier wird ein Vergleich der Signale dargestellt, die für die Peaks durch Glycin und Leucin sowohl mit der konventionellen PCD- als auch mit der RF-PCD-Methode erhalten wurden.

Hier wird ein Vergleich der Peakbreite des Tryptophan-Peaks bei der Analyse mit der konventionellen PCD-Methode, der RF-PCD-Methode und dem underivatisierten Strom aus der RF-PCD-Methode gezeigt. Eine Testprobe mit 21 Komponenten, die einige Komponenten enthielt, die eine Reaktion auf das Derivatisierungsschema zeigten, und andere, die dies nicht taten, wurden getrennt, derivatisiert und detektiert. Das gleiche Gemisch wurde ebenfalls abgetrennt und zum Vergleich underivatisiert detektiert.

Ein Vergleich der Peakform von para-Kresol, sowohl derivatisiert mit der RF-PCD-Säule als auch nicht derivatisiert, ist hier dargestellt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in der gleichen Zeit wie die herkömmliche Nachsäulen-Derivatisierungsanalyse eingerichtet werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, so nah wie möglich an den vorgeschriebenen Durchflussverhältnissen zu liegen.

Nach diesem Verfahren können andere Nachsäulenderivatisierungsreagenzien wie OPA, Ninhydrin oder Halogene verwendet werden, um andere Verbindungen zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine Reaktionsflusssäule einrichten und abstimmen.