Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Effizienz und Empfindlichkeit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Nachsäulenderivatisierung, oder PCD-Methode, durch die Verwendung einer Reaktions-Fluss-Säule zu verbessern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in Bereichen wie der pharmazeutischen, biomedizinischen und umweltwissenschaftlichen Forschung zu beantworten, in denen Verbindungen analysiert werden, die eine geringe Antwort auf HPLC-Detektoren zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass keine Reaktionswendeln benötigt werden.

Da die Vermischung des Säulenauslaufs mit Derivatisierungsmittel effizienter erfolgt als bei herkömmlichen Methoden. Diese Methode wurde genutzt, um Einblicke in Antioxidantien, Aminosäuren und Phenole zu gewinnen. Sie kann außerdem auf andere Stoffklassen angewendet werden, wie beispielsweise Thiole, Metalle, Antibiotika und Toxine.

Obwohl die gesamte Probe nicht derivatisiert wird, ist aufgrund einer geringeren Bandverbreiterung die Konzentration des Analyten im Eluatstrom höher als bei der herkömmlichen nachsäuligen Derivatisierungsanalyse. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie das HPLC-Gerät mit 100 % Wasser an Leitung A und 100 % Methanol an Leitung B als mobile Phase vor und spülen die Pumpen gemäß den Herstelleranforderungen. Richten Sie die HPLC-Gerätekomponenten sowie die zusätzliche Derivatisierungspumpe ein.

Stellen Sie danach den UV/VIS-Detektor auf die Analyse bei einer Wellenlänge von 520 Nanometern ein. Verbinden Sie den Eingang der Reaktionsdurchfluss- (RF-)Säule mit dem HPLC-Gerät. Verbinden Sie einen Ausgangsperipherieanschluss mit dem UV/VIS-Detektor unter Verwendung eines 15 Zentimeter langen Schlauchs mit einem Innendurchmesser von 0,13 Millimetern.

Verbinden Sie als Nächstes die DPPH-Pumpe mit einem seitlichen Anschluss am Auslass der RF-Säule. Verschließen Sie den ungenutzten seitlichen Anschluss am Auslass der RF-Säule mit einem Säulenstopfen. Schließen Sie ein 15 cm langes Stück Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,13 mm an den zentralen Auslassanschluss der RF-Säule an.

Stellen Sie die Flussrate der HPLC-Pumpe auf einen Millimeter pro Minute bei 100 % Methanol ein. Anschließend wird die Säule 10 Minuten lang mit 100 % Methanol equilibriert. Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt eine Lösung von 0,1 Milligramm pro Milliliter DPPH in Methanol vor.

Schwenken Sie den Kolben mit dem DPPH-Reagenz 10 Minuten lang. Spülen Sie die DPPH-Pumpe gemäß den Herstelleranforderungen mit dem hergestellten DPPH-Reagenz. Danach nehmen Sie zwei trockene und saubere Gefäße, beschriften das eine als „zentral“ und das andere als „peripher“ und wiegen beide Gefäße genau ab.

Sammeln Sie das aus dem zentralen Port austretende Filtrat eine Minute lang im als „central“ beschrifteten Gefäß. Nach dem erneuten Wägen des Gefäßes des zentralen Ports berechnen Sie die Masse des aus dem zentralen Port austretenden Flusses. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für das aus dem UV/VIS-Detektor austretende Filtrat, das an den peripheren Port der RF-Säule angeschlossen ist.

Berechnen Sie das Gewicht für das periphere Portgefäß. Berechnen Sie anschließend den prozentualen Anteil des Flusses aus den zentralen und peripheren Ports. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis das Strömungsverhältnis korrekt ist, und stellen Sie dann die Flussrate der DPPH-Pumpe auf 0,5 Milliliter pro Minute ein.

Wenn der Lauf beendet ist, stoppen Sie den Fluss der Derivatisierungsreagenzpumpe. Entfernen Sie die Leitung der DPPH-Reagenzpumpe aus dem peripheren Port und verschließen Sie den Port. Puffern Sie die Säule mit der mobilen Phase, in der sie gelagert werden soll, indem Sie die mobile Phase zehn Minuten lang mit einem Fluss von einem Milliliter pro Minute durch die Säule leiten.

Dann stoppen Sie den Fluss der Blasenphasenpumpe am HPLC-Gerät. Schließlich ersetzen Sie das DPPH-Reagenz durch Methanol und spülen die zusätzliche Pumpe durch. Hier sind zwei Chromatogramme einer Ristretto-Kaffeeprobe dargestellt, die mit einem DPPH-Radikal derivatisiert wurden, jeweils unter Verwendung konventioneller PCD- und RF-PCD-Instrumentierung.

Die berechneten Quantifizierungsgrenzen und Nachweisgrenzen für jede der analysierten Aminosäuren in den beiden Modi RF-PCD und konventionelle PCD sind hier aufgeführt. Ein Chromatogramm der vier Aminosäuren, die mit der konventionellen PCD-Methode, der RF-PCD-Methode und dem nicht derivatisierten Strom aus der RF-PCD-Methode analysiert wurden, ist hier dargestellt. Ein Vergleich der Signale für die Peaks von Glycin und Leucin, ermittelt mit den Methoden der konventionellen PCD und RF-PCD, wird hier gezeigt.

Ein Vergleich der Peakbreite des Tryptophan-Peaks bei der Analyse mit der herkömmlichen PCD-Methode, der RF-PCD-Methode und dem nicht derivatisierten Strom aus der RF-PCD-Methode wird hier gezeigt. Eine 21-Komponenten-Testprobe, die einige Komponenten enthielt, die auf das Derivatisierungsschema reagieren, und einige, die dies nicht tun, wurde getrennt, derivatisiert und detektiert. Dieselbe Mischung wurde außerdem getrennt und ohne Derivatisierung zum Vergleich detektiert.

Ein Vergleich der Peakform von p-Kresol, sowohl derivatisiert mit der RF-PCD-Säule als auch underivatisiert, wird hier gezeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in der gleichen Zeit wie eine konventionelle Nachsäulenderivatisierungsanalyse eingerichtet werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, so nahe wie möglich an den vorgeschriebenen Flussratenverhältnissen zu bleiben.

Nach diesem Verfahren können andere Reagenzien zur post-column-Derivatisierung, wie OPA, Ninhydrin oder Halogene, verwendet werden, um andere Verbindungen zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man eine Reaktionsfluss-Säule aufbaut und optimiert.